Połączenie QD-FRET i mikrofluidyki w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Procedura ta rozpoczyna się od znakowania DNA i polimeru w celu wygenerowania kropek kwantowych lub plazmy gruszki QD, DNA jest sprzężone z kropkami kwantowymi. Dawca energii i polimer oniczny są oznaczone florą organiczną cztery sci pięć. Akceptor energii.

Po zmieszaniu progu QD, nanokompleksy są tworzone w wyniku samoorganizacji elektrostatycznej, a sygnał progowy za pośrednictwem QD może być następnie śledzony w miarę zachodzenia interakcji. Ten system progów QD jest wprowadzany do kanału mikroprzepływowego, w którym składniki będą oddziaływać tylko poprzez dyfuzję na interfejsie mieszania. Samoorganizacja nanokompleksu DNA może być następnie monitorowana przez połączenie progu QD i mikrofluidyki.

Cześć, nazywam się Megan Ho i pracuję w laboratorium biologicznym i dynamiki pojedynczych cząsteczek na Wydziale Inżynierii Mechanicznej Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę łączenia zagrożeń kwantowych i mikrofluidyki w celu monitorowania samoorganizacji paznokci DNA w czasie rzeczywistym. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania kompleksów DNNL pod kątem lokalizacji terapii genowej.

Więc zacznijmy. Zestaw do znakowania biotyny firmy MIRIs bio służy do kowalencyjnego biotyny DNA osocza z etykietami biotyny specyficznymi dla guaniny, ale skalowanymi tak, aby miały około jednej do dwóch etykiet biotyny na DNA. Na początek rozpuść żądaną ilość DNA osocza w buforze TE, aby uzyskać jeden mikrogram na mikrolitr roztworu DNA.

Ustaw reakcję etykietowania, mieszając wodę wolną od D-N-A-D-N-A i wodę wolną od RNA 10 x bufor do znakowania A i odczynnik do znakowania. Etykieta, w której znajduje się odczynnik, jest dodawana jako ostatnia. Inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po jednogodzinnej inkubacji oczyścić oznakowaną próbkę przez wytrącanie etanolu. Przestrzeganie standardowych protokołów. Przechowuj znakowane DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia.

Następnym krokiem jest oznakowanie polimeru onicznego. W tej demonstracji użyjemy chitozanu jako modelowego polimeru onicznego i oznaczymy wolne aminy pierwszorzędowe na szkielecie polimeru chitozanu za pomocą NHS science-fi, najpierw obliczymy wymaganą ilość NHS scifi tak, aby stosunek molowy scifi do średnich pierwotnych wynosił od jednego do 200. Ułatwi to pełną koniugację barwnika scifi.

Dodaj wodorotlenek sodu do roztworu chitozanu w 25-milimolowym buforze octanu, aby dostosować jego pH do około 6,5, powoli mieszając, dodaj obliczoną ilość NHS science-fiction do roztworu chitozanu kropla po kropli. Przykryj fiolkę folią aluminiową, aby utrzymać mieszaninę w ciemności i mieszać w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego dnia należy oczyścić mieszaninę przez dializę za pomocą szkiełka o stężeniu 10 K-M-W-C-O z przebijania do 1% buforu octanowego, dializowanego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.

Po dwóch godzinach wymienić 1% bufor octanowy i dializować przez kolejne dwie godziny. W temperaturze pokojowej w ciemności ponownie wymień bufor i dializ przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Następnego dnia należy wyjąć oczyszczony, oznakowany polimer z kasety dializy.

Chitozan znakowany SCI pięć jest następnie zbierany do mikroprobówki wirówkowej i przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodaj streptawidynę funkcjonalizowaną 6 0 5 kropek do biotynylowanego roztworu DNA osocza. Upewnij się, że używasz serii Q dot stripted have w sprzężeniu, w przeciwieństwie do zwykłej serii Q dot, ponieważ kropki kwantowe w serii ITK są zaprojektowane do celów progowych.

Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Utrzymuj reakcję etykietowania QD w ciemności, aby zapobiec ewentualnemu wybielaniu zdjęć. Po 15 minutach dodaj DNA znakowane QD do 50-milimolowego roztworu siarczanu sodu, aby uzyskać końcową objętość 200 mikrolitrów.

Aby przygotować polimer science-fiction, oblicz wymaganą ilość chitozanu na 10 mikrogramów DNA osocza zgodnie z pożądanym stosunkiem NP, który jest teoretycznym stosunkiem protonowanych substancji immunologicznych w roztworze chitozanu do ujemnych fosforanów w roztworze DNA, rozcieńcz chitozan science-fi zgodnie z pożądanym stosunkiem NP za pomocą wody Milli Q, aby uzyskać końcową objętość 200 mikrolitrów, roztwory DNA i chitozanu znakowane QD są teraz gotowe do załadowania do urządzenia mikroprzepływowego, jak to zostanie pokazane w sekcji szóstej. Wafel silikonowy jest przygotowywany wcześniej przez czyszczenie i wypalanie piranii w celu usunięcia wilgoci z wafla dla wyznaczonej grubości 25 mikronów. Obracaj ujemny fotorezystor na płytce silikonowej z prędkością 2000 obr./min przez 30 sekund.

Wafelek upieczemy na miękko na gorącej płycie z rampą od 65 stopni Celsjusza na godzinę do 95 stopni Celsjusza. Spowoduje to odparowanie rozpuszczalnika na zdjęciu SU ósemka. Oprzyj się i zestal go przed wystawieniem na działanie światła UV.

Po miękkim upieczeniu nałóż na płytkę krzemową folię maskującą zawierającą projekt mikrokanalików na płytce krzemowej wystawionej na działanie światła UV o długości 365 nanometrów przez 250 milidżuli na centymetr kwadratowy po ekspozycji. Piecz wafelek na gorącej płycie z rampą od 65 stopni Celsjusza na godzinę do 95 stopni Celsjusza. Opracuj wafel za pomocą wywoływacza SU eight Photoresist, aby sprawdzić, czy jest w pełni opracowany.

Zanurz wafel w alkoholu izopropylowym. Alkohol izopropylowy nie powinien zmienić koloru na mleczny. Na koniec, aby wzmocnić strukturę SU eight, upiecz wzorzysty wafel na gorącej płycie z rampą od 65 stopni Celsjusza na godzinę do 200 stopni Celsjusza.

Utrzymuj wafel w temperaturze 200 stopni Celsjusza przez co najmniej pięć godzin. Następnie stopniowo schładzamy wafel do temperatury pokojowej. Umieść ósemkę SU w łodzi wagowej.

Wymieszaj elastomer silikonowy i utwardzacz polidimetylu Sloane lub PDMS w stosunku 10 do jednego. Wlej mieszaninę PDMS na główny SU eight i pozostaw łódkę wagową w osuszaczu próżniowym w celu usunięcia pęcherzyków. Utwardź PDMS w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin.

Po utwardzeniu PDMS oderwij pasek PDMS od silikonowej formy wzorcowej za pomocą całego stempla dziurkacza, dwóch wlotów kanałów i jednego wylotu kanału dla urządzenia fluidycznego. Wyczyść pasek PDMS i szkło nakrywkowe etanolem, a następnie wysusz na powietrzu. Oczyszczony pasek PDMS i szkło nakrywkowe należy potraktować plazmą tlenową o mocy 20 watów.

Po pierwsze, natychmiast przyklej pasek PDMS do szkła osłonowego. Pozostaw połączony chip mikroprzepływowy w piekarniku w temperaturze 95 stopni Celsjusza na noc. Obróbka plazmowa i pieczenie przez noc są niezbędne do zwiększenia siły wiązania.

Przed załadowaniem odczynników napełnij kanał mikroprzepływowy wodą, aby upewnić się, że w środku nie ma pęcherzyków. Zapewni to płynny przepływ. Podczas eksperymentu załaduj wcześniej przygotowane roztwory chitozanu QD, znakowane DNA i science fiction do dwóch oddzielnych szklanych strzykawek przez rurkę.

Połącz rurkę z dwoma wlotami urządzenia mikroprzepływowego. Uważaj, aby nie wprowadzać powietrza podczas procesu. Ustaw natężenie przepływu na 20 nanolitrów na minutę W warunkach przepływu laminarnego.

Sprawdź mikrokanaliki pod mikroskopem, gdy przepływ jest stabilny przez około 15 do 20 minut. Próg zapośredniczony przez QD powinien być obserwowany w środku kanału. Rejestruj obrazy fluorescencyjne w różnych miejscach wzdłuż kanału za pomocą chłodzonej kamery CCD.

Przeanalizuj te obrazy za pomocą obrazu J i laboratorium pochodzenia. Sygnał za pośrednictwem progów jest monitorowany w różnych pozycjach osiowych wzdłuż kanału. Residence. Czas jest obliczany na podstawie zastosowanego natężenia przepływu przy użyciu tego wzoru, gdzie bar TISA jest miejscem zamieszkania.

Czas X to odległość od miejsca, w którym spotykają się dwa strumienie, do pozycji badanej reakcji. A V to średnia prędkość przepływu. Przekrojowe profile intensywności sygnałów sci-fi za pośrednictwem progów mogą być następnie analizowane w naszym systemie.

Eksperymentalnie zmierzone profile wykazują rozkład Gaussa. Właśnie pokazaliśmy, jak monitorować kompleksy DNA paznokci za pomocą nici za pośrednictwem w prostym kanale mikropłynów. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby pamiętać o zaprojektowaniu znacznika na kanale mikropłynu, tak aby czas rezydentów mógł być prosty w oparciu o zastosowane natężenie przepływu i geometrię kanału.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.