Protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w ludzkich plemnikach

Protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w jądrach plemników ludzkich został szeroko wprowadzony do praktyki diagnostyki klinicznej. Jednym z zastosowań tej metody jest badanie ploidii plemników. W ramach poradnictwa w zakresie reprodukcji udzielanego mężczyznom z problemami z płodnością, stwierdza się, że częstotliwość występowania anomalii liczby chromosomów jest u tych osób wyższa niż w populacji ogólnej, a dodatkowo często wykazują oni nieprawidłowe parametry nasienia.

Reprezentuje to zwiększone ryzyko przekazania tych anomalii potomstwu. Dzisiaj zaprezentujemy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w zdekondensowanych jądrach plemników w celu analizy chromosomów 13, 18, 21, X i Y. Po pobraniu próbki należy pozostawić ją w temperaturze pokojowej na 20 minut do momentu upłynnienia. Aby rozpocząć protokół, próbkę należy przenieść do probówki do wirowania.

Roztwory, których użyjemy w pierwszej części eksperymentu, to roztwory hipertoniczne wstępnie podgrzane do 37 °C oraz mieszanina metanolu i kwasu octowego w proporcji trzy do jednego. Muszą być one świeżo przygotowane. Następnie próbkę można poddać wirowaniu z przyspieszeniem 1000 ×g przez pięć minut.

Następnie ostrożnie usuń nadsącz i dodawaj roztwór hipertoniczny kropla po kropli, aż do uzyskania objętości około 10 ml. Probówkę należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie ponownie odwiruzować próbkę. Centryfugacja powoduje osadzenie się plemników na dnie probówki, co pozwala zastąpić roztwór hipotoniczny metanolem.

Odwirowanie w kwasie octowym należy powtarzać, wymieniając mieszaninę metanolu i kwasu octowego tak długo, aż powstanie biały osad. W takim przypadku należy dodać więcej mieszaniny metanolu i kwasu octowego. Końcową objętość należy dostosować do pożąnego stopnia dyspersji komórkowej, który ma zostać osiągnięty w kolejnych etapach.

Ostatnim krokiem jest wykonanie rozmazów poprzez naniesienie utrwalonej próbki na szkiełka przedmiotowe Reed przechowywane w metanolu w temperaturze -20°C. Pomocne jest oznaczenie obszaru szkiełka zawierającego rozmaz plemników w celu późniejszej lokalizacji. Można to łatwo zrobić, używając ołówka diamentowego na drugiej stronie szkiełka. Po zweryfikowaniu optymalnej dyspersji komórkowej szkiełka powinny być przechowywane w temperaturze -20°C przez co najmniej 24 godziny.

Przed przystąpieniem do protokołu. W tej części eksperymentu będziemy używać soli fizjologicznej, roztworu cytrynianu sodu, serii etanolu, DRE fatal oraz fide. Po rozmrożeniu preparatów, utrwalone próbki należy przemyć i odwodnić, zanurzając je w dwóch następujących po sobie słoikach Coplan zawierających 2×SSC.

Proces ten potrwa trzy minuty dla każdego słoika Copland. Następnie preparaty należy zanurzyć na dwie minuty w każdym z słoików Copland z etanolem, zgodnie z kolejnością rosnącego stężenia. Na tym etapie, aby przejść do kolejnych etapów, preparaty muszą zostać wysuszone.

Z uwagi na to, że DNA w jądrze plemnika jest silnie upakowane, konieczne jest rozluźnienie struktury chromatyny przed jej denaturacją. Można to osiągnąć, stosując roztwór DTT w temperaturze 37 °C. Jest to produkt, który działa poprzez rozrywanie mostków ssiarkowych protamin zwijających DNA w jądrze plemników. Czas inkubacji preparatu w DTT musi być dostosowany do reaktywności próbki nasienia na ten produkt.

Zazwyczaj trwa to około ośmiu minut, choć czas ten może wahać się od dwóch do 15 minut. Po upływie tego czasu preparaty należy niezwłocznie przenieść do roztworu 2×SSC na trzy minuty, a następnie ponownie na kolejne trzy minuty, po czym przez dwie minuty w każdym z Coplanowych słoików z etanolem. W przypadku hybrydyzacji sondy niezbędne jest użycie pojedynczych nici DNA. Wymaga to etapu denaturacji przed dodaniem sond, obejmującego pięciominutową inkubację w roztworze formamidowym w temperaturze 73°C. Aby zakończyć obróbkę preparatów, wymagane jest końcowe przeniesienie do roztworu etanolu poprzez zanurzenie płytek na jedną minutę w każdym słoiku Coplan.

Slajdy są następnie gotowe do hybrydyzacji w badaniach FISH prowadzonych w celach diagnostyki klinicznej. Najczęściej analizowane chromosomy obejmują chromosomy płci oraz chromosomy 13, 18 i 21. Do analizy tych chromosomów wykorzystamy wielokolorowy zestaw sond DNA firmy vices.

Zestaw zawiera jedną fiolkę z kombinacją sond dla regionu satelitarnego alfa chromosomów X, Y oraz 18, odpowiednio znakowanych kolorem zielonym i aqua, oraz drugą fiolkę z kombinacją sond dla chromosomów 13 i 21, odpowiednio znakowanych kolorem zielonym i pomarańczowym. Objętość dodawanej mieszaniny sond będzie zależeć od wielkości obszaru przeznaczonego do hybrydyzacji; dla szkiełka cover slide o wymiarach 15 na 15 wystarczająca jest objętość 5 µL.

Obie mieszaniny sond są wstępnie denaturowane w buforze do hybrydyzacji w celu ułatwienia użytkowania, dzięki czemu można je dodawać bezpośrednio na odtłuszczone, skondensowane i zdenaturowane preparaty na szkiełkach. Dostępne są również inne komercyjne sondy dla szerokiego zakresu chromosomów i loci, które mogą być wykorzystane w tych eksperymentach. Zazwyczaj jednak sondy te wymagają wstępnej denaturacji przed dodaniem mieszaniny do próbki docelowej.

W takich sytuacjach wystarczy postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Obszar docelowy należy przykryć szkiełkiem nakrywką i uszczelnić cementem gumowym. Następnie preparaty są gotowe do umieszczenia w komorze hybrydyzacyjnej, uprzednio rozgrzanej do 37 °C, i inkubowania w tej temperaturze od 6 do 24 godzin.

W końcowej części protokołu użyjemy dwóch roztworów płuczących, przygotowanych z różnych stężeń soli cytrynianu sodu oraz detergentu NP 40. Po czasie inkubacji można wyjąć preparaty z komory do hybrydyzacji, aby usunąć klej gumowy. Następnie należy ostrożnie zdjąć szkiełko zakrywkowe.

Jak pokazano, preparaty są zanurzane na dwie minuty w pierwszym roztworze piorącym, wstępnie podgrzanym do 73 °C. Następnie zostają one przeniesione do drugiego roztworu piorącego w temperaturze pokojowej na kolejną minutę. Te dwa etapy płukania pomogą wyeliminować wszelkie niespecyficzne sygnały hybrydyzacji. Po tych dwóch płukaniach należy odczekać do wyschnięcia preparatów, aby zakończyć ostatni krok protokołu.

Na tym etapie dodaje się produkt do barwienia kontrastowego, aby ułatwić wizualizację jąder komórkowych. Jednym z najczęściej stosowanych w tym celu produktów jest dpi. Objętość dodanego preparatu należy dostosować do wielkości obszaru hybrydyzacji, przyjmując za punkt odniesienia szkiełko podstawowe o wymiarach 18 na 18.

Wystarczy objętość 8 µL DPI. Szkiełko cover slide można uszczelnić lakierem do paznokci, po czym preparaty są gotowe do wizualizacji. Alternatywnie można je przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu planowanej analizy.

Mikroskop, którego użyjemy do wizualizacji, to Olympus BX 60 epi fluorescent wyposażony w filtr trójpasmowy dla dpi, Texas Red i FITC oraz filtry jednopasmowe dla aqua, FITC i Texas Red; dzięki filtrowi trójpasmowemu preparat zhybrydyzowany z x, Y i 18 wykazuje sygnały dla tych trzech chromosomów. Korzystając z filtra jednopasmowego dla aqua, możemy wizualizować jedynie sygnały fluorescencyjne dla chromosomu 18. W każdym prawidłowym plemniku powinniśmy spodziewać się jednego z takich sygnałów.

Jednakże, przy zastosowaniu filtra pojedynczego pasma wyłącznie dla FITC, niektóre plemniki wykazują fluorescencyjny zielony sygnał odpowiadający chromosomowi X. Plemniki pozbawione zielonego sygnału powinny wykazywać czerwony sygnał dla chromosomu Y, który można było specyficznie zwizualizować za pomocą filtra dla Texas red. Wizualizując hybrydyzację 1321 za pomocą filtra potrójnego pasma, możemy rozróżnić sygnały dla tych dwóch chromosomów.

Sygnał zielony odpowiada chromosomowi 13 i może być specyficznie wizualizowany przy użyciu filtra pasmowo-przepustowego dla FITC. Filtr pasmowo-przepustowy dla Texas Red pozwala na specyficzną wizualizację sygnałów dla chromosomu 21. Wszystkie prawidłowe spermatozoidy powinny wykazywać jeden sygnał dla każdej z tych dwóch sond.

Podsumowując, oto główne etapy protokołu. Powtórzymy, że proces fiksacji należy przeprowadzić starannie, dodając kwas octowy w metodzie kroplowej, aby uzyskać wysokiej jakości elongacje. Aby uniknąć powstawania agregatów plemników podczas procesu dekondensacji, czas inkubacji w roztworze DTT należy dostosować do reaktywności próbki nasienia na ten produkt.

Zbyt długa ekspozycja plemników na DTT doprowadziłaby do rozproszenia sygnałów na koniec protokołu, natomiast zbyt krótka ekspozycja spowodowałaby brak hybrydyzacji sond i brak niektórych sygnałów. Podczas gdy denaturacja próbki nasienia jest obowiązkowa, denaturacja sondy musi być dostosowana do zaleceń producenta. Ważne jest zachowanie ścisłej kontroli czasu i temperatury dwóch przemyć po hybrydyzacji.

Wyższa temperatura lub nadmierny czas płukania mogą doprowadzić do zaniku niektórych sygnałów, podczas gdy działanie przeciwne nie usunie sygnałów niespecyficznych. Na koniec, użycie mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry specyficzne jest niezbędne dla prawidłowej wizualizacji i interpretacji sygnału. I to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.