Name: Połączenie QD-FRET i mikrofluidyki w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Poznaj metodę monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym przy użyciu QD-FRET i mikrofluidyki. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę formowania polielektrolitowych polipleksów dla zastosowań w terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wsparcie finansowe zapewnione przez grant NIH HL89764 oraz granty NSF 0546012, 0730503 i 0725528.

A. Biotynylacja DNA
Plazmidowe DNA zostało kowalencyjnie biotynilowane za pomocą specyficznych dla guaniny znaczników biotyny zgodnie z opisem producenta (Mirus Bio, Madison, WI), przy czym skalę dostosowano tak, aby uzyskać ~1-2 znaczniki biotyny na cząsteczkę DNA. W niniejszym protokole znakowano plazmidowe DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA).
<ol><li>Rozpuścić pożądaną ilość pDNA w buforze TE lub wodzie wolnej od DNaz i RNaz (klasy biologii molekularnej), aby przygotować roztwór DNA o stężeniu 1μg/μL.</li>
 <li>Przeprowadzić reakcję znakowania, stosując poniższe mieszaniny reakcyjne. Odczynnik LabelIT dodać na samym końcu.</li>
</ol>
 Dla reakcji z 100μg DNA:
<table border="1">
<tbody >
 <tr >
 <td >Woda wolna od DNazy i RNazy</td>
 <td >75 μL</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >10X bufor do znakowania A</td>
 <td >20 μL</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >1μg/μL DNA</td>
 <td >100 μL</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >odczynnik LabelIT</td>
 <td >5 μL</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >Objętość całkowita</td>
 <td >200 μL</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
<ol start="3">
 <li>Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
 <li>Oczyścić oznakowaną próbkę poprzez wytrącanie etanolem lub izopropanolem zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
</ol>
Uwaga: Kolumny oparte na filtracji żelowej mogą powodować wysoką absorbancję UV lub wysokie tło fluorescencyjne, co może wpływać na ilościowe oznaczenie DNA lub charakterystykę fluorescencji. 
 Uwaga: Poziom biotynylacji można określić za pomocą testów opartych na HABA.
 B. Znakowanie polimeru kationowego Cy5
W niniejszym badaniu jako modelowy polimer kationowy wykorzystano chitosan (390 kDa, 83,5% odacetylowany, Vanson, Redmond, WA). Wolne aminy pierwszorzędowe w szkielecie polimeru chitozanu znakowano Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
<ol>
 <li>Aby umożliwić całkowitą konjugację barwnika Cy5, oblicz wymaganą ilość Cy5-NHS w taki sposób, aby stosunek molowy Cy5 : aminy pierwszorzędowe wynosił 1 : 200.</li>
 <li>Dostosuj pH roztworu chitosanu (w buforze octanowym 25mM) do wartości ~6,5 poprzez dodanie NaOH. Należy pamiętać, że reakcja NHS jest bardziej wydajna przy zasadowym pH, jednak rozpuszczalność chitosanu w tym przypadku ogranicza zakres pH roboczego.</li>
 <li>Podczas mieszania powoli dodawaj obliczoną ilość Cy5-NHS (1 mg/ml DMSO) do roztworu chitosanu kroplami.</li>
 <li>Mieszaninę inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
 <li>W celu oczyszczenia przeprowadź dializę za pomocą Slide-a-Lyzer (Pierce) o MWCO 10k przez 2 h przeciwko 1% buforowi octanowemu w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
 <li>Wymień bufor i dializuj przez kolejne 2 h w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
 <li>Wymień bufor i dializuj przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
 <li>Oczyszczony polimer z etykietą przechowuj w temperaturze -20 °C.</li></ol>
Uwaga: W niniejszym badaniu krzywa wzorcowa została sporządzona poprzez pomiar intensywności emisji estru Cy5-NHS przy 670 nm. Gęstość znakowania określono, mierząc uzyskaną emisję przy 670 nm dla chitosanu znakowanego Cy5 na krzywej wzorcowej. Do określenia wydajności znakowania można również zastosować pomiar absorbancji, jednak w tym przypadku nie został on przeprowadzony.
C. Przygotowanie DNA znakowanego QD oraz polimeru Cy5
Stosunek molowy pDNA do QD utrzymano w nadmiarze (pDNA : QD ≈ 1 : 2), aby zapewnić pełną koniugację QD z pDNA. Liczbę QD przyłączonych do każdej cząsteczki pDNA można oszacować za pomocą obrazowania TEM lub innych równoważnych metod. W naszym badaniu liczba QD na pDNA została oszacowana na ~1-3 za pomocą TEM i spektroskopii pojedynczych cząsteczek.1 Podczas przygotowania należy używać wody Millipore Milli-Q z systemu gradientowego (&gt;18.0 MW, filtrowanej przez 0.2um).
<ol> 
 <li>Obliczyć wymaganą ilość chitosanu dla 10μg pDNA zgodnie z pożądanym stosunkiem N/P, czyli teoretycznym stosunkiem protonowanych amin w roztworze chitosanu do ujemnych fosforanów w roztworze DNA.</li>
 <li>Dodać funkcjonalizowane streptawidyną 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) do roztworu biotynowanego pDNA.</li>
 <li>Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 min.</li>
 <li>Dodać DNA znakowane QD do 50 mM roztworu siarczanu sodu, tak aby końcowa objętość wynosiła 200μL.</li>
 <li>Rozcieńczyć Cy5-chitosan, zgodnie z pożądanym stosunkiem N/P, wodą Milli-Q, tak aby końcowa objętość wynosiła 200μL.</li>
 </ol>
 Uwaga: Należy prowadzić reakcję w ciemności, aby zapobiec ewentualnemu fotoblaknięciu. 
 Ważne: Należy pamiętać o zastosowaniu koniugatu Qdot 605 ITK™ streptawidyna (seria ITK), ponieważ kropki kwantowe z tego katalogu zostały zaprojektowane do celów FRET. Standardowe serie Qdot są koniugowane z warstwą PEG w celu zapobiegania nieswoistemu wiązaniu, szczególnie w przypadku znakowania komórkowego. Jednak ta dodatkowa powłoka zwiększa odległość między donorem a akceptorem, co skutkuje obniżeniem wydajności transferu energii.
 D. Wytwarzanie matryc SU-8 przy użyciu standardowej fotolitografii
<ol>
 <li>Wafry Si oczyszcza się w roztworze piranha i wypieka w temperaturze 200 °C przez 5 min.</li>
 <li>Aby uzyskać założoną grubość matrycy wynoszącą 25μm, nanosi się negatywny fotorezyst (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) na wafry Si metodą spin coatingu przy 2000 rpm przez 30 sec.</li>
 <li>Wafry poddaje się wstępnemu wypiekaniu (soft bake) na płycie grzejnej z rampą wzrostu temperatury 65 °C/hr do 95 °C.</li>
 <li>Próbkę naświetla się światłem UV (365nm) z dawką 250mJ/cm2 przez filmową maskę (CAD/Art Services, Bandon, OR) zawierającą projekt mikrokanałów.</li>
 <li>Wafry poddaje się wypiekaniu po naświetlaniu (post-exposure bake) na płycie grzejnej z rampą wzrostu temperatury 65 °C/hr do 95 °C.</li>
 <li>Wafry wywołuje się przy użyciu wywoływacza do fotorezystu SU-8.</li>
 <li>Wzorowany wafry poddaje się końcowemu wypiekaniu (hard bake) na płycie grzejnej z rampą wzrostu temperatury 65 °C/hr do 200 °C. Temperaturę 200 °C utrzymuje się przez co najmniej 5 hours, a następnie stopniowo schładza wafry do temperatury pokojowej.</li>
 </ol>
 Ważne: Podczas procesu wygrzewania głównego SU-8 niezbędne jest stopniowe zwiększanie temperatury, w przeciwnym razie struktura SU-8 może oddzielić się od wafla krzemowego lub w strukturze SU-8 mogą powstać pęknięcia wywołane zjawiskiem rozprężania naprężeń.
 E. Odlewanie replik PDMS z matryc i ich wiązanie z szybką przykrywkową
<ol>
 <li>Matrycę SU-8 umieszcza się w łódzce wagowej.</li>
 <li>Miesza się elastomer silikonowy i utwardzacz (Poly(dimethylsiloxane), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) w stosunku 10 : 1.</li>
 <li>Mieszaninę PDMS wlewa się na matrycę SU-8, a następnie łódzkę wagową umieszcza się w deskrypcie próżniowym w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>PDMS utwardza się w temperaturze 65 °C przez 1-2 godziny.</li>
 <li>Prążek PDMS odkleja się od krzemowej matrycy formierskiej.</li>
 <li>Wycina się wloty i wyloty kanałów urządzenia mikrofluidycznego.</li>
 <li>Prążek PDMS oraz szkiełko nakrywkę oczyszcza się etanolem, a następnie suszy na powietrzu.</li>
 <li>Oczyszczony prążek PDMS oraz szkiełko nakrywkę poddaje się działaniu plazmy tlenowej (20W przez 1min).</li>
 <li>Następnie niezwłocznie łączy się prążek PDMS ze szkiełkiem nakrywką.</li>
 <li>Połączony chip mikrofluidyczny pozostawia się w piekarniku w temperaturze 95 °C przez noc.</li>
</ol>
Ważne: Obróbka plazmą oraz wypalanie przez noc są niezbędne do zwiększenia wytrzymałości wiązania.
F. Monitorowanie tworzenia nanokompleksów DNA w urządzeniu mikroprzepływowym
<ol>
 <li>Napełnij kanał mikroprzepływowy wodą (aby upewnić się, że wewnątrz kanału nie ma pęcherzyków powietrza) przed wprowadzeniem odczynników, aby zapewnić płynny przepływ podczas eksperymentu.</li>
 <li>Wprowadź roztwory DNA znakowanego QD oraz chitosanu znakowanego Cy5 do dwóch oddzielnych szklanych strzykawek, za pomocą drenów opisanych w filmie.</li>
 <li>Podłącz dreny do dwóch wlotów urządzenia mikroprzepływowego. Należy uważać, aby podczas tego procesu nie wprowadzić powietrza. Ustaw natężenie przepływu na 20nL/min (pompa strzykawkowa PHD-2000, Holliston, MA), w warunkach przepływu laminarnego.</li>
 <li>Sprawdź mikrokanały pod mikroskopem.</li>
 <li>Po ustabilizowaniu przepływu (~15 do 20 minut) w centrum kanału powinien zostać zaobserwowany efekt FRET indukowany przez QD.</li>
 <li>Wykonaj zdjęcia fluorescencyjne (Cooled CCD, Qimaging, BC, Canada) w różnych miejscach wzdłuż kanału.</li>
 <li>Przeanalizuj obrazy fluorescencyjne za pomocą programów ImageJ i OriginLab.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="Analiza spektralna QD-FRET z pikami absorpcji, schemat nanokompleksu DNA do badania białek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. QD-FRET zapewnia czułą wskazację początku samoorganizacji nanokompleksów DNA
<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Transfer energii rezonansowej fluorescencji z udziałem kropek kwantowych (QD-FRET) może dostarczyć ilościowej i wysoce czułej informacji o stabilności polipleksów w środowisku zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowym, umożliwiając jednoznaczne wykrycie momentu rozpoczęcia oddziaływań między DNA a nośnikiem genu. Para FRET, 605QD i Cy5, została wybrana w celu zmaksymalizowania nakładania się widm donora i akceptora oraz zminimalizowania potencjalnych zakłóceń (cross-talk). Dla tej pary odległość Förstera wynosi 69,4Å.3</li>
 <li>Samorzutne składanie nanokompleksów DNA w układzie QD-FRET. Anionowe plazmidowe DNA (pDNA) oraz kationowy nośnik genu zostały oznakowane odpowiednio QD (donor energii) i Cy5 (akceptor energii). Nanokompleksy QD-FRET powstały w wyniku elektrostatycznej koacervacji kompleksowej. Po wzbudzeniu przy 488 nm emisja Cy5 zapośredniczona przez QD-FRET wskazała na powstanie kompaktowego i nienaruszonego nanokompleksu. Czas przebywania (tR) można obliczyć na podstawie odległości (x) mierzonej od miejsca spotkania dwóch strumieni do miejsca badanej reakcji oraz średniej prędkości przepływu (v). Ze względu na naturę przepływu laminarnego mieszanie zachodzi tylko na granicy faz (środek każdego obrazu), co pozwala na precyzyjne obliczenie transportu masy jako funkcji tR. Rozdzielczość czasową można dostosować poprzez zmianę stosowanych szybkości przepływu. (Wstawka) Sygnał zapośredniczony przez FRET zaobserwowano natychmiast na granicy faz w momencie spotkania dwóch strumieni, co wskazuje na szybkie wiązanie, zachodzące w ciągu kilku milisekund zgodnie ze stosowanymi szybkościami przepływu. Pasek skali: 100μm.</li>
</ol>

<ol><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li>
<li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

<ul><li>Znaczenie naszej pracy:
 <ol>
 <li>Jest to pierwsza próba monitorowania kinetyki samoorganizacji polimerowych nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym (z rozdzielczością milisekundową) za pomocą odpowiedzi QD-FRET w obrębie prostego chipa mikroprzepływowego.</li>
 <li>FRET zapośredniczony przez QD zapewnia wysoką czułość i ilościowe wskazanie momentu rozpoczęcia oddziaływań molekularnych oraz przebiegu całego procesu samoorganizacji, podczas gdy mikroprzepływy oferują dobrze kontrolowane mikrośrodowisko do przestrzennej analizy procesu podczas syntezy nanokompleksów DNA.</li>
 <li>Integracja mikroprzepływów i nanofotoniki sugeruje nowe i interesujące podejście do badania dowolnego rodzaju reakcji kompleksowania.</li>
 <li>Otrzymane polimerowe nanokompleksy DNA QD-FRET mogą zostać łatwo zastosowane do ustalania zależności między strukturą a funkcją.1,2</li>
 </ol>
</li></ul>

<table><tbody><tr><td>SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Plazmidowe DNA</td><td>Clontech Laboratories</td><td>pEGFP-C1</td><td>4.9 kb, MW = 3.3 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Label&lt;/em&gt;IT Biotin Labeling Kit</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR 3400</td><td>Standardowy protokół zapewnia wydajność znakowania na poziomie około jednej etykiety na każde 20-60 bp dwuniciowego DNA; gęstość znakowania została dostosowana w niniejszej pracy.</td></tr><tr><td>Streptawidyna 605QD</td><td>Invitrogen</td><td>Qdot&amp;#174; 605 ITK&amp;#174; Streptavidin Conjugate</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-NHS Ester</td><td>Amersham</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>Chitozan</td><td>Vanson</td><td>390 kDa</td><td>83,5% deacetylowany</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545C</td><td>Nr 1; Wymiary: 40 x 22 mm</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka Gastight</td><td>Hamilton Co</td><td>seria TLL</td><td>od 50&amp;#x03BC;L do 500&amp;#x03BC;L w zależności od objętości próbki</td></tr><tr><td>Przewody Tygon</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>0.02 ID, 100ft</td><td>Przewody Tygon Microbore, 0.02 ID, 100ft</td></tr><tr><td>Konektor</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-23R</td><td>Dostosowany do długości 0.750&quot;</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>QImaging</td><td>Intensified Retiga Cooled</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX-51</td><td>lampą łukową rtęciową 100 W</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>v1.36b</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>Origin Pro8</td><td>OriginLab</td><td>Wersja studencka</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy filtrów mikroskopowych</td><td>Omega Optical</td><td>475AF40</td><td>Filtr wzbudzenia w obu kanałach</td></tr><tr><td>Zestawy filtrów mikroskopowych</td><td>Omega Optical</td><td>595AF60</td><td>Filtr emisyjny w kanale 605QD</td></tr><tr><td>Zestawy filtrów mikroskopowych</td><td>Omega Optical</td><td>670DF40</td><td>Filtr emisyjny w kanale QD-FRET</td></tr><tr><td>Zestawy filtrów mikroskopowych</td><td>Omega Optical</td><td>500 DRLP</td><td>Dichroik długoprzepustowy w kanale 605QD</td></tr><tr><td>Zestawy filtrów mikroskopowych</td><td>Omega Optical</td><td>595DRLP</td><td>Dichroik długoprzepustowy w kanale QD-FRET</td></tr></tbody></table>

połączenie qd-fret i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów dna w czasie rzeczywistym

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Postępy w genomice wciąż napędzają rozwój terapii, które mogą celować w patogenezę na poziomie komórkowym i molekularnym. Środki terapeutyczne oparte na kwasach nukleinowych, które zazwyczaj działają wewnątrz komórki, wymagają wydajnego systemu dostarczania wewnątrzkomórkowego. Powszechnie stosowanym podejściem jest tworzenie kompleksów DNA z nośnikiem genów w celu otrzymania nanokompleksów poprzez elektrostatyczną samoorganizację, co ułatwia pobieranie DNA przez komórki, jednocześnie chroniąc je przed degradacją. Wyzwaniem pozostaje racjonalne projektowanie wydajnych nośników genów, ponieważ przedwczesna dysocjacja lub zbyt stabilne wiązanie byłyby niekorzystne dla pobierania komórkowego i skuteczności terapeutycznej. Nanokompleksy syntetyzowane metodą mieszania objętościowego wykazały zróżnicowane zachowanie w zakresie wewnątrzkomórkowego rozpakowywania i transportu, co przypisano heterogeniczności rozmiaru i stabilności nanokompleksów. Taka heterogeniczność utrudnia dokładną ocenę kinetyki samoorganizacji i potęguje trudności w korelacji ich właściwości fizycznych z wydajnością transfekcji lub bioaktywnością. Przedstawiamy nowatorskie połączenie nanofotoniki (tj. QD-FRET) i mikrofluidyki w celu charakterystyki w czasie rzeczywistym kinetyki samoorganizacji nanokompleksów w przepływie laminarnym. Metoda QD-FRET zapewnia wysoką czułość w wykrywaniu początku oddziaływań molekularnych oraz pomiar ilościowy w całym procesie syntezy, podczas gdy mikrofluidyka oferuje dobrze kontrolowane mikrośrodowisko do przestrzennej analizy procesu z wysoką rozdzielczością czasową (rzędu milisekund). W przypadku modelowego układu polimerowych nanokompleksów, platforma analityczna ta pozwoliła zarejestrować dwa odrębne etapy procesu samoorganizacji. Aspekt kinetyczny procesu samoorganizacji uzyskany w skali mikro będzie szczególnie cenny dla reakcji prowadzonych w mikroreaktorach, które znajdują zastosowanie w wielu aplikacjach w skali mikro- i nanoskalowej. Ponadto nanokompleksy mogą być dostosowywane poprzez odpowiednie projektowanie urządzeń mikrofluidycznych, a uzyskane polimerowe nanokompleksy DNA z QD-FRET mogą zostać łatwo wykorzystane do ustanowienia zależności struktura-funkcja.

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Postępy w dziedzinie genomiki wciąż napędzają rozwój terapii, które mogą celować w patogenezę na poziomie komórkowym i molekularnym. Zazwyczaj...

Procedura ta rozpoczyna się od znakowania DNA i polimeru w celu wytworzenia pary FRET z kropkami kwantowymi (QD); DNA jest sprzęgane z kropkami kwantowymi, które pełnią rolę donora energii, natomiast polimer jonowy jest znakowany organicznym fluoroforem, który pełni rolę akceptora energii.Po zmieszaniu QD fret powstają nanokompleksy w procesie elektrostatycznego samozłożenia, a następnie można śledzić sygnał fret pośredniczony przez QD w miarę zachodzenia interakcji. Ten system QD fret jest wprowadzany do kanału mikroprzepływowego, w którym komponenty oddziałują ze sobą wyłącznie poprzez dyfuzję na powierzchni mieszania. Samozłożenie nanokompleksów DNA może być wówczas monitorowane dzięki połączeniu QD fret i mikroprzepływów.Witam, jestem Megan Ho z laboratorium biologii i dynamiki pojedynczych cząsteczek w Katedrze Inżynierii Mechanicznej na Uniwersytecie Johna Hopkinsa. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę łączącą kropki kwantowe i mikrofluidykę w celu monitorowania samomontażu kompleksów DNA-nanoliposom w czasie rzeczywistym. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania kompleksów DNNL pod kątem zastosowań w terapii genowej.Zacznijmy zatem. Zestaw do znakowania biotyną firmy MIRIs bio jest wykorzystywany do kowalencyjnego znakowania DNA z plazmy specyficznymi dla guaniny znacznikami biotyny, przy zachowaniu skali pozwalającej na uzyskanie około jednej do dwóch cząsteczek biotyny na cząsteczkę DNA. Aby rozpocząć, rozpuść odpowiednią ilość DNA z plazmy w buforze TE, aby przygotować roztwór DNA o stężeniu 1 µg/µL.Przygotuj reakcję znakowania, mieszając plazmidowe D-N-A-D-N-A, wodę wolną od nukleaz, 10 x bufor do znakowania A oraz odczynnik Label It. Odczynnik Label It dodaje się na samym końcu. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Po jednogodzinnej inkubacji oczyść znakowaną próbkę poprzez wytrącanie etanolem, zgodnie ze standardowymi protokołami. Przechowuj znakowane DNA w temperaturze -20 °C do momentu użycia.Kolejnym krokiem jest znakowanie polimeru jonowego. W tej demonstracji użyjemy chitosanu jako modelowego polimeru jonowego i znakujemy wolne aminy pierwszorzędowe w szkielecie polimeru chitosanowego za pomocą scifi NHS. Najpierw należy obliczyć wymaganą ilość scifi NHS tak, aby stosunek molowy scifi do amin pierwszorzędowych wynosił 1:200. Ułatwi to całkowite sprzężenie barwnika scifi.Do roztworu chitosanu w 25 mM buforze octanowym dodaj wodorotlenek sodu, aby dostosować pH do około 6.5 przy powolnym mieszaniu, a następnie kroplami dodaj obliczoną ilość sci-fi NHS do roztworu chitosanu. Przykryj fiolkę folią aluminiową, aby chronić mieszaninę przed światłem, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez noc, stale mieszając. Następnego dnia oczyść mieszaninę poprzez dializę przy użyciu membrany Pierce o MMWCO 10 kDa przeciwko 1% buforowi octanowemu przez dwie godziny w temperaturze pokojowej i w ciemności.Po dwóch godzinach należy wymienić bufor octanowy 1% i kontynuować dializę przez kolejne dwie godziny. W temperaturze pokojowej, w ciemności, ponownie wymienić bufor, a następnie prowadzić dializę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Następnego dnia wyjąć oczyszczony znakowany polimer z kasety dializacyjnej.Oznaczone pięcioma barwnikami SCI chitosan zbiera się następnie do probówki do mikrocentryfugi i przechowuje w temperaturze -20 °C. Do roztworu biotynylowanego plazmidowego DNA dodać kropki kwantowe 605 funkcjonalizowane streptawidyną. Należy upewnić się, że użyto kropki kwantowej z serii ITK w wersji sprzężonej, a nie zwykłej serii kropek kwantowych, ponieważ kropki kwantowe z serii ITK zostały zaprojektowane z myślą o FRET.Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Reakcję znakowania QD należy przeprowadzać w ciemności, aby zapobiec możliwemu fotoblaknięciu. Po 15 minutach dodać znakowane QD DNA do 50 millimolarnego roztworu siarczanu sodu, tak aby objętość końcowa wyniosła 200 microliters.Aby przygotować polimer sci-fi, należy obliczyć wymaganą ilość chitosan bezpośrednio dla 10 µg plazmowego DNA zgodnie z pożądanym stosunkiem NP, który jest teoretycznym stosunkiem protonowanych grup aminowych w roztworze chitosan do ujemnie naładowanych grup fosforanowych w roztworze DNA. Następnie rozcieńczyć chitosan sci-fi wodą Milli Q zgodnie z pożądanym stosunkiem NP, tak aby objętość końcowa wyniosła 200 µL. Roztwory DNA znakowanego QD oraz chitosan sci-fi są teraz gotowe do wprowadzenia do urządzenia mikrofluidycznego, co zostanie zaprezentowane w sekcji szóstej. Wafer krzemowy przygotowuje się wcześniej poprzez czyszczenie w roztworze piranha oraz wypalanie w celu usunięcia wilgoci z powierzchni wafera dla wyznaczonej grubości matrycy wynoszącej 25 µm. Nanieść negatywny fotorezyst na wafer krzemowy metodą spin-coatingu przy prędkości 2000 RPM przez 30 sekund.Wykonaj wstępne wypiekanie (soft bake) płytki na płycie grzejnej, zwiększając temperaturę w tempie 65 °C na godzinę aż do osiągnięcia 95 °C. Pozwoli to na odparowanie rozpuszczalnika z fotorezystu SU-8 i jego utwardzenie przed naświetlaniem światłem UV.Po wstępnym wypalaniu (soft baking) nałóż maskę z wzorem mikrokanałów na wafelek krzemowy i naświetl go światłem UV o długości fali 365 nanometrów z dawką 250 milidżuli na centymetr kwadratowy. Następnie wypal wafelek na płycie grzejnej, zwiększając temperaturę w tempie 65 stopni Celsjusza na godzinę aż do osiągnięcia 95 stopni Celsjusza. Wywo łaj wafelek, używając wywoływacza do fotorezystu SU-8, aby sprawdzić, czy proces wywoływania został zakończony.Zanurz wafelek w alkoholu izopropylowym. Alkohol izopropylowy nie powinien stać się mętny. Na koniec, aby utwardzić strukturę SU-8, przeprowadź wygrzewanie (hard bake) wzorowanego wafelka na płycie grzejnej, zwiększając temperaturę w tempie 65 °C na godzinę aż do osiągnięcia 200 °C.Utrzymuj wafelek w temperaturze 200 °C przez co najmniej pięć godzin. Następnie stopniowo ochłodź wafelek do temperatury pokojowej. Umieść matrycę SU-8 w łódzce wagowej.Wymieszaj elastomer silikonowy oraz czynnik sieciujący polidimetylosiloksan (PDMS) w stosunku 10:1. Wlej mieszaninę PDMS na matrycę SU-8 i pozostaw łódkę ważką w eksykatorze próżniowym w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Utwardzaj PDMS w temperaturze 65 °C przez jedną do dwóch godzin.Po utwardzeniu PDMS, oddziel pasek PDMS od silikonowej formy matki, używając dziurkacza do wykonania otworu wlotowego dla dwóch kanałów oraz otworu wylotowego dla jednego kanału w urządzeniu mikrofluidycznym. Oczyść pasek PDMS oraz szkiełko podstawowe etanolem, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Poddaj oczyszczony pasek PDMS i szkiełko podstawowe działaniu plazmy tlenowej przy mocy 20 W.Po pierwsze, należy niezwłocznie połączyć pasek PDMS ze szkiełkiem podstawowym. Połączony chip mikrofluidyczny pozostawić w piekarniku w temperaturze 95°C przez noc. Obróbka plazmą oraz wypalanie przez noc są niezbędne do zwiększenia wytrzymałości wiązania.Przed wprowadzeniem odczynników należy wypełnić kanał mikrofluidyczny wodą, aby upewnić się, że wewnątrz nie ma pęcherzyków powietrza. Zapewni to płynny przepływ. W trakcie eksperymentu należy wprowadzić wcześniej przygotowane roztwory QD, znakowanego DNA oraz znakowanego sci-fi chitosanem do dwóch oddzielnych szklanych strzykawek za pomocą przewodów.Podłącz rurki do dwóch wlotów urządzenia mikroprzepływowego. Należy zachować ostrożność, aby nie wprowadzić powietrza podczas tego procesu. Ustaw szybkość przepływu na 20 nanoliters per minute w warunkach przepływu laminarnego.Po ustabilizowaniu przepływu, po około 15 do 20 minutach, należy sprawdzić mikrokanały pod mikroskopem. W centrum kanału powinno być obserwowane zjawisko FRET pośredniczone przez kropki kwantowe (QD). Przy użyciu chłodzonej kamery CCD należy wykonać obrazy fluorescencyjne w różnych miejscach wzdłuż kanału.Przeanalizuj te obrazy za pomocą programów ImageJ oraz OriginLab. Sygnał pośredniczony przez FRET jest monitorowany w różnych pozycjach osiowych wzdłuż kanału. Czas przebywania jest obliczany na podstawie zastosowanej prędkości przepływu przy użyciu tego wzoru, w którym TISA bar oznacza czas przebywania.Czas X to odległość od miejsca spotkania dwóch strumieni do pozycji badanej reakcji, a V to średnia prędkość przepływu. W naszym systemie można następnie analizować poprzeczne profile intensywności sygnałów sci-fi pośredniczonych przez FRET.Profil pomierzony eksperymentalnie wykazuje rozkład Gaussa. Przedstawiliśmy sposób monitorowania kompleksów DNA nail za pomocą nici pośredniczącej kwantowo w prostym kanale mikroprzepływowym. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby zaprojektować znacznik na kanale mikroprzepływowym, tak aby czas przebywania mógł być wyliczony bezpośrednio na podstawie zastosowanego natężenia przepływu i geometrii kanału.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

combining-qd-fret-microfluidics-to-monitor-dna-nanocomplex-self

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Łączenie QD-FRET i mikrofluidyki do monitorowania samouzbrajanego się nanokompleksu DNA w czasie rzeczywistym

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Proponujemy prostą technikę samoorganizacji koloidalnych nanocząstek krzemionki w celu stworzenia nanofluidycznego połączenia między dwoma mikrokanałami w polidimetylosiloksanie (PDMS). Korzystając z tej techniki, nanoporowatą membranę perełkową o wielkości porów do ~45 nm wbudowano w mikrokanał i zastosowano do elektrokinetycznego wstępnego zagęszczenia próbek DNA.

Tworzenie połączeń nanofluidycznych poniżej 50 nm w chipie mikroprzepływowym PDMS poprzez proces samoorganizacji cząstek koloidalnych

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Tutaj opisujemy użycie metody obrazowania pojedynczych cząsteczek, Zasłon DNA, do badania biofizycznego mechanizmu gromadzenia się kondensatów EWS-FLI1 na DNA.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Poznaj metodę monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym przy użyciu QD-FRET i mikrofluidyki. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę formowania polielektrolitowych polipleksów dla zastosowań w terapii genowej.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów