Test podrażnienia skóry in vitro (SIT) z wykorzystaniem modelu zrekonstruowanej ludzkiej naskórka (RHE) EpiDerm

Epiderm to normalny ludzki model zrekonstruowanej in vitro naskórka, opracowany przez Matt Tech Corporation. Zwalidowany protokół testu podrażnienia skóry Epiderm EC VM zastępuje tradycyjne badania na zwierzętach w przypadku produktów takich jak kosmetyki, surowce i środki przemysłowe, które będą miały kontakt z ludzką skórą. Test rozpoczyna się w dniu zerowym, gdy zestaw do badania podrażnienia skóry i tkanka Epiderm zostaną dostarczone do laboratorium, a następnie poddane wstępnemu przygotowaniu w medium analitycznym po inkubacji przez noc.

Pierwszego dnia nietypowa powierzchnia tkanki naskórka jest eksponowana przez jedną godzinę na domniemany związek drażniący, a następnie drugiego dnia substancja drażniąca jest usuwana w kroku płukania. Po 24-godzinnej inkubacji wkład kulturacyjny umieszcza się w świeżej pożywce, a starą pożywkę można wykorzystać do analizy uwolnionych cytokin i chemokin. Tkanka reaguje ze związkiem znanym jako MTT, który jest przekształcany przez reduktazę mitochondrialną w ciemnofioletową sól formazanu.

Umożliwia odczyt żywotności komórek. Brak ciemnofioletowego koloru w próbce wskazuje na obniżoną żywotność. Jeśli kolorymetryczny odczyt dla badanego związku wynosi mniej niż 50% w stosunku do kontroli negatywnych, badany związek można zaklasyfikować jako drażniący.

Witam, nazywam się Helena Kava z Matt Corporation. Dzisiaj przedstawimy procedurę badania podrażnienia skóry in vitro z wykorzystaniem zrekonstruowanego modelu ludzkiej skóry epiderm. Procedura ta, w zależności od wymogów regulacyjnych, może być stosowana jako całkowity lub częściowy zamiennik testu szybkiego podrażnienia skóry in vivo.

Ta nowa procedura in vitro może być wykorzystywana do identyfikacji zagrożeń oraz etykietowania chemikaliów i surowców kosmetycznych. Przejdźmy zatem do realizacji. Epiderm powstaje z hodowli ludzkich keratynocytów naskórka w celu stworzenia trójwymiarowego, wielowarstwowego i silnie zróżnicowanego modelu ludzkiego naskórka.

Tkanki te są aktywne mitotycznie i metabolicznie, ściśle naśladują swoje odpowiedniki in vivo zarówno pod względem strukturalnym, jak i biochemicznym, zapewniając przy tym powtarzalność, taką jak w przypadku ludzkiego naskórka. Epiderm składa się z uporządkowanych warstw podstawnej, kolczystej i ziarnistej oraz wielowarstwowego stratum corneum. Ta ostatnia zawiera międzykomórkowe warstwy lipidowe lam Miller ułożone w wzory analogiczne do tych występujących in vivo.

Tkanki te są hodowane w medium bezsurowiczym. Każda tkanka rośnie w oddzielnym wkładzie do hodowli komórkowej. Dostępne są inne konfiguracje, w tym format wysokoprzepustowy 96-dołkowy.

Produkcja tkanki trwa około trzech tygodni; w określonym punkcie tego procesu tkanka zostaje wystawiona na granicę faz powietrze-ciecz, a cała ciecz zostaje usunięta z powierzchni apikalnej tkanki. Tkanki są odżywiane wyłącznie przez powierzchnię basolateralną, która pozostaje w kontakcie z zastrzeżonym medium hodowlanym firmy mat tech. Typowy zestaw Epiderm zawiera 24 tkanki, z których każda ma dziewięć milimetrów średnicy i znajduje się we własnym wkładzie do hodowli tkankowej, a także wystarczającą ilość medium testowego do przeprowadzenia tego testu drażnienia skóry.

24 wkłady są stabilnie osadzone na medium w postaci żelu różanego AGA, z jedną tkanką w każdej studni standardowej płytki 24-dołkowej; transport odbywa się kurierem w ciągu jednej nocy w temperaturze od 3 do 4 °C przed rozpoczęciem testowania substancji chemicznych. Korzystając z systemu testowego EPIDERM, należy przygotować i wysterylizować wszystkie instrumenty i narzędzia wykorzystywane w analizie zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Część materiałów, takich jak patyczki bawełniane, powinna być dostarczona w sterylnych opakowaniach lub poddana autoklawowaniu.

Do sterylizacji narzędzi, takich jak pęsety, należy użyć 70% etanolu, natomiast do sterylizacji butelek myjących należy zastosować naświetlanie promieniami UV lub gamma. Dwiema kluczowymi roztworami przygotowanymi przed analizą powinny być DPBS oraz 5% roztwór SDS. W wodzie destylowanej do analizy z wykorzystaniem jednego zestawu zawierającego 24 próbki tkanek naskórka zostanie użyte około dwa litrów sterylnego DPBS o pH 7.

Sterylny DPBS służy jako kontrola negatywna oraz roztwór do płukania. Należy przygotować 5% SDS i użyć go jako kontroli pozytywnej. Test drażnienia skóry rozpoczyna się po otrzymaniu zestawu EPIDERM EPI 200 SIT.

Należy sprawdzić kompletność i stan wszystkich komponentów zestawu; w przypadku jakichkolwiek zastrzeżeń należy niezwłocznie skontaktować się z firmą Mat Tech. Jeśli wszystko jest w porządku, można przejść do następnego kroku. Przed rozpoczęciem testu należy doprowadzić dostarczone w zestawie podłoże do analizy do temperatury pokojowej. Nie należy go podgrzewać w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.

Przygotuj jedną sterylną płytkę 6-dołkową na każde trzy wkłady z tkanką naskórkową i pipetuj 0,9 ml medium analitycznego do każdego dołka w warunkach sterylnych. Otwórz plastikową torebkę zawierającą płytkę 24-dołkową z tkankami naskórkowymi w sterylnym przepływie powietrza. Usuń sterylną gazę i za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie wyjmij każdy wkład zawierający tkankę naskórkową.

Usunąć pozostałości agarosu przylegające do zewnętrznych ścianek wkładu, delikatnie osuszając je sterylną gazą lub papierem filtracyjnym. Następnie, w ciągu kolejnych pięciu minut, umieścić tkanki w pustej, sterylnej płytce 24-dołkowej. Dokonać wizualnej inspekcji wkładów.

Odnotuj wszelkie defekty tkanki oraz nadmiar wilgoci na powierzchni. Nie należy używać tkanek z defektami lub tkanek całkowicie pokrytych cieczą.

Optymalne wstawki tkankowe. Powinny mieć suchą powierzchnię i być wolne od odwarstwień, nierówności lub nadmiaru cieczy na powierzchni. Następnie, używając sterylnego patyczka z bawełnianą końcówką, ostrożnie osusz powierzchnię tkanek.

Staraj się nie dotykać tkanek bezpośrednio. Po osuszeniu powierzchni efekty kapilarne są wystarczające do usunięcia z niej wilgoci. Przenieś trzy tkanki do górnego rzędu z każdego zestawu sześciu.

Płytka wielodołkowa wypełniona uprzednio 0,9 ml medium do analizy. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod wkładkami. Następnie umieścić sześć płytek wielodołkowych z wkładkami w inkubatorze na jedną godzinę.

Preinkubacja w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu pierwszego okresu preinkubacji przenieś wkłady z górnych do dolnych dołków płytki 6-dołkowej. Umieść płytki ponownie w inkubatorze w celu przeprowadzenia nocnej preinkubacji.

Pozostałą część medium analitycznego należy umieścić w lodówce. Po nocnej preinkubacji można przystąpić do aplikacji substancji testowych na wkłady z tkanką naskórka. Przed rozpoczęciem testu ekspozycji chemicznej wszystkie niezbędne urządzenia, roztwory i substancje testowe należy doprowadzić do temperatury pokojowej.

W komorze z laminarnym przepływem powietrza przetrzyj wszystkie butelki z materiałami nieszterylnymi 70% etanolem przed umieszczeniem ich wewnątrz komory. Sterylny DPBS (kontrolę negatywną), kontrolę pozytywną, 5% SDS oraz wodę destylowaną należy również umieścić w komorze w temperaturze pokojowej. Odstaw osobną dużą fiolkę na odpady.

Przygotuj jedną płytkę 6-dołkową dla każdego związku chemicznego, napełniając jedynie górny rząd 0,9 ml medium do analizy na każdy dołek. Oznacz każdą płytkę numerem tkanki oraz nazwą związku chemicznego.

Około pięciu minut przed planowaną ekspozycją na chemikalia wyjmij z inkubatora płytki sześciodołkowe zawierające tkanki poddane wstępnemu przygotowaniu. Następnie dokonaj oceny wizualnej powierzchni tkanek.

Usuń wszelką wilgoć za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych, nie naciskając powierzchni tkanki. Na koniec opisz pokrywki płytki 6-dołkowej kodami lub nazwami badanych materiałów. W jednej serii testów nie badaj więcej niż sześciu substancji chemicznych, wliczając w to kontrole negatywną i pozytywną, z czego każda powinna być wykonana w trzech powtórzeniach.

W przypadku obsługi znanych substancji testowych stosuj jedną minutę przerwy na aplikację odczynnika i przemycie. W przypadku próbek zakodowanych lub nieznanych postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w karcie charakterystyki materiału (MSDS). Przestrzegaj zasad bezpieczeństwa chemicznego i korzystaj z komory z wentylacją.

Należy założyć rękawiczki oraz chronić oczy i twarz. Tkanki poddawane dawkowaniu chemikaliów należy traktować w odstępach jednominutowych, aby ułatwić płukanie substancji testowych po ekspozycji; płytki z tkankami poddawanymi dawkowaniu należy przechowywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza aż do momentu podania dawki do ostatniej tkanki. Przez cały czas trwania procedury do manipulowania tkankami i związkami testowymi należy używać pipety z zakończeniem w kształcie żarówki. Do uformowania końcówki w kształcie żarówki do podawania ciekłych chemikaliów można wykorzystać płomień palnika Bunsena.

Nanieś 30 µL ciekłego badanego związku bezpośrednio na tkankę i natychmiast uruchom stoper, aby odliczał czas w górę. Połóż siatkę nylonową na powierzchni tkanki. Gdy stoper osiągnie jedną minutę, dodaj drugi związek ciekły. Użyj trzech tkanek na każdą substancję chemiczną, pamiętając o dodawaniu każdego związku w odstępach jednominutowych.

Do badania substancji półstałych należy użyć pipety o wyporze dodatnim, aby nanieść 30 µL bezpośrednio na tkankę. W razie potrzeby należy rozprowadzić odczynnik za pomocą pipety Pasteura, aby dopasować go do powierzchni tkanki. Krótko przed aplikacją substancji stałej należy zwilżyć powierzchnię tkanki 25 µL sterylnego DPBS w celu poprawy kontaktu powierzchni tkanki z badanym związkiem, a następnie napełnić 25 mg łyżeczkę aplikacyjną drobno zmielonym materiałem testowym.

Nanieś stały odczynnik testowy na powierzchnię tkanki. W razie potrzeby użyj sterylnego końcówki typu bulb do pipety, aby całkowicie opróżnić łyżeczkę. Delikatnie potrząśnij wkładami, aby poprawić rozprowadzenie substancji stałej na powierzchni.

Można również użyć końcówki typu bulb, dopasowanej do rozmiaru tkanki. Nie należy naciskać powierzchni tkanki. Na koniec, w trzech powtórzeniach, do wkładów tkankowych należy dodać DPBS jako kontrolę negatywną oraz 5% SDS jako kontrolę pozytywną; po podaniu preparatu do ostatniej tkanki wszystkie płytki należy przenieść na 35 ± 1 minut do inkubatora z nawilżeniem w temperaturze 37 °C.

Podczas tej inkubacji należy umieścić w dygestorium wszystkie materiały niezbędne do etapów płukania. Po 35-minutowej inkubacji wyjmij wszystkie płytki z inkubatora. Umieść je w sterylnym dygestorium i odczekaj do zakończenia 60-minutowego okresu ekspozycji chemicznej dla tkanek z pierwszej dawki.

Następnie rozpocznij procedurę płukania. Przepłucz tkanki sterylnym DPBS 15 razy. Aby usunąć resztki materiału testowego, napełnij wkład z tkanką, używając stałego strumienia DPBS podawanego w odległości 1,5 centymetra od powierzchni tkanki, a następnie go opróżnij.

Upewnij się, że strumień DPBS nie jest zbyt słaby, w przeciwnym razie substancja testowa nie zostanie usunięta. Pamiętaj o zachowaniu jednominutowego odstępu czasu podczas pięciokrotnego przemywania czterech tkanek przez nylonową siatkę, a następnie ostrożnie usuń siatkę za pomocą ostrych pęsety z zakrzywionym końcem. Następnie kontynuuj pozostałe 10 płukań; po piętnastym razie przemyj wkład trzy razy, zanurzając go całkowicie w butelce z roztworem, używając 150 mililitrów DPBS, i wstrząśnij, aby usunąć resztki materiału testowego.

Na koniec opłucz tkankę. Przelej sterylnym DPBS raz od wewnątrz i raz od zewnątrz. Usuń nadmiar DPBS z tkanki, delikatnie potrząsając wkładem i osuszając go na sterylnym papierze absorbującym.

Następnie przenieś osuszone wkłady z tkanką do nowej płytki sześciodołkowej, która została wcześniej napełniona medium do analizy. Ponownie pamiętaj, że wszystkie te kroki muszą zostać wykonane w odstępie jednej minuty, aby zachować czas ekspozycji wynoszący 60 minut dla każdej próbki. Po opłukaniu ostatniej tkanki ostrożnie osusz powierzchnię każdej z nich za pomocą sterylnego patyczka z bawełnianym końcem.

Jeśli na powierzchni wciąż znajdują się ślady substancji chemicznej, należy spróbować usunąć je za pomocą sterylnego patyczka z watą. Na koniec inkubuj tkanki w inkubatorze przez kolejne 24 godziny. Zapisz czas rozpoczęcia inkubacji w arkuszu dokumentacji metody.

Zarejestruj również wszystkie różne zastosowania w arkuszu dokumentacji metody. Aneks do standardowej procedury operacyjnej dostarczonej przez Mat Tech Corporation dotyczącej przenoszenia płytek w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przenieś wkład do dolnej części płytki sześciodołkowej wypełnionej wcześniej 0,9 ml medium.

Zebrać pożywkę z górnego rzędu i przenieść ją do wcześniej oznakowanej płytki 24-dołkowej, którą następnie należy umieścić w temperaturze -20 °C. Do czasu przeprowadzenia analizy, analiza cytokin i/lub chemokin wydzielonych do pożywki hodowlanej jest krokiem opcjonalnym. Kontynuować inkubację przez kolejne 18 ± 3 godzin; przed przeprowadzeniem testu MTT oznakować dwie płytki 24-dołkowe nazwami chemicznymi lub kodami.

Pamiętaj, że MTT jest toksyczne, dlatego podczas pracy należy bezwzględnie używać rękawic ochronnych. Przygotuj roztwór MTT poprzez rozmrożenie koncentratu MTT i rozcieńczenie go odpowiednim rozcieńczalnikiem MTT.

Chronić przed światłem, ponieważ MTT jest światłoczułe, i zużyć w ciągu dwóch do trzech godzin. Ponieważ MTT ulega degradacji z czasem, nalać do każdej studzienki płytki 24-dołkowej 300 µL pożywki z MTT. Następnie wyjąć płytki 6-dołkowe z inkubatora.

Osusz spód wkładów na papierze filtracyjnym, a następnie przenieś je do płytki 24-dołkowej wypełnionej uprzednio MTT. Umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze i inkubuj przez trzy godziny. Należy pamiętać o zapisaniu godziny rozpoczęcia inkubacji z MTT w MDS oraz ściśle przestrzegać trzygodzinnego czasu inkubacji, aby uniknąć rozbieżności w odczytach MTT. Po zakończeniu inkubacji z MTT użyj pompy ssącej z pułapką na odpady toksyczne, aby delikatnie odessać medium z MTT ze wszystkich dołków.

Napełnij studzienki DPBS, a następnie odessij zawartość. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy i upewnij się, że tkanki są suche po ostatnim odessaniu. Po przemyciu przenieś wkłady do nowej płytki 24-dołkowej i zanurz je, delikatnie pipetując 2 ml roztworu do ekstrakcji do każdego wkładu.

Poziom cieczy podniesie się powyżej górnych krawędzi wkładki, całkowicie pokrywając tkanki z obu stron. Uszczelnij płytkę 24-dołkową za pomocą zgrzewarki termicznej lub paraflemu, aby zapobiec wyciekowi ekstraktu i parowaniu. Zapisz czas rozpoczęcia ekstrakcji w arkuszu dokumentacji metod i pozostaw do ekstrakcji na co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce do płytek. Po zakończeniu okresu ekstrakcji przebij wkładki igłą wstrzykikującą lub końcówką pipety i pozwól ekstraktowi spłynąć do dołka, z którego wyjęto wkładkę.

Wyrzuć przebite wkłady i pipetuj roztwór w studzience w górę i w dół trzy razy, aż stanie się homogeniczny. W przypadku każdej tkanki można również zastosować wstrząsarkę do płytek ustawioną na 120 RPMs. Przenieś dwie 200 µL alikwoty niebieskiej formy i roztworu do 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem.

Przenieś duplikaty zgodnie z ustalonym schematem płytki podanym w arkuszu dołączonym do tego protokołu wideo dla próbek ślepych. Użyj izopropanolu, odczytaj gęstość optyczną (OD) za pomocą spektrofotometru do płytek 96-dołkowych przy długości fali 570 nanometrów, nie stosując filtra referencyjnego. Wprowadź wyniki do arkusza w celu automatycznego obliczenia rezultatów.

Należy uwzględnić korekty wynikające z interferencji substancji testowej, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole; substancja testowa zostaje określona jako substancja drażniąca, jeśli procent żywotności tkanki po analizie spektrofotometrycznej jest równy lub mniejszy od 50%, wartość OD 570 dla tkanek NC jest większa lub równa 1 i mniejsza lub równa 2,5, a średnia żywotność tkanek PC, wyrażona jako procent tkanek kontroli negatywnej, wynosi mniej niż 20%, oraz SD obliczone z indywidualnych procentowych wartości żywotności tkanek trzech identycznie traktowanych powtórzeń jest mniejsze niż 18%. Związki dające wartości żywotności komórek poniżej 50% mogą być uznane za substancje drażniące.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia zwalidowanego testu drażniącego dla skóry w wariancie 60 minut i 42 godzin z wykorzystaniem zrekonstruowanego modelu ludzkiej skóry Epiderm. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że główna część badania jest przeprowadzana w warunkach sterylnych lub aseptycznych. W przypadku potrzeby modyfikacji metody lub potrzeby uzyskania dokładniejszych wyjaśnień któregokolwiek z etapów procedury, prosimy o kontakt w celu uzyskania pomocy i porad.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.