Name: Izolacja i manipulacja genetyczna dorosłych miocytów serca do obrazowania konfokalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj izolację i hodowlę dorosłych miocytów serca szczura z wykorzystaniem transferu genów adenowirusowych do ekspresji białek fluorescencyjnych. Ta metoda umożliwia szczegółowe badania biologii komórek serca przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez Niemiecką Narodową Fundację Naukową (DFG) oraz Federalny Instytut Oceny Ryzyka (BfR, Niemcy).

<ol><li>Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Molecular+Imaging+II%22">Molecular Imaging II</a>. Licha, K., Lin, C. P. Vol. 7370, SPIE. Bellingham. 737008-737008 (2009).</li>
<li>Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).</li>
<li>Shorte, S. L., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22">Imaging Cellular and Molecular Biological Functions</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 289-289 (2007).</li>
<li>Kaestner, L., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Optics+in+Life+Science%22">Optics in Life Science</a>. Popp, J., von Bally, G. Vol. 6633, SPIE. Munich. 66330K-66330K (2007).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).</li>
</ol>

Opisaną procedurę izolacji kardiomiocytów szczura można w razie potrzeby dostosować do innych gatunków, np. myszy4. Parametrem wymagającym dostosowania jest mieszanina enzymów do trawienia (patrz poniżej), a także czas trwania tego procesu. Należy pamiętać, że komórki niektórych gatunków (np. myszy) mogą być bardziej delikatne niż komórki innych (np. szczura).
Wybór kolagenazy jest prawdopodobnie najważniejszym etapem procedury izolacji. Wybieramy Liberase Blendzyme, ponieważ jest ...

<table><tbody><tr><td>Roztwór znieczulający</td><td>Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)</td><td></td><td>Mieszanina 1 ml Ursotamin (100 mg/ml chlorowodorku ketaminy) i 240 &amp;#x03BC;Rompun (2% chlorowodorek ksylazyny)</td></tr><tr><td>Roztwór cytrynianu</td><td></td><td></td><td>117,64 mg cytrynianu sodu w 10 ml 0,9% roztworu NaCl</td></tr><tr><td>Roztwór A</td><td></td><td></td><td>134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glukozy, 1,2 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,2 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 10 mM HEPES, pH skorygowane do 7,35 przy użyciu 10 M NaOH, filtrowane sterylnie</td></tr><tr><td>Roztwór A+</td><td></td><td></td><td>Zawartość roztworu A oraz 0,2 mM EGTA, pH skorygowane do 7,35 przy użyciu 10 M NaOH, przefiltrowane sterylnie</td></tr><tr><td>roztwór Liberase</td><td>F. Hoffmann&amp;#8208; La Roche Ltd.</td><td>11988476 001</td><td>500 &amp;#x03BC;roztwór zapasowy w 15 ml roztworu A (roztwór zapasowy: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 w wodzie destylowanej)</td></tr><tr><td>Roztwór B</td><td></td><td></td><td>Zawartość roztworu A plus 200 &amp;#x03BC;M CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; oraz 0,1% roztwór DNazy</td></tr><tr><td>Roztwór B&lt;sub&gt;1/2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>mieszanina roztworu A i roztworu B w stosunku 1:1</td></tr><tr><td>roztwór DNazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>Deoksiribonukleazę I, typ 2 z trzustki bydlęcej, 40 KU (15 mg) rozpuszcza się w 5 ml 10 mM Tris&amp;#8208;bufor HCl, z pH dostrojonym do 7,35, dodatkowa zawartość: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM ditiotreitolu&amp;#8211;erytrytol; roztwór ten miesza się z 5 ml glicerolu</td></tr><tr><td>Roztwór białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)</td><td>Roztwór białek macierzy pozakomórkowej (ECM)</td><td>E1270</td><td>1 ml roztworu zapasowego w postaci zakupionej rozcieńcza się w 6 ml pożywki M199</td></tr><tr><td>Pożywka M199</td><td>Laboratoria PAA</td><td>E15&amp;#8208;834</td><td>Pożywka M199 uzupełniona o 1 &amp;#x03BC;roztwór ITS l/ml oraz 20 &amp;#x03BC;l/ml penicyliny&amp;#8208;roztwór streptomycyny (5000 jednostek/ml)</td></tr><tr><td>roztwór ITS</td><td></td><td></td><td>25 mg insuliny, 25 mg transferyny i 50 &amp;#x03BC;Roztwór zapasu selenitu rozpuszcza się w 5 ml wody destylowanej (roztwór zapasu: 0,5 mg/ml selenitu sodu w wodzie destylowanej). Należy dodać kilka kropel 1 M HCl, aż do uzyskania klarownego roztworu. Alikwoty można mrozić.</td></tr><tr><td>roztwór Tyrode'a</td><td></td><td></td><td>135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, pH skorygowane do 7,35 przy użyciu 10 M NaOH, filtrowane sterylnie</td></tr><tr><td>Mieszanina główna</td><td></td><td></td><td>5 &amp;#x03BC;l 10&amp;#215;PCR&amp;#8208;Bufor, 5 &amp;#x03BC;l MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25 mM), 2 &amp;#x03BC;starter forward l, 2 &amp;#x03BC;odwrócony primer l, 1 &amp;#x03BC;1 μL dNTP&amp;#180;s (po 10 mM), 33 &amp;#x03BC;l H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1 &amp;#x03BC;l DMSO, 1 &amp;#x03BC;l Taq&amp;#8208;polimeraza DNA dla każdej próbki</td></tr><tr><td>LB&amp;#8208;Pożywka</td><td></td><td></td><td>10 g/l tryptony, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl (oraz 15 g/l agaru, jeśli stosowane jako pożywka stała), pH 7,0</td></tr><tr><td>Pac I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547L</td><td>przygotowanie: 50 &amp;#x03BC;g DNA, 5 &amp;#x03BC;l 10&amp;#215;bufor, 0,5 &amp;#x03BC;l 100&amp;#215;BSA, 0,75 &amp;#x03BC;w Pac I, napełnić H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;do uzyskania objętości końcowej 50&amp;#x03BC;l</td></tr></tbody></table>

izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Kardiomiocyty izolowane z serc dorosłych osobników są powszechnie uznawane za model stanowiący stadium pośrednie pomiędzy komórkami mięśniowymi zarodkowymi i noworodkowymi a funkcjonującym sercem. W związku z tym kardiomiocyty służą jako dobre modele fizjologii i patofizjologii komórkowej serca, badań farmakologicznych, a także analiz modeli zwierząt transgenicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji tych komórek z serca. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób można przeprowadzić manipulację genetyczną kardiomiocytów bez konieczności hodowli zwierząt transgenicznych: jest to połączenie długoterminowej hodowli (1 tydzień) i adenowirusowego transferu genów. Ten ostatni proces opisano od etapu konstrukcji wirusa po transdukcję komórek. Metoda ta może być wykorzystana do ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEBs), fluorescencyjnych białek fuzyjnych, a także do nadekspresji i wyciszania białek, np. z wykorzystaniem RNAi. Przedstawiamy tutaj przykład ekspresji białka fuzyjnego barwiącego strukturę subkomórkową (aparat Golgiego). Ekspresję takiego białka można zwizualizować za pomocą obrazowania konfokalnego stosów z-stack w celu rekonstrukcji 3D struktur subkomórkowych. Protokół obejmuje najnowocześniejsze techniki z zakresu hodowli komórkowej, biologii molekularnej i biofizyki, dostarczając tym samym podejścia pozwalającego na eksplorację nowych horyzontów w kardiologii komórkowej.

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Kardiomiocyty izolowane z serc osobników dorosłych są powszechnie uznawane za model stanowiący swoisty poziom pośredni między komórkami mięśniowymi w stadium embrionalnym i noworodkowym z jednej strony, a...

Procedura rozpoczyna się od pobrania serca od dorosłych szczurów. Serce zostaje poddane trawieniu, a następnie izolowane są pojedyncze kardiomiocyty. Izolowane komórki są hodowane.Adenowirusowy transfer genów prowadzi do ekspresji fluorescencyjnych białek fuzyjnych lub genetycznie kodowanych biosensorów; kardiomiocyty wykazujące ekspresję białka reporterowego są wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, a następnie poddawane dalszej analizie. Cześć, jestem Kain z Instytutu Biologii Molekularnej Komórki na wydziale medycznym Uniwersytetu w Sland. Jestem Lars, również z Instytutu Biologii Molekularnej Komórki, a ja jestem Uncle z tego samego laboratorium.Dzisiaj przedstawimy procedurę izolacji miocytów serca, transdukcji białkami fuzyjnymi z markerami fluorescencyjnymi lub genetycznie kodowanymi biosensorami oraz poprzedzającą je procedurę obrazowania konfokalnego. Stosujemy tę metodę w naszym laboratorium do badania fizjologii, patofizjologii i farmakologii serca na poziomie komórkowym. Zapraszamy do oglądania.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować układ do perfuzji LOR, przygotować i uzupełnić wszystkie roztwory oraz rozgrzać urządzenia do 37 °C. Należy upewnić się,

isolation-genetic-manipulation-adult-cardiac-myocytes-for-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i manipulacja genetyczna dorosłych miocytów sercowych do obrazowania konfokalnego

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

W miocytach serca struktury błony kanalikowej tworzą sieci wewnątrzkomórkowe. Opisujemy zoptymalizowane protokoły i) izolacji miocytów z serca myszy, w tym kontroli jakości, ii) barwienia żywych komórek do najnowocześniejszej mikroskopii fluorescencyjnej oraz iii) bezpośredniej analizy obrazu w celu ilościowego określenia złożoności składników i plastyczności sieci błon wewnątrzkomórkowych.

Analiza sieci błon rurkowych w miocytach serca z przedsionków i komór

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Celem tej pracy jest opracowanie metody powtarzalnego izolowania kardiomiocytów od serca dorosłego człowieka oraz mierzenia zawartości DNA i zarodkowania.

Izolacja kardiomiocytów ze stałych serc do analizy immunocytochemicznej i ploidalnej

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Poznaj izolację i hodowlę dorosłych miocytów serca szczura z wykorzystaniem transferu genów adenowirusowych do ekspresji białek fluorescencyjnych. Ta metoda umożliwia szczegółowe badania biologii komórek serca przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Przeglądaj więcej filmów