Name: Oczyszczanie mitochondriów z komórek drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania mitochondriów z drożdży Saccharomyces cerevisiae przy użyciu homogenizacji i gradientu gęstości sacharozy. Protokół zapewnia wysoką wydajność izolacji z zachowaniem integralności strukturalnej i funkcjonalnej organelli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty z CIHR oraz NSERC w Kanadzie. V.I.T. jest Nowym Badaczem CIHR oraz Katedrą Badawczą Uniwersytetu Concordia w zakresie genomiki, biologii komórki i starzenia.

Materiały i metody
Szczepy drożdży i warunki hodowli
Szczep typu dzikiego BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) hodowano w bogatym medium YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptony, 2% glukozy). Komórki hodowano w temperaturze 30°C w kolbach Erlenmeyera przy wytrząsaniu obrotowym z prędkością 200 rpm, zachowując stosunek objętości kolby do objętości medium wynoszący 5:1.
Izolacja surowej frakcji mitochondrialnej
<ol>
<li>Hodować 1 L kultury szczepu typu dzikiego BY4742 przez 48 h.</li>
<li>Przelać kulturę do 500-ml probówek wirówkowych Nalgene. Zbilansować obciążenie i zebrać komórki poprzez wirowanie przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 250 ml dH2O. Odwirować komórki przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 250 ml dH2O. Odwirować komórki przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Wyznaczyć masę mokrą osadu komórkowego.</li>
<li>Resuspendować osad komórkowy w buforze DTT [2 ml buforu/g (masa mokra) komórek].</li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową do 50-ml plastikowych probówek Falcon.</li>
<li>Rotować probówki z prędkością 70 rpm w inkubatorze wytrząsowym przez 20 min w temperaturze 30°C.</li>
<li>Zebrać komórki poprzez wirowanie przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Resuspendować osad komórkowy w buforze z Zymolyase bez Zymolyase [7 ml buforu/g (masa mokra) komórek].</li>
<li>Odwirować komórki przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Resuspendować osad komórkowy w buforze z Zymolyase bez Zymolyase [7 ml buforu/g (masa mokra) komórek].</li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową do kolby szklanej.</li>
<li>Dodać proszek Zymolyase-100T [1 mg Zymolyase-100T/g (masa mokra) komórek] do zawiesiny komórkowej.</li>
<li>Rotować kolbę z zawiesiną komórkową z prędkością 70 rpm w inkubatorze wytrząsowym przez 30 min w temperaturze 30°C.</li>
<li>Przenieść sferoplasty powstałe w wyniku trawienia ściany komórkowej za pomocą Zymolyase-100T do 50-ml plastikowych probówek wirówkowych.</li>
<li>Odwirować sferoplasty przez 8 min przy 2200 x g w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
**Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w temperaturze 4°C lub w lodzie. Zawiesiny sferoplastów należy traktować ostrożnie, używając pipet z odciętymi końcówkami, aby uniknąć uszkodzenia organelli.**
<ol start="18">
<li>Resuspenduj osad sferoplastów w lodowatym buforze do homogenizacji [6,5 ml buforu/g (masy mokrej) komórek].</li>
<li>Odwiruj sferoplasty przez 8 min przy 2200 x g w temperaturze 4°C.</li>
<li>Resuspenduj osad sferoplastów w lodowatym buforze do homogenizacji [6,5 ml buforu/g (masy mokrej) komórek].</li>
<li>Przenieś komórki do schłodzonego na lodzie szklanego homogenizatora.</li>
<li>Używając dopasowanego tłuczka, homogenizuj komórki, wykonując 15 ruchów tłuczkiem.</li>
<li>Dodaj 1 objętość lodowatego buforu do homogenizacji.</li>
<li>Przenieś zhomogenizowane sferoplasty do plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.</li>
<li>Odwiruj nieuszkodzone komórki, jądra i duże resztki komórkowe przez 5 min przy 1500 x g w temperaturze 4°C.</li>
<li>Odwiruj otrzymany nadsącz przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze 4°C.</li>
<li>Odwiruj otrzymany nadsącz przez 15 min przy 12000 x g w temperaturze 4°C.</li>
<li>Zlej nadsącz i resuspenduj osad w lodowatym buforze do homogenizacji [6,5 ml buforu/g (masy mokrej) komórek].</li>
<li>Odwiruj przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze 4°C.</li>
<li>Odwiruj otrzymany nadsącz przez 15 min przy 12000 x g w temperaturze 4°C.</li>
<li>Zlej nadsącz i resuspenduj osad w 3 ml lodowatego buforu do SEM.</li>
</ol>
**Choć zawiesina ta jest wzbogacona w mitochondria, zawiera ona również inne organelle, takie jak retikulum endoplazmatyczne (mikrosomy), aparat Golgiego i wakuole. Aby uzyskać czyste mitochondria, tę surową frakcję mitochondrialną można poddać dalszemu frakcjonowaniu, zgodnie z opisem poniżej.**
Oczyszczanie mitochondriów pozbawionych zanieczyszczeń innymi organellami
<ol>
<li>Do probówki wirówki Beckman Ultra-Clear nalać 1,5 ml schłodzonej do temperatury lodu 60% (w/v) sacharozy w buforze EM.</li>
<li>Na 60% (w/v) sacharozę nanieść warstwowo 4 ml 32%, 1,5 ml 23% oraz 1,5 ml 15% sacharozy (wszystkie stężenia wt/v w buforze EM).</li>
<li>Na wierzch 15% (w/v) sacharozy nanieść 3 ml surowej frakcji mitochondrialnej w buforze SEM.</li>
<li>Wirować w rotorze z ruchomymi koszyczkami Beckman SW41 Ti przez 1 h przy 134000 x g (33000 rpm) w temperaturze 4°C.&nbsp;</li>
<li>Nienaruszone mitochondria tworzą brązowy prążek na granicy faz 60%/32% sacharozy.</li>
<li>Ostrożnie usuwać sacharozę, aż do osiągnięcia prążka mitochondrialnego.</li>
<li>Pobrać prążek mitochondrialny za pomocą pipety z odciętą końcówką i przenieść go do probówki wirówki Beckman przeznaczonej dla rotora MLS-5.</li>
<li>Wypełnić probówkę buforem SEM.</li>
<li>Utrącić czyste mitochondria poprzez wirowanie w rotorze MLS-5 przez 30 min przy 10000 x g (31000 rpm) w temperaturze 4°C.</li>
<li>Odlać nadosad za pomocą pipety.</li>
<li>Czyste mitochondria wykorzystać do analizy funkcji mitochondrialnych, proteomu i lipidomu mitochondrialnego oraz mitochondrialnego DNA.</li>
</ol>
Odczynniki
<ol>
<li>Bufor DTT [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9.4), 10 mM ditiotreitol] (na 15 ml)
<ul style="list-style-type:none;">
<li>1,5 ml buforu 1 M Tris/H2SO4 (pH 9.4)</li>
<li>150 μl 1 M DTT</li>
<li>Dopełnić objętość do 15 ml</li>
</ul>
</li>
<li>Bufor z zymolazą [20 mM fosforan potasu (pH 7.4), 1,2 M sorbitol] (na 100 ml)
<ul style="list-style-type:none;">
<li>2 ml buforu 1 M fosforan potasu (pH 7.4)</li>
<li>60 ml 2 M sorbitolu</li>
<li>Dopełnić objętość do 100 ml</li>
</ul>
</li>
<li>Bufor do homogenizacji [10 mM Tris/HCl (pH 7.4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w/v) BSA] (na 250 ml]
<ul style="list-style-type:none;">
<li>2,5 ml buforu 1 M Tris/HCl (pH 7.4)</li>
<li>75 ml 2 M sorbitolu</li>
<li>500 μl 500 mM EDTA</li>
<li>0,5 g BSA</li>
<li>Dopełnić objętość do 250 ml</li>
</ul>
</li>
<li>Bufor do SEM [10 mM MOPS/KOH (pH 7.2), 250 mM sacharoza, 1 mM EDTA] (na 250 ml)
<ul style="list-style-type:none;">
<li>2,5 ml buforu 1 M MOPS/KOH (pH 7.2)</li>
<li>31,25 ml 2 M sacharozy</li>
<li>500 μl 500 mM EDTA</li>
<li>Dopełnić objętość do 250 ml</li>
</ul>
</li>
<li>Bufor do EM [10 mM MOPS/KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA] (na 250 ml)
<ul style="list-style-type:none;">
<li>2,5 ml buforu 1 M MOPS/KOH (pH 7.2)</li>
<li>500 μl 500 mM EDTA</li>
<li>Dopełnić objętość do 250 ml</li>
</ul>
</li>
</ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Metoda ta umożliwia wysokowydajną izolację czystych mitochondriów z komórek drożdży. Mitochondria oczyszczone tą metodą są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu. Opisana metoda pozwala na uzyskanie mitochondriów odpowiednich do bezkomórkowej rekonstytucji kluczowych procesów mitochondrialnych. Te wysokiej czystości mitochondria mogą być również wykorzystywane do analizy struktury i funkcji mitochondriów, proteomu i lipidomu mito...

oczyszczanie mitochondriów z komórek drożdży

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria są głównym miejscem produkcji ATP podczas metabolizmu tlenowego w eukariotycznych komórkach niezdolnych do fotosyntezy1Te złożone organelle odgrywają również kluczowe role w apoptotycznej śmierci komórki2, przeżywalność komórek3, rozwój ssaków4, rozwój i funkcje neuronów4, sygnalizacja wewnątrzkomórkowa5, oraz regulację długowieczności6Nasze zrozumienie tych złożonych procesów biologicznych kontrolowanych przez mitochondria opiera się na rzetelnych metodach oceny ich morfologii, składu białkowego i lipidowego, integralności ich DNA oraz licznych funkcji życiowych. Drożdże pączkująceSaccharomyces cerevisiae, genetycznie i biochemicznie manipulowalny jednokomórkowy eukariot z adnotowanym genomem i dobrze zdefiniowanym proteomem, stanowi cenny model do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw kluczowych funkcji biologicznych mitochondriów. W tego typu badaniach kluczowe jest uzyskanie wysokiej czystości mitochondriów. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy opis szybkiej i skutecznej metody oczyszczania mitochondriów drożdży. Metoda ta umożliwia izolację wysokiej czystości mitochondriów, które są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu. Mitochondria oczyszczone tą metodą nadają się do bezzakomórkowej rekonstrukcji kluczowych procesów mitochondrialnych i mogą być wykorzystywane do analizy struktury i funkcji mitochondriów, proteomu i lipidomu mitochondrialnego oraz mitochondrialnego DNA.

Opisujemy szybką i skuteczną metodę oczyszczania mitochondriów z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta umożliwia wysokowydajną izolację czystych mitochondriów, które są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu.

Oczyszczanie mitochondriów z komórek drożdży

Mitochondria są głównym miejscem produkcji ATP podczas metabolizmu tlenowego w eukariotycznych komórkach niezdolnych do fotosyntezy1. Te złożone organelle odgrywają również...

Protokół ten rozpoczyna się od przekształcenia komórek drożdży w sferoplastu poprzez trawienie ściany komórkowej za pomocą zymolazy, a następnie sferoplasty są homogenizowane przy użyciu homogenizatora szklano-teflonowego. Otrzymany homogenat poddawany jest dwukrotnej wirowaniu w celu osadzenia niezniszczonych komórek, jąder komórkowych oraz dużych zanieczyszczeń. Następnie otrzymany nadosad jest wirowany przez 15 minut przy 12 000 G, aby osadzić mitochondria.W końcu surową frakcję mitochondrialną, która wciąż zawiera inne organella, poddaje się wirowaniu przez 60 minut przy 134 000 Gs w gradiencie gęstości sacharozy; czyste mitochondria, pozbawione zanieczyszczeń innymi organellami, są odzyskiwane na granicy faz 60% w/v i 32% w/v sacharozy. Cześć, jestem dr Christopher Greg z laboratorium dr. Vladimira Tko na wydziale biologii Uniwersytetu Concordia. Dzisiaj pokażę Państwu, jak izolować mitochondria z drożdży Saccharomyces.Wykonujemy to, aby zbadać dynamikę oraz zmiany związane z wiekiem, które zachodzą w mitochondriach. W miarę starzenia się komórek przyjrzymy się zmianom w proteomie, lipidomie oraz DNA mitochondriów. Zatem zacznijmy.Rozpocznij protokół od hodowli szczepu drożdży w dziesięciu kolbach o pojemności 250 ml. Każda z nich powinna zawierać 50 ml pożywki YP i być inkubowana w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu przez 48 godzin. Następnie przelej kulturę do 500 ml wirówek Nalgene.Zebrać komórki poprzez wirowanie przez pięć minut przy 3000 Gs w temperaturze pokojowej, odlać nadsącz i ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 mililitrach wody destylowanej, a następnie wirować komórki przez pięć minut przy 3000 Gs w temperaturze pokojowej. Powtórzyć ten krok, zawieszając osad komórkowy w 250 mililitrach wody destylowanej i wirować przez pięć minut.Przy 3000 Gs w temperaturze pokojowej zważ otrzymany mokry osad komórkowy, następnie resuspenduj osadzone komórki w buforze DTT i przenieś zawiesinę komórkową do kolby o pojemności 250 ml. Obracaj kolbę z prędkością 70 RPM w temperaturze 30 °C przez 20 minut. Po 20 minutach odwirowuj komórki przez pięć minut przy 3000 Gs w temperaturze pokojowej, resuspenduj osadzone komórki w buforze Xs bez Xs i wiruj przez pięć minut.Przy 3000 Gs w temperaturze pokojowej ponownie resuspenduj osad komórkowy w buforze Zy bez Xs i przenieś zawiesinę komórkową do szklanej kolby. Do zawiesiny komórkowej dodaj proszek zy liase 100 T i inkubuj przy 70 RPM w wytrząsarce w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut; Zy liase 100 T strawi ściany komórkowe, tworząc sferoplasty. Wszystkie kolejne etapy po wcześniej pokazanym trawieniu X powinny być przeprowadzane w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie.Zawiesiny splatów należy traktować ostrożnie, używając pipet z odciętymi końcówkami, aby uniknąć uszkodzenia organelli. Po zakończeniu 30-minutowego trawienia XMO, przenieść Sphero plats do 50 mililitrowych plastikowych probówek wirówkowych i wiruj przez osiem minut przy 2200 Gs w temperaturze czterech stopni Celsiusiusza, a następnie resuspenduj osad S splats w lodowatym buforze homogenizacyjnym. Wiruj S splats przez osiem minut przy 2200 Gs w temperaturze czterech stopni Celsiusiusza.Resuspend sferoplasty z osadu w lodowatym buforze do homogenizacji, a następnie przenieś komórki do schłodzonego szklanego homogenizatora. Za pomocą dopasowanego tłoka przeprowadź homogenizację komórek, wykonując 15 ruchów tłokiem.Do zhomogenizowanych fragmentów S należy dodać taką samą objętość lodowatego buforu do homogenizacji, a następnie przenieść je do plastikowych probówek do wirowania o pojemności 50 ml. Zhomogenizowane fragmenty wirować przez pięć minut z prędkością 1500 G przy temperaturze 4 °C, aby osadzić nienaruszone komórki, jądra komórkowe i duże resztki komórkowe. Powstały supernatant przelać do nowych probówek i wirować przez pięć minut.Przy 3000 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po tym wirowaniu, otrzymany nadsącz wiruj przez 15 minut przy 12 000 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odlej nadsącz i resuspenduj osad w lodowatym buforze homogenizacyjnym.Odwiruj zawiesinę z osadu przez pięć minut przy 3000 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwiruj otrzymany supernatant przez 15 minut przy 12 000 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zlej supernatant i ponownie zawieś osad w trzech mililitrach lodowatego roztworu.Bufor SEM. Zawiesina ta stanowi surową frakcję mitochondrialną. Mimo że jest ona wzbogacona w mitochondria, zawiera również inne organelle, takie jak retikulum endoplazmatyczne lub mikrosomy GOGI i VAs, aby uzyskać czyste mitochondria.Zawiesina zostanie poddana dalszemu frakcjonowaniu, zgodnie z opisem w następnej sekcji. Aby rozpocząć frakcjonowanie surowej zawiesiny mitochondrialnej w celu uzyskania czystych mitochondriów, należy przelać 1,5 mililitra lodowatego, 60% masowo-objętościowo roztworu sacharozy w buforze em do probówki wirówki Beckman UltraClear.Następnie delikatnie nałóż na 60% sucrose cztery mililitry 32% sucrose, 1,5 mililitra 23% sucrose oraz 1,5 mililitra 15% sucrose, all weight per volume w buforze em. Umieść trzy mililitry surowej frakcji mitochondrialnej w buforze SEM na wierzchu warstwy 15% weight per volume sucrose. Wiruj w wirówce z rotorem z ruchomymi kubełkami Beckman SW 41 TI przez jedną godzinę przy 134 000 Gs lub 33 000 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po wirowaniu nienaruszone mitochondria utworzą brązowy prążek na granicy faz 60% i 32% sacharozy. Ostrożnie usuwaj sacharozę za pomocą pipety z odciętym końcem, aż dotrzesz do prążka mitochondrialnego, następnie pobierz prążek mitochondrialny i umieść go w probówce do wirówki Beckman. W przypadku rotora MLS five napełnij probówkę buforem SEM, a następnie wydziel granulat czystych mitochondriów poprzez wirowanie w rotorze MLS five przy 10 000 GS lub 31 000 RPM przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odlej nadsącz.Te czyste mitochondria mogą teraz zostać wykorzystane do analiz funkcji mitochondrialnych, proteomu mitochondrialnego, lipidów oraz mitochondrialnego DNA. Surowa frakcja mitochondrialna w lewych ścieżkach oraz mitochondria oczyszczone metodą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy w prawych ścieżkach zostały poddane elektroforezie SDS-PAGE i immunoblottingowi z użyciem przeciwciał przeciwko markerom białkowym różnych organelli. Obecność mitochondriów w obu preparatach potwierdzono za pomocą immunoreaktywności PO one P i COX one p; immunoblotting wykazał obecność DP M1 P, FO 13 p oraz VPS 10 P, reprezentujących odpowiednio białka retikulum endoplazmatycznego, wakuol i aparatu Golgiego w surowej frakcji mitochondrialnej.W przeciwieństwie do tego, białka markerowe nie zostały wykryte w oczyszczonych mitochondriach, co potwierdza, że protokół pozwolił uzyskać mitochondria wolne od zanieczyszczeń innymi organellami. W ten sposób pokazaliśmy, jak izolować mitochondria z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Pamiętajcie podczas przeprowadzania tego eksperymentu, aby nie inkubować komórek w zylizie 100 T przez więcej niż pół godziny, ponieważ ryzykujecie degradację białek błonowych lub białek organelli, które mogą znajdować się w komórkach.Może to być spowodowane obecnością proteaz w odczynniku. Ponadto, przed przystąpieniem do izolacji mitochondriów i przygotowaniem gradientu sacharozy, można zamrozić te mitochondria w temperaturze -20°C, a następnie rozmrozić je bezpośrednio przed etapem wirowania. To wszystko.Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

purification-of-mitochondria-from-yeast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zanieczyszczenie preparatów rybosomów eukariotycznych oczyszczonych metodami tradycyjnymi współoczyszczającymi nukleazami i proteazami negatywnie wpływa na późniejsze analizy biochemiczne i strukturalne. W celu rozwiązania tego problemu zastosowano szybką i prostą metodę oczyszczania chromatograficznego, wykorzystując rybosomy drożdżowe jako system modelowy.

Chromatograficzne oczyszczanie wysoce aktywnych rybosomów drożdżowych

Wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest związanych z zewnętrzną błoną mitochondriów. Opisujemy procedurę frakcjonowania subkomórkowego mającą na celu wyizolowanie mitochondriów drożdży wraz z powiązanymi z nimi mRNA i rybosomami. Protokół ten można zastosować do komórek hodowanych w różnych warunkach w celu ujawnienia mechanizmów lokalizacji mRNA i zlokalizowanej translacji w pobliżu mitochondriów.

Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

Ta praca wyjaśnia, jak przekształcić mitochondria drożdży za pomocą metody biolistycznej. Pokazujemy również, jak selekcjonować i oczyszczać transformanty oraz jak wprowadzić pożądaną mutację w docelowej pozycji w genomie mitochondrialnym.

Transformacja mitochondrialna w drożdżach piekarskich w celu zbadania translacji i składania kompleksów oddechowych

Oddychanie mitochondrialne w całych komórkach drożdży jest cennym wskaźnikiem bioenergetyki komórki. W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia tego fenotypu mający zastosowanie do różnych gatunków drożdży.

Kwantyfikacja oddychania mitochondrialnego w całych komórkach drożdży

Drożdże rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe stają się atrakcyjnym modelem do badania mitochondriów. W tym miejscu opisujemy protokół analizy obfitości i składania mitochondrialnych kompleksów oddechowych w S. pombe. Umożliwia to scharakteryzowanie nowych funkcji konserwatywnych genów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym.

Analiza ekspresji i składania kompleksów białek mitochondrialnego łańcucha oddechowego w drożdżach rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe

Poznaj metodę oczyszczania mitochondriów z drożdży Saccharomyces cerevisiae przy użyciu homogenizacji i gradientu gęstości sacharozy. Protokół zapewnia wysoką wydajność izolacji z zachowaniem integralności strukturalnej i funkcjonalnej organelli.

Oczyszczanie mitochondriów z komórek drożdży

Przeglądaj więcej filmów