Name: Denaturacja elektroforezy w żelu poliakryloamidowym mocznika (Urea PAGE) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Naucz się denaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z mocznikiem do separacji jednoniciowych DNA i RNA. Ta metoda biochemiczna umożliwia analizę oligonukleotydów i produktów reakcji enzymatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez Singapurską Radę Badań Akademickich (ARC) [grant nr 90/07]. Dziękujemy firmie Radiodurans za wsparcie.

Pełny i szczegółowy protokół tekstowy dla tej procedury eksperymentalnej jest dostępny w Current Protocols in Molecular Biology. Szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące montażu kanapki żelowej oraz urządzenia do elektroforezy można znaleźć na stronie internetowej BioRad 3.
Wymagany sprzęt: 
 Płytki szklane (wewnętrzna i zewnętrzna) 
 Kuweta 10 cm: 10,1 x 7,3 cm (płytka wewnętrzna), 10,1 x 8,2 cm (płytka zewnętrzna), BioRad 
 Kuweta 20 cm: 20 x 20 cm (płytka wewnętrzna), 20 x 22,3 cm (płytka zewnętrzna), BioRad 
 Grzebień do żelu 0,5-1,5 mm i dystanse 
 Statyw do odlewania żelu 
 Aparat do elektroforezy z pokrywą i przewodami 
 Zasilacz wysokiego napięcia 
 Blok grzejny lub kąpiel wodna 
 Pipety serologiczne i kontroler pipet (Pipette aid) 
 Pipety i końcówki do pipet 
 Suszarka do żeli lub skaner
Odczynniki i roztwory: 
 Mocznik (ultraczysty) 
 40% roztwór poliakryloamidu (29:1) 
 10 x roztwór TBE (bufor Tris-Borate, EDTA) 
 Woda dejonizowana, destylowana 
 TEMED 
 30% (w/v) roztwór persiarczanu amonu 
 0,5 x roztwór TBE 
 Formamid 
 EDTA 
 Błękit ksylenowy 
 Błękit bromofenolowy 
 Metanol 
 Etanol
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>Objętość</td>
 <td colspan="3" style="text-align:center;">50 ml</td>
 <td colspan="3" style="text-align:center;">60 ml</td>
 <td colspan="3" style="text-align:center;">10 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stężenie akrylamidu</td>
 <td>10%</td>
 <td>12,5%</td>
 <td>15%</td>
 <td>10%</td>
 <td>12,5%</td>
 <td>15%</td>
 <td>10%</td>
 <td>12,5%</td>
 <td>15%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>g mocznika</td>
 <td>24</td>
 <td>24</td>
 <td>24</td>
 <td>28,8</td>
 <td>28,8</td>
 <td>28,8</td>
 <td>4,8</td>
 <td>4,8</td>
 <td>4,8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ml 40% akrylamidu (29:1)</td>
 <td>12,5</td>
 <td>15,625</td>
 <td>18,75</td>
 <td>15</td>
 <td>18,75</td>
 <td>22,5</td>
 <td>2,5</td>
 <td>3,125</td>
 <td>3,75</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>µL 30% APS</td>
 <td>166</td>
 <td>166</td>
 <td>166</td>
 <td>199,2</td>
 <td>199,2</td>
 <td>199,2</td>
 <td>33</td>
 <td>33</td>
 <td>33</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>µL TEMED</td>
 <td>20</td>
 <td>20</td>
 <td>20</td>
 <td>24</td>
 <td>24</td>
 <td>24</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x TBE</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>6</td>
 <td>6</td>
 <td>6</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="10">Uzupełnić objętość dejonizowaną wodą destylowaną</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 1: Odczynniki i roztwory potrzebne dla różnych stężeń i objętości akrylamidu do rozdziału jednoniciowych oligonukleotydów
Przygotowanie „kanapki” żelowej i przygotowanie żelu
<ol>
<li>Złóż żel zgodnie z opisem producenta i zamocuj go w komorze do odlewania żelu 3. Użyj dystanserów o grubości 0,5-1,5 mm.</li>
<li>Przygotuj odpowiedni roztwór poliakrylamidu zgodnie z aktualnymi protokołami biologii molekularnej lub według danych w Tabeli 1. W przypadku denaturującego żelu akrylamidowego o wymiarach 20 cm x 22 cm x 1,5 mm wystarczy 60 ml roztworu żelu, a dla żelu 10,1 x 8,2 cm x 1 mm wystarczy 5 ml roztworu żelu. Większe żele stosuje się, gdy spodziewane produkty/prążki mieszczą się w zakresie kilku zasad; wtedy dłuższy żel pozwoli rozdzielić prążki różniące się pojedynczym nukleotydem. Jeśli spodziewane prążki różnią się o więcej niż 10 nukleotydów, do rozdzielenia fragmentów odpowiednie będą mniejsze żele. Wybierz procentowe stężenie poliakrylamidu dostosowane do wymagań rozdzielczości; wyższe stężenia poliakrylamidu pozwolą rozdzielić fragmenty o niższej masie cząsteczkowej. Użyj ultrapure urea i wymieszaj z żądaną ilością akrylamidu. Dodaj bufor TBE do mieszaniny żelu, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5-1 x TBE, a objętość uzupełnij dejonizowaną wodą destylowaną. Podgrzewaj roztwór przez 20 sekund w mikrofalówce i delikatnie wymieszaj. W przypadku większych objętości żelu powtarzaj ten krok, aż roztwór osiągnie temperaturę letnią.</li>
<li>Niezwłocznie wlej żel między dwie szklane płytki, używając pipety serologicznej i automatycznego kontrolera pipet. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Włóż grzebień i pozostaw żel do polimeryzacji na 30-60 minut.</li>
</ol>
Przygotuj aparat do elektroforezy i przeprowadź przebieg wstępny żelu
<ol>
<li>Wyjmij żel z komory odlewniczej i zamontuj go w aparaturze do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta 3.</li>
<li>Wypełnij dolną komorę buforową buforem do elektroforezy (0.5-1 x TBE) w taki sposób, aby płyty szklane były zanurzone w buforze na głębokość 2-3 cm. Wypełnij górną komorę buforową buforem do elektroforezy do górnej krawędzi żelu.</li>
<li>Ostrożnie wyjmij grzebień i wypłucz dołki buforem do elektroforezy, używając pipety i końcówek do nakładania próbek na żel.</li>
<li>Zamknij pokrywę systemu elektroforetycznego i podłącz kable do zasilacza wysokiego napięcia. Przed nałożeniem próbek należy przeprowadzić wstępny rozbieg żelu przez co najmniej 30 minut, aby go podgrzać i usunąć pozostały w żelu mocznik. Optymalna temperatura powinna wynosić od 45-55 °C. Należy unikać temperatur przekraczających 60 °C, ponieważ może to spowodować rozmycie prążków lub pęknięcie płyt szklanych. Dla wstępnego rozbiegu wybierz stałą moc (15-25 W na żel).</li>
</ol>
Przygotowanie próbek
<ol>
<li>W międzyczasie przygotuj próbki. W tym celu dodaj odpowiednią ilość 2 x mieszaniny do ładowania żelu do swojej próbki. Mieszanina do ładowania zazwyczaj zawiera 90% formamidu, 0,5% EDTA, 0,1% ksylenocyjanolu i 0,1% błękitu bromofenolowego.</li>
<li>Przed naniesieniem próbek na żel muszą one zostać poddane denaturacji termicznej poprzez podgrzewanie w temperaturze 70-90 °C przez kilka minut.</li>
</ol>
Załaduj i przeprowadź elektroforezę żelu
<ol>
<li>Po zakończeniu wstępnego przebiegu (prerun) zdejmij pokrywkę i dokładnie wypłucz kieszenie zgodnie z wcześniejszym opisem, ponieważ mocznik przeniknął do studzienek.</li>
<li>Ostrożnie nanieś próbki od dna kieszeni. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Do pustych kieszeni należy nanieść bufor do ładowania, aby zachować jednakowe warunki podczas elektroforezy.</li>
<li>Zamontuj pokrywkę i prowadź elektroforezę przy stałej mocy, aby utrzymać temperaturę żelu na poziomie 55 °C, analogicznie do etapu prerunu. Obserwuj migrację barwników markerowych, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu. Czas trwania przebiegu zależy od stężenia użytego akrylamidu, siły jonowej buforu oraz grubości żelu. Przebieg może trwać od 2 do 4 godzin. 
 Kontroluj temperaturę żelu. W celu monitorowania właściwej temperatury podczas elektroforezy można posłużyć się termometrem do żeli.</li>
 </ol>
Przetwórz żel
<ol>
<li>Gdy czoło barwnika dotrze do końca żelu, wyjmij żel z dolnej komory z buforem. Wyjmij żel z komory i poluzuj zaciski. Usuń dystansery i ostrożnie rozdziel płyty szklane. W razie potrzeby odetnij górną część żelu zawierającą dołki.</li>
<li>Ostrożnie przenieś żel do naczynia z roztworem do fiksacji żelu (ten sam stężenie TBE plus 5-10% Methanol i Ethanol). Pozostaw żel w roztworze na 5-10 minut i dwukrotnie wymień bufor.</li>
<li>Żel jest gotowy do dalszej obróbki przy użyciu próżniowej suszarki do żeli lub bezpośredniego skanowania żelu.</li>
</ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

<ol>
<li>Ostrość prążków zależy od kilku czynników. Aby uzyskać ostre prążki, objętość naniesionej próbki powinna być jak najmniejsza, idealnie w zakresie 1-5 μl. Można jednak nanieść do 15 μl, co nadal zapewnia akceptowalną rozdzielczość. Mniejsza objętość próbki skutkuje ostrzejszymi prążkami.</li>
<li>Jakość prążków zależy również od grubości żelu. Cieńsze żele, np. 0,75 mm, dają lepsze wyniki niż żele o grubości 1,5 mm.</li>
<li>Na kształt prążków może wpływać sposób nakładania próbki, jeśli nie zostanie ona równomiernie wprowadzona do oczk...

denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (urea page)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE) lub denaturująca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym wykorzystuje 6-8 M mocznika, który denaturuje drugorzędowe struktury DNA lub RNA i służy do ich rozdzielania w macierzy żelu poliakrylamidowego na podstawie masy cząsteczkowej. Metodą tą można rozdzielić fragmenty o długości od 2 do 500 zasad, przy różnicach w długości wynoszących nawet pojedynczy nukleotyd1. Migracja próbki zależy od wybranej koncentracji akrylamidu. Wyższy procent poliakrylamidu pozwala na rozdzielenie fragmentów o niższej masie cząsteczkowej. Połączenie mocznika i temperatury 45-55 °C podczas prowadzenia elektroforezy umożliwia rozdzielenie nieustrukturyzowanych cząsteczek DNA lub RNA.
Ogólnie metoda ta jest wymagana do analizy lub oczyszczania fragmentów jednoniciowego DNA lub RNA, takich jak syntetyzowane lub znakowane oligonukleotydy lub produkty reakcji cięcia enzymatycznego.
W niniejszym artykule wideo pokazujemy, jak przygotować i przeprowadzić elektroforezę w denaturujących żelach poliakryloamidowych z mocznikiem. Oprócz oryginalnego protokołu 1,2 zamieszczono również wskazówki techniczne.

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika jest stosowana do rozdzielania jednoniciowego DNA lub RNA o długości do 500 nukleotydów. Mocznik w połączeniu z ciepłem denaturuje próbki, a nieustrukturyzowane pojedyncze nici migrują wewnątrz matrycy żelowej zgodnie z ich masą cząsteczkową.

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE)

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z mocznikiem (Urea PAGE) lub denaturująca elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z mocznikiem wykorzystuje stężenie mocznika 6–8 M, który denaturuje drugorzędowe struktury DNA lub RNA i jest stosowany do ich...

Ogólnie tego typu żele są wymagane do rozdzielania jednoniciowych fragmentów DNA lub RNA, takich jak syntetyzowane lub znakowane oligonukleotydy bądź produkty reakcji cięcia enzymatycznego. Zakres rozdzielania zależy od stężenia poliamidu; mocznik w połączeniu z denaturacją termiczną próbek sprawia, że jednoniciowe cząsteczki migrują w macierzy żelowej zgodnie z ich masą cząsteczkową. W niniejszym filmie przedstawiono sposób przygotowania, prowadzenia oraz analizy typowego żelu.Witajcie, nazywam się Haki i reprezentuję Nanyang Technological University. W tej demonstracji pokażę Państwu, jak przeprowadzić denaturującą elektroforezę w żelu poliakrylamidowym.Należy użyć czystych szklanych płytek i złożyć kanapkę żelową zgodnie z opisem producenta. Żel należy przymocować w standardowej komorze do odlewania żeli. W przypadku dużych żeli, które mają tendencję do przywierania do szklanych płytek, należy je zaimpregnować.Wybierz rozmiar i grubość żelu zgodnie z wymaganiami dotyczącymi rozdzielania. Przygotuj roztwór żelu zgodnie z aktualnymi protokołami w biologii molekularnej.Wybierz stężenie poliamidu odpowiednie do wymagań dotyczących rozdziału. Wyższy procent akryloamidu pozwoli na lep

denaturing-urea-polyacrylamide-gel-electrophoresis-urea-page

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Denaturująca elektroforeza na żelu poliakryloamidowym z mocznikiem (Urea PAGE)

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

W tym filmie demonstrujemy elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do denaturacji w celu oddzielenia fosforylowanych gatunków RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników. Gatunki RNA są znakowane fluorescencyjnie w celu detekcji laserowej na żelu.

Denaturacja elektroforezy w żelu poliakryloamidowym mocznika do analizy RNA: technika oddzielania fluorescencyjnie znakowanych fosforylowanych oligonukleotydów RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Ten protokół wykorzystuje zarówno koekspresję podjednostek, jak i mieszanie podjednostek postlizy w celu dokładniejszego zbadania złożenia rekombinowanego proteasomu.

Badanie składania proteasomu za pomocą rekombinowanych proteasomów archeonów i niedenaturujących PAGE: Argumenty przemawiające za podejściem łączonym

Tutaj prezentujemy czułą, szybką i dyskryminującą metodę barwienia po żelu do obrazowania RNA oznaczonych aptamerami RNA Mango I, II, III lub IV, przy użyciu natywnych lub denaturujących żeli do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Po uruchomieniu standardowych żeli PAGE, RNA znakowane mango można łatwo wybarwić TO1-Biotyną, a następnie przeanalizować za pomocą powszechnie dostępnych czytników fluorescencji.

Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu

Elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym (DGGE)

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Naucz się denaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z mocznikiem do separacji jednoniciowych DNA i RNA. Ta metoda biochemiczna umożliwia analizę oligonukleotydów i produktów reakcji enzymatycznych.

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE)

Przeglądaj więcej filmów