Name: Test podrażnienia skóry in vitro (SIT) z wykorzystaniem modelu EpiDerm Rekonstruowanego Naskórka Ludzkiego (RHE) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: Poznaj metodę EpiDerm SIT do oceny podrażnienia skóry in vitro z wykorzystaniem rekonstruowanego naskórka ludzkiego. Ta technika zastępuje testy na zwierzętach i zapewnia niezawodne wyniki w badaniach toksykologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować ZEBET w BfR (Niemcy), BASF SE (Niemcy), IIVS Inc. (USA) oraz Zet-LSL (Austria) za udział w wieloośrodkowej międzynarodowej analizie walidacyjnej zmodyfikowanego testu EpiDerm SIT (5).

I. Kondycjonowanie tkanki – Dzień 0
 <ol>
 <li>Po otrzymaniu zestawu EpiDerm EPI-200-SIT należy sprawdzić kompletność i stan wszystkich komponentów (szczegóły zestawu znajdują się w tabeli konkretnych odczynników i sprzętu). </li>
 <li>Na każde trzy tkanki EpiDerm należy przygotować jedną sterylną płytkę 6-dołkową wypełnioną uprzednio 0,9 ml medium analitycznego. </li>
 <li>W warunkach sterylnych należy otworzyć plastikową torebkę zawierającą płytkę 24-dołkową z tkankami EpiDerm i usunąć sterylną gazę. </li>
 <li>Za pomocą sterylnej pęsety należy wyjąć każdy insert zawierający tkankę EpiDerm i umieścić go w pustej płytce 24-dołkowej. Na tym etapie należy usunąć pozostały agar transportowy przylegający do zewnętrznych ścian insertu, delikatnie osuszając go sterylnym papierem filtracyjnym.</li>
 <li>W ciągu następnych 5 minut należy dokonać wizualnej oceny tkanek. Nie należy używać tkanek uszkodzonych lub całkowicie zalanych cieczą. </li>
 <li>Używając sterylnego patyczka bawełnianego, należy ostrożnie osuszyć powierzchnię tkanek. Należy starać się nie dotykać tkanki bezpośrednio – zjawiska kapilarne są wystarczające do usunięcia wilgoci z powierzchni tkanki. </li>
 <li>Po osuszeniu powierzchni tkanek należy przenieść trzy tkanki do górnego rzędu płytek 6-dołkowych wypełnionych uprzednio 0,9 mL medium analitycznego. Należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod insertami. </li>
 <li>Płytki 6-dołkowe z insertami należy umieścić w inkubatorze na 60 ± 5 min preinkubacji w temperaturze 37 ± 1° C, przy 5 ± 1% CO2 i 95 % RH (wilgotności względnej).</li>
 <li>Po zakończeniu 60 ± 5 min preinkubacji należy przenieść inserty z górnych do dolnych dołków płytki 6-dołkowej. Płytki należy ponownie umieścić w inkubatorze (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO2, 95 % RH) na nocną preinkubację (18 ± 3 hr).</li>
 <li>Pozostałą część medium analitycznego należy umieścić w lodówce (5 ± 3 °C). Po nocnej preinkubacji można przystąpić do aplikacji badanych substancji chemicznych na tkanki EpiDerm.
 Uwaga: Procedurę preinkubacji można skrócić w przypadku późnej dostawy tkanek (np. jeśli tkanki dotrą w środę zamiast we wtorek). 
</li>
 </ol>
 II. Ekspozycja chemiczna – Dzień 1
 <ol>
 <li>Przygotować jedną płytkę 6-dołkową na każdą substancję testową, wypełniając tylko górny rząd dawką 0,9 ml pożywki analitycznej na każdy dołek.</li>
 <li>Na około 5 minut przed planowaną ekspozycją na substancje chemiczne wyjąć z inkubatora płytki 6-dołkowe zawierające uprzednio kondycjonowane tkanki.</li>
 <li>Ocenić powierzchnię tkanek i usunąć nadmiar wilgoci za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych.</li>
 <li>Oznaczyć wszystkie pokrywki płytek 6-dołkowych kodami lub nazwami materiałów testowych.</li>
 <li>Dawkować substancje testowe na tkanki w odstępach 1-minutowych, aby ułatwić ich późniejsze wypłukiwanie po ekspozycji. Przechowywać płytki z dawką substancji w komorze sterylnej do momentu podania dawki na ostatnią tkankę.</li>
 <li>W przypadku badania substancji ciekłych nanieść 30 μL roztworu bezpośrednio na tkankę, a następnie nałożyć na jej powierzchnię siatkę nylonową. W razie potrzeby delikatnie ułożyć siatkę za pomocą szklanej pipety Pasteura z gruszką. Nie uciskać powierzchni tkanki.</li>
 <li>W przypadku badania substancji półstałych użyć pipety z tłokiem przemieszczającym, aby nanieść 30 μL bezpośrednio na tkankę. Jeśli to konieczne, rozprowadzić substancję pipetą Pasteura tak, aby objąć jak największą powierzchnię tkanki.</li>
 <li>W przypadku materiałów stałych, krótko przed aplikacją substancji testowej, nawilżyć powierzchnię tkanki 25 μL sterylnego DPBS, co poprawi kontakt tkanki z substancją. Napełnić skalibrowaną łyżeczkę aplikacyjną o ostrych krawędziach (lub inne odpowiednie narzędzie) o pojemności 25 mg około 25 mg drobno zmielonego materiału testowego. Nanieść stałą substancję testową na powierzchnię tkanki. W razie potrzeby użyć pipety Pasteura z gruszką, aby całkowicie opróżnić łyżeczkę. Delikatnie potrząsać insertami, aby poprawić rozprowadzenie materiału stałego na powierzchni.</li>
 <li>W przypadku substancji o konsystencji woskowej przygotować płaski kawałek o średnicy około 8 mm i umieścić go na tkance uprzednio zwilżonej sterylnym DPBS. Aby poprawić kontakt między substancją a tkanką, dociążyć kawałek za pomocą przyrządu ze stali nierdzewnej lub tworzywa sztucznego.</li>
 <li>Na tkanki kontrolne nanieść DPBS jako kontrolę negatywną oraz 5% SDS jako kontrolę pozytywną.</li>
 <li>Po dawkowaniu ostatniej tkanki przenieść wszystkie płytki na 35 ± 1 minuty do inkubatora z nawilżeniem (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO2, 95 % RH).</li>
 <li>Po inkubacji przez 35 ± 1 minut w temperaturze 37°C wyjąć wszystkie płytki z inkubatora. Umieścić płytki w komorze sterylnej i odczekać, aż upłynie 60 minut czasu ekspozycji dla pierwszej dawkowanej tkanki.</li>
 <li>Następnie rozpocząć procedurę płukania, przetwarzając jeden insert na minutę (aby zapewnić 60-minutowy całkowity czas ekspozycji dla każdego insertu).</li>
 <li>Użyć butelki z myjką do płukania tkanek sterylnym DPBS. Wypełnić insert z tkanką 15 razy, stosując stały strumień DPBS, a następnie go opróżnić (Uwaga: w przypadku tkanek z siatką nylonową opłukać powierzchnię tkanki 5 razy i ostrożnie usunąć siatkę za pomocą ostrych pęsety; następnie kontynuować pozostałe 10 płukań).</li>
 <li>Po 15-stym płukaniu z użyciem butelki z myjką, zanurzyć insert całkowicie 3 razy w 150 ml DPBS i potrząsać, aby usunąć pozostałości materiału testowego.</li>
 <li>Na koniec opłukać insert z tkanką raz od wewnątrz i raz od zewnątrz sterylnym DPBS.</li>
 <li>Usunąć nadmiar DPBS z tkanki poprzez delikatne potrząśnięcie insertem i osuszenie go sterylnym papierem osuszającym.</li>
 <li>Przenieść osuszone inserty z tkankami do nowej płytki 6-dołkowej uprzednio wypełnionej pożywką analityczną. Wszystkie te kroki (14-18) muszą zostać wykonane w ciągu 1 minuty dla każdego insertu.</li>
 <li>Po wypłukaniu ostatniej tkanki ostrożnie osuszyć powierzchnię każdej tkanki sterylnym patyczkiem bawełnianym.</li>
 <li>Inkubować tkanki w inkubatorze przez kolejne 24 ± 2 godziny (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO2, 95 % RH).
 Uwaga: Każdy technik analityczny nie powinien badać więcej niż 6 substancji testowych, wliczając kontrolę negatywną i pozytywną, w jednej serii badawczej (zestawie), aby być w stanie postępować zgodnie z poniższym protokołem</li>
</ol>
III. Wymiana pożywki – Dzień 2
 <ol>
 <li>Po 24 ± 2 godzinach poinkubacji przenieść inserty do dolnej części płytki 6-dołkowej, uprzednio wypełnionej 0,9 ml pożywki. Pożywkę z górnych rzędów można zebrać do analizy dodatkowych punktów końcowych (cytokin, chemokin itp.). Analiza wtórnych punktów końcowych jest opcjonalna.</li>
 <li>Kontynuować poinkubację (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO2, 95 % RH) przez kolejne 18 ± 3 godzin.</li>
 </ol>
IV. Test żywotności MTT - Dzień 3
 <ol>
 <li>Oznakuj dwie płytki 24-dołkowe nazwami chemicznymi lub kodami. Jedna płytka posłuży do inkubacji tkanki z MTT, a druga do etapu ekstrakcji.</li>
 <li>Przygotuj roztwór MTT poprzez rozmrożenie koncentratu MTT (5 mg/ml) i rozcieńczenie go rozcieńczalnikiem do MTT. Końcowe stężenie roztworu MTT wynosi 1 mg/ml. </li>
 <li>Pipetuj 300 μL roztworu MTT do każdego dołka płytki 24-dołkowej.</li>
 <li>Wyjmij płytki 6-dołkowe z inkubatora, osusz spód insertów na papierze filtracyjnym i przenieś je do płytki 24-dołkowej uprzednio wypełnionej MTT.</li>
 <li>Umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze (37 ± 1° C, 5 ± 1% CO2, 95 % RH) i inkubuj przez 3 godziny ± 5 min. Ściśle przestrzegaj czasu inkubacji 3 godziny ± 5 min, aby uniknąć rozbieżności między różnymi odczytami MTT. </li>
 <li>Po zakończeniu inkubacji z MTT użyj pompy ssącej, aby delikatnie odessać medium MTT ze wszystkich dołków. </li>
 <li>Wypełnij ponownie dołki DPBS i odessaj ponownie. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy i upewnij się, że tkanki są suche po ostatnim odessaniu. </li>
 <li>Po płukaniu przenieś inserty do nowej płytki 24-dołkowej. Zanurz inserty, delikatnie pipetując 2 mL roztworu ekstrahującego (izopropanolu) do każdego insertu. Poziom cieczy podniesie się powyżej górnych krawędzi insertu, całkowicie zanurzając tkanki. </li>
 <li>Uszczelnij płytkę 24-dołkową (np. Parafilmem lub za pomocą worka uszczelniającego), aby zapobiec odparowaniu ekstrahentu. Ekstrahuj MTT z tkanek przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu na wytrząsarce do płytek (~ 120 rpm). Można również zastosować ekstrakcję nocną bez wstrząsania. </li>
 <li>Po zakończeniu czasu ekstrakcji przebij inserty igłą wstrzykiwalniczą lub pipetą Pasteura z gruszką i pozwól ekstraktowi spłynąć do dołka, z którego wyjęto insert.</li>
 <li>Usuń przebity insert i pipetuj roztwór w dołku w górę i w dół trzy razy, aż stanie się jednorodny. </li>
 <li>Dla każdej tkanki przenieś dwie alikwoty po 200 μL fioletowego roztworu formazanu do 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej z płaskim dnem. Przenieś duplikaty zgodnie z ustalonym schematem płytki podanym w arkuszu towarzyszącym temu protokołowi wideo. Jako próbki ślepe wykorzystaj izopropanol. </li>
 <li>Odczytaj gęstość optyczną (OD) ekstraktów MTT w spektrofotometrze do płytek 96-dołkowych przy użyciu długości fali 570 nm (540-580) bez filtra referencyjnego.</li>
 <li>Wprowadź wyniki do arkusza w celu automatycznego obliczenia wyników (Rysunek 1). </li>
 <li>Substancję chemiczną testowaną uznaje się za „drażniącą” (R38 lub kategoria 2 GHS), jeśli procent żywotności tkanki wyznaczony testem MTT wynosi &lt;50% w stosunku do kontroli negatywnej. 
 Uwaga: MTT jest toksyczne, dlatego podczas pracy należy używać rękawic ochronnych. Chronić MTT i jego roztwory przed światłem, ponieważ MTT jest światłoczułe. Roztworu MTT należy użyć w ciągu kilku godzin od przygotowania, ponieważ z czasem ulega on degradacji.</li></ol>
 V. Kontrola jakości testu
<ul>
<li> Kryteria akceptacji zestawu EpiDerm EPI-200-SIT: 
Modele RHE in vitro powinny dostarczać spójnych, wysokiej jakości danych w czasie, a nie tylko podczas procesu walidacji (8). Zalecane wytyczne mające na celu zapewnienie długoterminowej powtarzalności i wydajności testu obejmują „pełną charakterystykę komórek lub tkanek, próbkowanie każdej partii... pod kątem wydajności oraz regularne stosowanie kontroli i substancji wzorcowych w celu zapewnienia spójności wyników testu” (9). Oprócz opisanych poniżej kryteriów akceptacji testu, każda partia produkcyjna EpiDerm jest poddawana kontroli jakości przez producenta przy użyciu dodatkowej substancji wzorcowej (1% Triton X-100). Wyznaczany jest czas ekspozycji niezbędny do redukcji żywotności tkanki do 50% (ET-50) dla Triton X-100. Dla EpiDerm średnie roczne wartości ET-50 mieściły się w zakresie od 5,9 hrs do 7,5 hrs. Współczynnik zmienności (CV) między partiami dla tkanek kontroli negatywnej (tj. zmienność podstawowej żywotności) średnio wynosiła poniżej 7,5% w każdym roku od 1996 roku. Wartość ET-50 każdej partii produkcyjnej musi mieścić się w granicach 2 odchyleń standardowych od historycznej średniej ET-50 dla Triton X-100 ustalonej w 1996 roku (tj. ET-50 = 6,7 hours; dolna granica akceptacji = 4,8h; górna granica akceptacji = 8,7h), aby partia mogła zostać dopuszczona do użytku przez producenta.</li>
<li>Kryterium akceptacji testu EPI-200-SIT 1: Kontrola negatywna: 
Bezwzględna wartość OD tkanek kontroli negatywnej (NC) (traktowanych sterylnym DPBS) w teście MTT jest wskaźnikiem żywotności tkanki uzyskanej w laboratorium badawczym po procedurach wysyłki i przechowywania oraz w określonych warunkach użytkowania. Test spełnia kryterium akceptacji, jeśli średnia wartość OD570 tkanek NC wynosi ≥1,0 i ≤2,5.</li>
<li>Kryterium akceptacji testu EPI-200-SIT 2: Kontrola pozytywna 
Jako kontrolę pozytywną (PC) stosuje się 5% roztwór SDS (w H2O), który jest testowany równolegle z badany chemikaliami. Równolegle oznacza, że PC musi być testowana w każdym badaniu, jednak w ciągu jednego dnia testowego wymagana jest nie więcej niż jedna kontrola PC. Żywotność kontroli pozytywnej powinna mieścić się w 95% przedziale ufności danych historycznych. Test spełnia kryterium akceptacji, jeśli średnia żywotność tkanek PC wyrażona jako % tkanek kontroli negatywnej wynosi 20%.</li>
<li>Kryterium akceptacji testu EPI-200-SIT 3: Odchylenie standardowe (SD) 
Drażniące działanie na skórę jest przewidywane na podstawie średniej żywotności określonej dla 3 pojedynczych tkanek, dlatego zmienność powtórzeń tkankowych powinna być akceptowalnie niska. Test spełnia kryterium akceptacji, jeśli SD obliczone z poszczególnych wartości % żywotności tkanki dla 3 identycznie traktowanych powtórzeń jest &lt;18%.</li>
</ul>
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Tabela danych eksperymentu in vitro, EpiDerm SIT, średnia OD, procenty żywotności, klasyfikacje testowe." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 1"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Wykres słupkowy względnych procentów żywotności; wyniki analizy danych statystycznych; porównanie eksperymentalne." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 2"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Tabela wyników testu żywotności; kody próbek, dane surowe, dane skorygowane, średnia i procent żywotności." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 1. Wyniki uzyskane dla 6 substancji testowych, kontroli NC i PC – część zautomatyzowanego arkusza kalkulacyjnego do obliczania wyników. Chemikalia testowe, które obniżyły żywotność tkanki poniżej 50% w stosunku do NC, są klasyfikowane jako substancje drażniące. Test jest zoptymalizowany tak, aby dostarczać wyniki wystarczająco oddalone od progu klasyfikacji (50% żywotności), co zwiększa powtarzalność analizy.
<img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Tabela składników zestawu do testu EpiDerm SIT i MTT, warunków przechowywania i szczegółów użytkowania." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Lista materiałów">

<ol><li>Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li>
<li>Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li>
<li>Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Skin+Irritation+Test%3A+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation%3A+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li>
<li>Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).</li>
<li>United Nations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labeling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS)</a>. , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).</li>
<li>ESAC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Statement+on+the+Scientific+Validity+of+In-Vitro+Tests+for+Skin+Irritation+Testing%22">Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing</a>. , ESAC. (2008).</li>
<li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Issues+and+answers%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li>
<li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Current+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami korporacji MatTek, która produkuje odczynniki i narzędzia wykorzystane w niniejszym artykule.

W tym filmie zaprezentowaliśmy test podrażnienia skóry EpiDerm (EpiDerm SIT), opracowany i zwalidowany do badania podrażnienia skóry przez substancje chemiczne in vitro, w tym składniki kosmetyczne i farmaceutyczne. Podczas wykonywania tej metody ważne jest zachowanie warunków aseptycznych oraz ścisłe przestrzeganie zwalidowanego protokołu, ponieważ odstępstwa od niego mogą doprowadzić do uzyskania odmiennych wyników. Możliwe są niektóre modyfikacje testu, jednak wszelkie zmiany w protokole powinny być konsultowane bezpośrednio z autorami.
Jedynym ograniczeniem tej metody jest możliwa interferencja substancji testowej z punktem końcowym testu MTT. Substancja testowa o określonym kolorze lub taka, która bezpośrednio redukuje MTT (naśladując tym samym aktywność dehydrogenaz mitochondrialnych komórek), może zakłócać wynik testu MTT. Jednakże substancje te stanowią problem tylko wtedy, gdy w momencie przeprowadzania testu MTT (tzn. 42 godziny po ekspozycji na substancję testową) na tkankach (lub w ich wnętrzu) wciąż obecne są wystarczające ilości substancji testowej. W przypadku tego mało prawdopodobnego zdarzenia, (prawdziwą) metaboliczną redukcję MTT oraz wkład kolorowego materiału testowego lub (fałszywą) bezpośrednią redukcję MTT przez materiał testowy można określić ilościowo za pomocą procedury szczegółowo opisanej w Standardowej Procedurze Operacyjnej (SOP) analizy dostarczonej przez MatTek Corp.

test podrażnienia skóry in vitro (sit) z wykorzystaniem modelu zrekonstruowanej ludzkiej naskórka (rhe) epiderm

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

Test drażnienia skóry EpiDerm (EpiDerm SIT) został opracowany(1,2,3)i zwalidowane(4,5)dlain vitrotesty drażnienia skóry przez substancje chemiczne, w tym składniki kosmetyczne i farmaceutyczne. EpiDerm SIT wykorzystuje 3Din vitrozrekonstruowany model ludzkiej naskórka (RHE) EpiDerm. Procedura opisana w niniejszym protokole pozwala na rozróżnienie między substancjami drażniącymi kategorii 2 wg GHS a substancjami niedrażniącymi(6)Test przeprowadzany jest w okresie 4 dni i składa się z preinkubacji, 60-minutowej ekspozycji, 42-godzinnej postinkubacji oraz testu żywotności MTT. Po otrzymaniu tkanek i nocnej preinkubacji (Dzień 0), tkanki są poddane miejscowej ekspozycji na badane substancje chemiczne (Dzień 1), które mogą być cieczami, substancjami półstałymi, stałymi lub woskami. Dla każdej substancji chemicznej, jak i dla kontroli pozytywnej (5% roztwór wodny SDS) oraz kontroli negatywnej (DPBS), wykorzystuje się trzy próbki tkanek. Ekspozycja na substancje chemiczne trwa 60 minut, z czego przez 35 min tkanki są przechowywane w inkubatorze w temperaturze 37°C. Następnie substancje testowe są usuwane z powierzchni tkanek za pomocą rozbudowanej procedury płukania. Wkładki z tkankami są osuszane i przenoszone do świeżego medium. Po 24-godzinnym okresie inkubacji (Dzień 2) medium zostaje wymienione. Medium można zachować do dalszej analizy cytokin lub innych interesujących punktów końcowych. Po wymianie medium tkanki inkubuje się przez kolejne 18 godzin. Po zakończeniu całej 42-godzinnej postinkubacji (dzień 3), tkanki przenosi się do żółtego roztworu MTT i inkubuje przez 3 godziny. Powstała fioletowo-niebieska sól formazanu, tworzona głównie w wyniku metabolizmu mitochondrialnego, jest ekstrahowana przez 2 godziny przy użyciu izopropanolu. Gęstość optyczna wyekstrahowanego formazanu jest wyznaczana za pomocą spektrofotometru. Substancję chemiczną klasyfikuje się jako drażniący, jeśli żywotność tkanki w stosunku do tkanek traktowanych kontrolą negatywną spadnie poniżej 50%. Niniejsza procedura może być stosowana jako pełny zamiennik testu drażnienia skóry królika in vivo w celu identyfikacji zagrożeń i etykietowania substancji chemicznych zgodnie z rozporządzeniami UE.(7)Since the user provided no input HTML to translate, I cannot generate a translation. Please provide the source HTML content.

W tym filmie prezentujemy test podrażnienia skóry EpiDerm (EpiDerm SIT), opracowany i zwalidowany do badań podrażnienia skóry in vitro w przypadku substancji chemicznych, w tym składników kosmetycznych i farmaceutycznych.

Test podrażnienia skóry in vitro (SIT) z wykorzystaniem modelu zrekonstruowanej ludzkiej naskórka (RHE) EpiDerm

Test podrażnienia skóry EpiDerm (EpiDerm SIT) został opracowany (1,2,3) i zwalidowany (4,5) w celu przeprowadzania badań in vitro nad podrażnieniem skóry wywołanym przez substancje chemiczne, w tym...

Epiderm to normalny ludzki model zrekonstruowanej in vitro naskórka, opracowany przez Matt Tech Corporation. Zwalidowany protokół testu podrażnienia skóry Epiderm EC VM zastępuje tradycyjne badania na zwierzętach w przypadku produktów takich jak kosmetyki, surowce i środki przemysłowe, które będą miały kontakt z ludzką skórą. Test rozpoczyna się w dniu zerowym, gdy zestaw do badania podrażnienia skóry i tkanka Epiderm zostaną dostarczone do laboratorium, a następnie poddane wstępnemu przygotowaniu w medium analitycznym po inkubacji przez noc.Pierwszego dnia nietypowa powierzchnia tkanki naskórka jest eksponowana przez jedną godzinę na domniemany związek drażniący, a następnie drugiego dnia substancja drażniąca jest usuwana w kroku płukania. Po 24-godzinnej inkubacji wkład kulturacyjny umieszcza się w świeżej pożywce, a starą pożywkę można wykorzystać do analizy uwolnionych cytokin i chemokin. Tkanka reaguje ze związkiem znanym jako MTT, który jest przekształcany przez reduktazę mitochondrialną w ciemnofioletową sól formazanu.Umożliwia odczyt żywotności komórek. Brak ciemnofioletowego koloru w próbce wskazuje na obniżoną żywotność. Jeśli kolorymetryczny odczyt dla badanego związku wynosi mniej niż 50% w stosunku do kontroli negatywnych, badany związek można zaklasyfikować jako drażniący.Witam, nazywam się Helena Kava z Matt Corporation. Dzisiaj przedstawimy procedurę badania podrażnienia skóry in vitro z wykorzystaniem zrekonstruowanego modelu ludzkiej skóry epiderm. Procedura ta, w zależności od wymogów regulacyjnych, może być stosowana jako całkowity lub częściowy zamiennik testu szybkiego podrażnienia skóry in vivo.Ta nowa procedura in vitro może być wykorzystywana do identyfikacji zagrożeń oraz etykietowania chemikaliów i surowców kosmetycznych. Przejdźmy zatem do realizacji. Epiderm powstaje z hodowli ludzkich keratynocytów naskórka w celu stworzenia trójwymiarowego, wielowarstwowego i silnie zróżnicowanego modelu ludzkiego naskórka.Tkanki te są aktywne mitotycznie i metabolicznie, ściśle naśladują swoje odpowiedniki in vivo zarówno pod względem strukturalnym, jak i biochemicznym, zapewniając przy tym powtarzalność, taką jak w przypadku ludzkiego naskórka. Epiderm składa się z uporządkowanych warstw podstawnej, kolczystej i ziarnistej oraz wielowarstwowego stratum corneum. Ta ostatnia zawiera międzykomórkowe warstwy lipidowe lam Miller ułożone w wzory analogiczne do tych występujących in vivo.Tkanki te są hodowane w medium bezsurowiczym. Każda tkanka rośnie w oddzielnym wkładzie do hodowli komórkowej. Dostępne są inne konfiguracje, w tym format wysokoprzepustowy 96-dołkowy.Produkcja tkanki trwa około trzech tygodni; w określonym punkcie tego procesu tkanka zostaje wystawiona na granicę faz powietrze-ciecz, a cała ciecz zostaje usunięta z powierzchni apikalnej tkanki. Tkanki są odżywiane wyłącznie przez powierzchnię basolateralną, która pozostaje w kontakcie z zastrzeżonym medium hodowlanym firmy mat tech. Typowy zestaw Epiderm zawiera 24 tkanki, z których każda ma dziewięć milimetrów średnicy i znajduje się we własnym wkładzie do hodowli tkankowej, a także wystarczającą ilość medium testowego do przeprowadzenia tego testu drażnienia skóry.24 wkłady są stabilnie osadzone na medium w postaci żelu różanego AGA, z jedną tkanką w każdej studni standardowej płytki 24-dołkowej; transport odbywa się kurierem w ciągu jednej nocy w temperaturze od 3 do 4 °C przed rozpoczęciem testowania substancji chemicznych. Korzystając z systemu testowego EPIDERM, należy przygotować i wysterylizować wszystkie instrumenty i narzędzia wykorzystywane w analizie zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Część materiałów, takich jak patyczki bawełniane, powinna być dostarczona w sterylnych opakowaniach lub poddana autoklawowaniu.Do sterylizacji narzędzi, takich jak pęsety, należy użyć 70% etanolu, natomiast do sterylizacji butelek myjących należy zastosować naświetlanie promieniami UV lub gamma. Dwiema kluczowymi roztworami przygotowanymi przed analizą powinny być DPBS oraz 5% roztwór SDS. W wodzie destylowanej do analizy z wykorzystaniem jednego zestawu zawierającego 24 próbki tkanek naskórka zostanie użyte około dwa litrów sterylnego DPBS o pH 7.Sterylny DPBS służy jako kontrola negatywna oraz roztwór do płukania. Należy przygotować 5% SDS i użyć go jako kontroli pozytywnej. Test drażnienia skóry rozpoczyna się po otrzymaniu zestawu EPIDERM EPI 200 SIT.Należy sprawdzić kompletność i stan wszystkich komponentów zestawu; w przypadku jakichkolwiek zastrzeżeń należy niezwłocznie skontaktować się z firmą Mat Tech. Jeśli wszystko jest w porządku, można przejść do następnego kroku. Przed rozpoczęciem testu należy doprowadzić dostarczone w zestawie podłoże do analizy do temperatury pokojowej. Nie należy go podgrzewać w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.Przygotuj jedną sterylną płytkę 6-dołkową na każde trzy wkłady z tkanką naskórkową i pipetuj 0,9 ml medium analitycznego do każdego dołka w warunkach sterylnych. Otwórz plastikową torebkę zawierającą płytkę 24-dołkową z tkankami naskórkowymi w sterylnym przepływie powietrza. Usuń sterylną gazę i za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie wyjmij każdy wkład zawierający tkankę naskórkową.Usunąć pozostałości agarosu przylegające do zewnętrznych ścianek wkładu, delikatnie osuszając je sterylną gazą lub papierem filtracyjnym. Następnie, w ciągu kolejnych pięciu minut, umieścić tkanki w pustej, sterylnej płytce 24-dołkowej. Dokonać wizualnej inspekcji wkładów.Odnotuj wszelkie defekty tkanki oraz nadmiar wilgoci na powierzchni. Nie należy używać tkanek z defektami lub tkanek całkowicie pokrytych cieczą.Optymalne wstawki tkankowe. Powinny mieć suchą powierzchnię i być wolne od odwarstwień, nierówności lub nadmiaru cieczy na powierzchni. Następnie, używając sterylnego patyczka z bawełnianą końcówką, ostrożnie osusz powierzchnię tkanek.Staraj się nie dotykać tkanek bezpośrednio. Po osuszeniu powierzchni efekty kapilarne są wystarczające do usunięcia z niej wilgoci. Przenieś trzy tkanki do górnego rzędu z każdego zestawu sześciu.Płytka wielodołkowa wypełniona uprzednio 0,9 ml medium do analizy. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod wkładkami. Następnie umieścić sześć płytek wielodołkowych z wkładkami w inkubatorze na jedną godzinę.Preinkubacja w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu pierwszego okresu preinkubacji przenieś wkłady z górnych do dolnych dołków płytki 6-dołkowej. Umieść płytki ponownie w inkubatorze w celu przeprowadzenia nocnej preinkubacji.Pozostałą część medium analitycznego należy umieścić w lodówce. Po nocnej preinkubacji można przystąpić do aplikacji substancji testowych na wkłady z tkanką naskórka. Przed rozpoczęciem testu ekspozycji chemicznej wszystkie niezbędne urządzenia, roztwory i substancje testowe należy doprowadzić do temperatury pokojowej.W komorze z laminarnym przepływem powietrza przetrzyj wszystkie butelki z materiałami nieszterylnymi 70% etanolem przed umieszczeniem ich wewnątrz komory. Sterylny DPBS (kontrolę negatywną), kontrolę pozytywną, 5% SDS oraz wodę destylowaną należy również umieścić w komorze w temperaturze pokojowej. Odstaw osobną dużą fiolkę na odpady.Przygotuj jedną płytkę 6-dołkową dla każdego związku chemicznego, napełniając jedynie górny rząd 0,9 ml medium do analizy na każdy dołek. Oznacz każdą płytkę numerem tkanki oraz nazwą związku chemicznego.Około pięciu minut przed planowaną ekspozycją na chemikalia wyjmij z inkubatora płytki sześciodołkowe zawierające tkanki poddane wstępnemu przygotowaniu. Następnie dokonaj oceny wizualnej powierzchni tkanek.Usuń wszelką wilgoć za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych, nie naciskając powierzchni tkanki. Na koniec opisz pokrywki płytki 6-dołkowej kodami lub nazwami badanych materiałów. W jednej serii testów nie badaj więcej niż sześciu substancji chemicznych, wliczając w to kontrole negatywną i pozytywną, z czego każda powinna być wykonana w trzech powtórzeniach.W przypadku obsługi znanych substancji testowych stosuj jedną minutę przerwy na aplikację odczynnika i przemycie. W przypadku próbek zakodowanych lub nieznanych postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w karcie charakterystyki materiału (MSDS). Przestrzegaj zasad bezpieczeństwa chemicznego i korzystaj z komory z wentylacją.Należy założyć rękawiczki oraz chronić oczy i twarz. Tkanki poddawane dawkowaniu chemikaliów należy traktować w odstępach jednominutowych, aby ułatwić płukanie substancji testowych po ekspozycji; płytki z tkankami poddawanymi dawkowaniu należy przechowywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza aż do momentu podania dawki do ostatniej tkanki. Przez cały czas trwania procedury do manipulowania tkankami i związkami testowymi należy używać pipety z zakończeniem w kształcie żarówki. Do uformowania końcówki w kształcie żarówki do podawania ciekłych chemikaliów można wykorzystać płomień palnika Bunsena.Nanieś 30 µL ciekłego badanego związku bezpośrednio na tkankę i natychmiast uruchom stoper, aby odliczał czas w górę. Połóż siatkę nylonową na powierzchni tkanki. Gdy stoper osiągnie jedną minutę, dodaj drugi związek ciekły. Użyj trzech tkanek na każdą substancję chemiczną, pamiętając o dodawaniu każdego związku w odstępach jednominutowych.Do badania substancji półstałych należy użyć pipety o wyporze dodatnim, aby nanieść 30 µL bezpośrednio na tkankę. W razie potrzeby należy rozprowadzić odczynnik za pomocą pipety Pasteura, aby dopasować go do powierzchni tkanki. Krótko przed aplikacją substancji stałej należy zwilżyć powierzchnię tkanki 25 µL sterylnego DPBS w celu poprawy kontaktu powierzchni tkanki z badanym związkiem, a następnie napełnić 25 mg łyżeczkę aplikacyjną drobno zmielonym materiałem testowym.Nanieś stały odczynnik testowy na powierzchnię tkanki. W razie potrzeby użyj sterylnego końcówki typu bulb do pipety, aby całkowicie opróżnić łyżeczkę. Delikatnie potrząśnij wkładami, aby poprawić rozprowadzenie substancji stałej na powierzchni.Można również użyć końcówki typu bulb, dopasowanej do rozmiaru tkanki. Nie należy naciskać powierzchni tkanki. Na koniec, w trzech powtórzeniach, do wkładów tkankowych należy dodać DPBS jako kontrolę negatywną oraz 5% SDS jako kontrolę pozytywną; po podaniu preparatu do ostatniej tkanki wszystkie płytki należy przenieść na 35 ± 1 minut do inkubatora z nawilżeniem w temperaturze 37 °C.Podczas tej inkubacji należy umieścić w dygestorium wszystkie materiały niezbędne do etapów płukania. Po 35-minutowej inkubacji wyjmij wszystkie płytki z inkubatora. Umieść je w sterylnym dygestorium i odczekaj do zakończenia 60-minutowego okresu ekspozycji chemicznej dla tkanek z pierwszej dawki.Następnie rozpocznij procedurę płukania. Przepłucz tkanki sterylnym DPBS 15 razy. Aby usunąć resztki materiału testowego, napełnij wkład z tkanką, używając stałego strumienia DPBS podawanego w odległości 1,5 centymetra od powierzchni tkanki, a następnie go opróżnij.Upewnij się, że strumień DPBS nie jest zbyt słaby, w przeciwnym razie substancja testowa nie zostanie usunięta. Pamiętaj o zachowaniu jednominutowego odstępu czasu podczas pięciokrotnego przemywania czterech tkanek przez nylonową siatkę, a następnie ostrożnie usuń siatkę za pomocą ostrych pęsety z zakrzywionym końcem. Następnie kontynuuj pozostałe 10 płukań; po piętnastym razie przemyj wkład trzy razy, zanurzając go całkowicie w butelce z roztworem, używając 150 mililitrów DPBS, i wstrząśnij, aby usunąć resztki materiału testowego.Na koniec opłucz tkankę. Przelej sterylnym DPBS raz od wewnątrz i raz od zewnątrz. Usuń nadmiar DPBS z tkanki, delikatnie potrząsając wkładem i osuszając go na sterylnym papierze absorbującym.Następnie przenieś osuszone wkłady z tkanką do nowej płytki sześciodołkowej, która została wcześniej napełniona medium do analizy. Ponownie pamiętaj, że wszystkie te kroki muszą zostać wykonane w odstępie jednej minuty, aby zachować czas ekspozycji wynoszący 60 minut dla każdej próbki. Po opłukaniu ostatniej tkanki ostrożnie osusz powierzchnię każdej z nich za pomocą sterylnego patyczka z bawełnianym końcem.Jeśli na powierzchni wciąż znajdują się ślady substancji chemicznej, należy spróbować usunąć je za pomocą sterylnego patyczka z watą. Na koniec inkubuj tkanki w inkubatorze przez kolejne 24 godziny. Zapisz czas rozpoczęcia inkubacji w arkuszu dokumentacji metody.Zarejestruj również wszystkie różne zastosowania w arkuszu dokumentacji metody. Aneks do standardowej procedury operacyjnej dostarczonej przez Mat Tech Corporation dotyczącej przenoszenia płytek w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przenieś wkład do dolnej części płytki sześciodołkowej wypełnionej wcześniej 0,9 ml medium.Zebrać pożywkę z górnego rzędu i przenieść ją do wcześniej oznakowanej płytki 24-dołkowej, którą następnie należy umieścić w temperaturze -20 °C. Do czasu przeprowadzenia analizy, analiza cytokin i/lub chemokin wydzielonych do pożywki hodowlanej jest krokiem opcjonalnym. Kontynuować inkubację przez kolejne 18 ± 3 godzin; przed przeprowadzeniem testu MTT oznakować dwie płytki 24-dołkowe nazwami chemicznymi lub kodami.Pamiętaj, że MTT jest toksyczne, dlatego podczas pracy należy bezwzględnie używać rękawic ochronnych. Przygotuj roztwór MTT poprzez rozmrożenie koncentratu MTT i rozcieńczenie go odpowiednim rozcieńczalnikiem MTT.Chronić przed światłem, ponieważ MTT jest światłoczułe, i zużyć w ciągu dwóch do trzech godzin. Ponieważ MTT ulega degradacji z czasem, nalać do każdej studzienki płytki 24-dołkowej 300 µL pożywki z MTT. Następnie wyjąć płytki 6-dołkowe z inkubatora.Osusz spód wkładów na papierze filtracyjnym, a następnie przenieś je do płytki 24-dołkowej wypełnionej uprzednio MTT. Umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze i inkubuj przez trzy godziny. Należy pamiętać o zapisaniu godziny rozpoczęcia inkubacji z MTT w MDS oraz ściśle przestrzegać trzygodzinnego czasu inkubacji, aby uniknąć rozbieżności w odczytach MTT. Po zakończeniu inkubacji z MTT użyj pompy ssącej z pułapką na odpady toksyczne, aby delikatnie odessać medium z MTT ze wszystkich dołków.Napełnij studzienki DPBS, a następnie odessij zawartość. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy i upewnij się, że tkanki są suche po ostatnim odessaniu. Po przemyciu przenieś wkłady do nowej płytki 24-dołkowej i zanurz je, delikatnie pipetując 2 ml roztworu do ekstrakcji do każdego wkładu.Poziom cieczy podniesie się powyżej górnych krawędzi wkładki, całkowicie pokrywając tkanki z obu stron. Uszczelnij płytkę 24-dołkową za pomocą zgrzewarki termicznej lub paraflemu, aby zapobiec wyciekowi ekstraktu i parowaniu. Zapisz czas rozpoczęcia ekstrakcji w arkuszu dokumentacji metod i pozostaw do ekstrakcji na co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce do płytek. Po zakończeniu okresu ekstrakcji przebij wkładki igłą wstrzykikującą lub końcówką pipety i pozwól ekstraktowi spłynąć do dołka, z którego wyjęto wkładkę.Wyrzuć przebite wkłady i pipetuj roztwór w studzience w górę i w dół trzy razy, aż stanie się homogeniczny. W przypadku każdej tkanki można również zastosować wstrząsarkę do płytek ustawioną na 120 RPMs. Przenieś dwie 200 µL alikwoty niebieskiej formy i roztworu do 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem.Przenieś duplikaty zgodnie z ustalonym schematem płytki podanym w arkuszu dołączonym do tego protokołu wideo dla próbek ślepych. Użyj izopropanolu, odczytaj gęstość optyczną (OD) za pomocą spektrofotometru do płytek 96-dołkowych przy długości fali 570 nanometrów, nie stosując filtra referencyjnego. Wprowadź wyniki do arkusza w celu automatycznego obliczenia rezultatów.Należy uwzględnić korekty wynikające z interferencji substancji testowej, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole; substancja testowa zostaje określona jako substancja drażniąca, jeśli procent żywotności tkanki po analizie spektrofotometrycznej jest równy lub mniejszy od 50%, wartość OD 570 dla tkanek NC jest większa lub równa 1 i mniejsza lub równa 2,5, a średnia żywotność tkanek PC, wyrażona jako procent tkanek kontroli negatywnej, wynosi mniej niż 20%, oraz SD obliczone z indywidualnych procentowych wartości żywotności tkanek trzech identycznie traktowanych powtórzeń jest mniejsze niż 18%. Związki dające wartości żywotności komórek poniżej 50% mogą być uznane za substancje drażniące.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia zwalidowanego testu drażniącego dla skóry w wariancie 60 minut i 42 godzin z wykorzystaniem zrekonstruowanego modelu ludzkiej skóry Epiderm. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że główna część badania jest przeprowadzana w warunkach sterylnych lub aseptycznych. W przypadku potrzeby modyfikacji metody lub potrzeby uzyskania dokładniejszych wyjaśnień któregokolwiek z etapów procedury, prosimy o kontakt w celu uzyskania pomocy i porad.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test podrażnienia skóry in vitro (SIT) z wykorzystaniem modelu EpiDerm Rekonstruowanego Naskórka Ludzkiego (RHE)

W niniejszym raporcie opisujemy trójwymiarowy model rekonstrukcji skóry, który naśladuje architekturę i skład ludzkiej skóry. Wykorzystując model rekonstrukcji skóry, badano fizjologię melanocytów, progresję czerniaka oraz losy dermalnych komórek macierzystych. Model ten jest również przydatny jako narzędzie przedkliniczne do oceny leków.

Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Obecny protokół opisuje zastosowanie organotypowych modeli tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro. W szczególności opisany system modelowy wykorzystuje wielowarstwowy nabłonek jamy ustnej narażony na działanie mikroorganizmów związanych z biofilmami (płytką nazębną) w kontekście zdrowia jamy ustnej w porównaniu z chorobą.

Organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro

Poznaj metodę EpiDerm SIT do oceny podrażnienia skóry in vitro z wykorzystaniem rekonstruowanego naskórka ludzkiego. Ta technika zastępuje testy na zwierzętach i zapewnia niezawodne wyniki w badaniach toksykologicznych.

Test podrażnienia skóry in vitro (SIT) z wykorzystaniem modelu zrekonstruowanej ludzkiej naskórka (RHE) EpiDerm

Przeglądaj więcej filmów