Name: Skalowalne układy wtryskiwaczy płynów do celowania w wirusy w nienaruszone obwody mózgowe 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Poznaj metodę równoległego wstrzykiwania wirusów do mózgu za pomocą skalowalnego układu wtryskiwaczy płynów. Technologia ta umożliwia precyzyjną manipulację optyczną obwodów nerwowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ESB potwierdza finansowanie z NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD002002-01), NIH Challenge Grant 1RC1MH088182-01, NIH Grand Opportunities Grant 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0835878 i 0848804), McGovern Institute Neurotechnology Award Program, Departamentu Obrony, NARSAD, Alfred P. Sloan Foundation, Jerry i Marge Burnett, SFN Research Award for Innovation in Neuroscience, MIT Media Lab, Benesse Foundation oraz Wallace H. Coulter Foundation.

1. Konstrukcja zacisku stereotaktycznego
<ol>
 <li>Zacisk stereotaktyczny służy do mocowania zestawu injektorów do stereotaksu, tak aby injektory były równoległe do ramienia stereotaktycznego.</li>
 <li>Każde laboratorium potrzebuje tylko jednego zacisku, chyba że przewiduje się, że więcej niż jedna operacja może odbywać się jednocześnie. W takim przypadku należy wykonać tyle sztuk, ile wynosi przewidywana maksymalna liczba jednoczesnych operacji. Można również wykonać dodatkowy egzemplarz na wypadek uszkodzenia pierwszego.</li>
 <li>Aby wykonać zacisk stereotaktyczny, najpierw stalową kaniulę o średnicy zewnętrznej (OD) 1,5 mm należy przyciąć do długości 2 cali, a jeden z końców oszlifować narzędziem typu Dremel, aż będzie płaski.</li>
 <li>Następnie z płytki prototypowej PCB należy wyciąć mały kawałek (około 0,5 x 0,5 cm), który posłuży jako odstępnik.</li>
 <li>Używając wycinarki laserowej, aby zapewnić, że wszystkie cięcia są prostopadłe do powierzchni materiału, z arkusza akrylowego o grubości 1/8" należy wyciąć dwa identyczne prostokąty (1/2" x 3/8"), z których każdy posiada dwa okrągłe otwory w przeciwległych narożnikach. Pierwszy otwór ma średnicę 1,5 mm i jest na tyle duży, aby ciasno trzymać metalową kaniulę. Drugi otwór ma średnicę 1/16" (Rysunek 1C).</li>
 <li>Metalową kaniulę wkłada się do otworu 1,5 mm w jednym prostokącie, a następnie przez otwór 1,5 mm w drugim. Dolny koniec kaniuli należy wyrównać z dolną powierzchnią dolnego prostokąta, nadając konstrukcji kształt kija hokejowego.</li>
 <li>Trzymając odstępnik ciasno między dwoma prostokątami, strukturę tę skleja się za pomocą kleju na gorąco wokół kaniuli i otworów 1,5 mm, uważając, aby nie przykleić odstępnika do prostokątów. Plastelina może być pomocna w utrzymaniu elementów razem podczas tego procesu.</li>
 <li>Po wyschnięciu kleju, od górnej strony prostokątów do otworu 1/16" wprowadza się śrubę 1-72. Następnie na koniec śruby 1-72 nakręca się nakrętkę sześciokątną 1-72 i dokręca ją. Śruba i nakrętka służą do utrzymania zacisku w całości.</li>
 <li>Aby przymocować nakrętkę sześciokątną do dolnej powierzchni dolnego prostokąta, wokół krawędzi nakrętki nanosi się niewielkie ilości 5-minutowej żywicy epoksydowej, nie dopuszczając do dostania się żywicy do gwintów nakrętki lub śruby. Usuwa się wszelką plastelinę i sprawdza, czy odstępnik może być mocno utrzymywany na miejscu poprzez dokręcenie śruby.</li>
</ol>
2. Przygotowanie systemu do spersonalizowanego układu wtryskiwaczy: pompa Hamiltona i stereotaks
<ol>
 <li>System matrycy injektorów można dostosować do niemal dowolnego zestawu współrzędnych w mózgu.</li>
 <li>Użytkownik najpierw lokalizuje współrzędne wybranych miejsc iniekcji w atlasie mózgu myszy (lub innego gatunku), przeliczając je na odpowiednie współrzędne używane przez stereotaks (w tym przypadku współrzędne X, Y i Z). Liczba miejsc iniekcji (trzy na rycinach 1A i 1B) będzie w dalszej części określana jako k.</li>
 <li>k strzykawek Hamiltona o pojemności 10 μl umieszcza się w pompie strzykawkowej do iniekcji/wycofywania, takiej jak ta firmy Harvard Apparatus.</li>
 <li>Następnie do igły każdej strzykawki Hamiltona bezpiecznie mocuje się 3-stopowe odcinki rurki polietylenowej.</li>
 <li>Na wolny koniec każdego odcinka rurki polietylenowej nasuwa się tuleję rurki F-252 firmy Upchurch Scientific i mocuje ją do adaptera rurki P-627 za pomocą dołączonej nakrętki i pierścienia zaciskowego, również firmy Upchurch Scientific.</li>
</ol>
3. Konstrukcja dostosowanego układu wtryskiwaczy
<ol>
 <li>Każda matryca wstrzykiwaczy jest dostosowana do zestawu współrzędnych wybranych przez użytkownika. Jednakże, w przypadku zestawów współrzędnych różniących się jedynie przesunięciem i/lub obrotem, można zastosować tę samą matrycę wstrzykiwaczy.</li>
 <li>Biorąc pod uwagę wyłącznie względne współrzędne X i Y miejsc wstrzykiwania, w płytce prototypowej PCB o grubości 1/32" wierci się k otworów z zachowaniem tych samych względnych odstępów. Otwory te są wiercone przy użyciu mini-frezarki Modela oraz wiertła o średnicy .011" z firmy Mcmaster-Carr. Należy pamiętać o zastosowaniu wolnej prędkości wiercenia (prędkość Z), aby uniknąć złamania lub zużycia wiertła. Przed zdjęciem płytki z frezarki, wokół małych otworów wierci się prostokąt, używając większego wiertła o średnicy 1/32", aby uniknąć zużycia mniejszego wiertła. Kod dla mini-frezarki można łatwo wygenerować za pomocą programu MATLAB; przykładowy kod znajduje się w następujących plikach:
 <ol class="lroman">
 <li>generate.m - kod MATLAB do generowania kodu Modela z pożądanych współrzędnych</li>
 <li>holes_ex.rml - kod Modela do wiercenia wzoru pierścieniowego (osiem otworów) w płytce prototypowej</li>
 <li>outline_ex.rml - kod Modela do wiercenia prostokąta wokół otworów</li>
 </ol></li>
 <li>Kapilary z topionego szkła kwarcowego o średnicy zewnętrznej (OD) 245 μm i średnicy wewnętrznej (ID) 100 μm, dostępne w firmie Polymicro Technologies, są cięte na k odcinków o długości 3 cali. Stanowią one poszczególne wstrzykiwacze. Przez każdy z otworów przebija się jednorazowy odcinek kapilary, aby usunąć zanieczyszczenia bez zatykania właściwych wstrzykiwaczy. Następnie wstrzykiwacze wprowadza się do połowy w każdy otwór, tak aby były mocno osadzone i równoległe względem siebie. Wstrzykiwacze są przyklejane do płytki żywicą epoksydową, tworząc strukturę matrycy wstrzykiwaczy. Pozostaje jedynie przycięcie wstrzykiwaczy do odpowiedniej długości.</li>
 <li>Matrycę wstrzykiwaczy mocuje się do zacisku stereotaksycznego, umieszczając jeden róg płytki prototypowej pomiędzy akrylowymi prostokątami, a następnie dokręcając śrubę zacisku stereotaksycznego. Następnie metalową kaniulę zacisku mocuje się do aparatu stereotaksycznego za pomocą mechanizmu mocującego aparatu.</li>
 <li>Wszystkie poniższe czynności wykonuje się pod mikroskopem. W przypadku jednego z zewnętrznych wstrzykiwaczy (czyli takiego, do którego można podejść od boku krawędzią prostą, nie uderzając w żadne z pozostałych wstrzykiwaczy), końcówkę wystającą poza dół płytki prototypowej odcina się nożyczkami. W przypadku wstrzykiwań do kory odpowiednio jest, gdy wstrzykiwacz wystaje około 5mm ponad powierzchnię płytki prototypowej. W przypadku głębszych wstrzykiwań wartość tę można zwiększyć o odpowiadający przyrost głębokości. Końcówkę wyrównuje się narzędziem Dremel. Końcówki wstrzykiwaczy można również szlifować pod kątem jako dodatkową ostrożność przed zapchaniem, jeśli precyzja głębokości jest mniej istotna.</li>
 <li>Następnie w zasięgu ramienia stereotaksycznego wybiera się stabilny punkt odniesienia i przesuwa matrycę wstrzykiwaczy tak, aby wyrównana końcówka zewnętrznego wstrzykiwacza znajdowała się w tym punkcie odniesienia.</li>
 <li>Wybiera się drugi wstrzykiwacz wraz z jego odpowiednimi współrzędnymi. Bierze się pod uwagę względną różnicę wysokości (kierunek z) pomiędzy współrzędnymi pierwszego i drugiego wstrzykiwacza. Matrycę wstrzykiwaczy przesuwa się wzdłuż osi Z o tę względną odległość. Drugi wstrzykiwacz jest przycinany i wyrównywany narzędziem Dremel do odpowiedniej długości, tak aby końcówka drugiego wstrzykiwacza była teraz płaska i znajdowała się na wysokości punktu odniesienia. Matrycę wstrzykiwaczy można przesuwać w kierunkach X i Y, aby ułatwić porównanie końcówki wstrzykiwacza z punktem odniesienia.</li>
 <li>Proces przycinania jest powtarzany dla pozostałych wstrzykiwaczy.</li>
</ol>
4. Montaż całego układu
<ol>
 <li>Do tej części wymagane są zacisk stereotaktyczny oraz spersonalizowany zestaw injektorów, które zostały już wcześniej przygotowane.</li>
 <li>Tylny koniec każdego injektora (koniec nieprzycięty) wprowadza się do niebieskiej tulei rurki F-240, a następnie, używając nakrętki P-235 i pierścienia P-200 firmy Upchurch Scientific, mocuje go do gwintowanego adaptera połączonego z pompą Hamilton za pomocą rurek polietylenowych. Szczegóły można znaleźć w instrukcjach producenta.</li>
 <li>Za pomocą igły 27G do tylnej części strzykawek Hamilton wstrzykuje się olej silikonowy w taki sposób, aby cały układ – od strzykawki Hamilton do końcówki injektora – był całkowicie wypełniony, bez żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Podczas ponownego umieszczania strzykawek Hamilton w pompie Hamilton należy zachować w nich jak największą objętość oleju silikonowego.</li>
 <li>Jeśli eksperyment wymaga większej liczby strzykawek, niż przewidziano w pompie (w tym przypadku dwie), można zastosować małe elementy plastikowe (np. nasadki do igieł) jako dystanse, aby utrzymać strzykawki równolegle względem siebie i zapewnić, że wszystkie elementy będą pchane przez pompę w tym samym stopniu. Alternatywnie można zakupić u dostawcy Harvard Apparatus zestaw rozszerzeń do wielu racków, który pozwala na jednoczesne umieszczenie do 10 strzykawek.</li>
</ol>
5. Iniekcje/operacja
<ol>
 <li>Proces wstrzykiwania za pomocą injektora równoległego jest bardzo podobny do wstrzykiwania za pomocą pojedynczej pipety.</li>
 <li>Niezbędne jest stosowanie wolnych prędkości napełniania/infuzji przez cały ten proces, ponieważ szybkie pompowanie może obciążyć połączenie między rurką dużą a małą. Zalecana maksymalna prędkość: 2 μl/min podczas ładowania wirusa oraz 0,1 μl/min podczas infuzji wirusa.</li>
 <li>Zanarkonizowaną mysz umieszcza się w stereotaksie, gdzie pozostaje ona pod narkozą przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
 <li>Przygotowuje się mysz zgodnie z potrzebami. Na przykład za pomocą skalpela wykonuje się pojedyncze cięcie wzdłuż linii środkowej skóry, od miejsca między oczami do miejsca między uszami. Skórę odciąga się, aby odsłonić czaszkę, a następnie usuwa powięź. Do stereotaksu mocuje się dociąganą pipetę szklaną. Pozycje uchwytów usznych reguluje się do momentu, aż bregma i lambda znajdą się na tej samej wysokości, a linia łącząca je będzie równoległa do osi Y stereotaksu. Osie stereotaksu orientuje się zgodnie z układem współrzędnych, w którym obliczono współrzędne wstrzykiwania. Zeruje się stereotaks z końcówką pipety szklanej na bregmie, a następnie końcówkę ustawia się nieco powyżej czaszki na współrzędnych X i Y jednego z miejsc wstrzykiwania.</li>
 <li>Za pomocą wiertarki stomatologicznej ostrożnie usuwa się kość czaszki pod końcówką, aż pozostanie niezwykle cienka warstwa kości. Pipetę szklaną można opuszczać i podnosić, aby sprawdzić, czy wiercony otwór jest wycentrowany w prawidłowej pozycji. Za pomocą igły 30 G delikatnie usuwa się mały fragment warstwy kości w odpowiednich współrzędnych X i Y, aby odsłonić oponę twardą. Otwór ten powinien być na tyle duży, aby zmieścił się w nim jeden z injektorów (szerokość 0,25 mm). Schemat przedstawiono na Ryc. 1D. W ten sposób w czaszce, na współrzędnych X i Y odpowiadających każdemu miejscu wstrzykiwania, wykonuje się małe otwory o szerokości 0,25 mm.</li>
 <li>Pipetę szklaną utylizuje się w pojemniku na odpady ostre, a dostosowany zestaw injektorów mocuje się do stereotaksu za pomocą zacisku stereotaksycznego.</li>
 <li>Aby prawidłowo ustawić kąt zestawu injektorów, wybiera się dwa zewnętrzne injektory do kalibracji względem danego punktu odniesienia w następujący sposób: po dopasowaniu jednego z injektorów do punktu odniesienia, określa się względne odległości X i Y między miejscami wstrzykiwania względem tego injektora i jednego innego. Osie stereotaksu reguluje się tak, aby cały zestaw injektorów został przesunięty w kierunkach X i Y o te względne odległości. Jeśli drugi injektor nie jest teraz wyrównany z punktem odniesienia, poluzowuje się i obraca metalową kaniulę. Proces ten powtarza się iteracyjnie, aż zestaw injektorów zostanie ustawiony pod prawidłowym kątem.</li>
 <li>Przed napełnieniem injektorów wirusem, wypełnia się je olejem silikonowym, aż strzykawki osiągną poziom 2 μl (lub więcej). Tworzy to strefę buforową, dzięki której wszelkie pęcherzyki powietrza lub zatory w końcówce można łatwo usunąć, przesuwając olej do przodu za pomocą pompy Hamiltona, bez konieczności ponownego napełniania całego systemu olejem silikonowym od strony tylnej strzykawek, jak opisano wcześniej.</li>
 <li>Na czaszkę nakłada się sterylny kawałek Parafilmu, a injektory delikatnie opuszcza się na Parafilm. W przypadku współrzędnych o znacznie zróżnicowanej głębokości, ładowanie może ułatwić specjalnie wyfrezowany element (np. obiekt w kształcie schodów).</li>
 <li>Kolejne kroki zakładają załadowanie 1 μl wirusa w każdym miejscu (następujące ilości należy zmniejszyć, jeśli pożądane są mniejsze objętości). Aby zagwarantować wstrzyknięcie &gt;1 μl wirusa w każdym miejscu, 1,5 μl wirusa nanosi się pipetą na Parafilm lub „schody” przy końcówce każdego injektora.</li>
 <li>Przy prędkości napełniania pompy Hamiltona ustawionej na 1 μl/min, do każdego injektora zasysa się 1,2 μl wirusa.</li>
 <li>Końcówkę najdłuższego injektora zeruje się na bregmie, a następnie zestaw injektorów przesuwa się na współrzędne X i Y tego injektora. Jeśli problemem są zatory, np. w przypadku wielu głębokich celów: nawet przed wprowadzeniem końcówek injektorów do mózgu, zaleca się czasami uruchomienie infuzji z pompy, aż wirus zacznie wypływać ze wszystkich końcówek injektorów. Usuwa to pęcherzyki powietrza z końcówek injektorów i zapewnia brak zatorów. W przypadku zatoru pompę Hamiltona ustawia się na krótki impuls infuzji z wyższą prędkością 2 μl/min, aby delikatnie udrożnić zator.</li>
 <li>Zestaw injektorów opuszcza się następnie przez małe otwory wykonane igłami 30 G do odpowiedniej głębokości Z.</li>
 <li>Przez każdy injektor wstrzykuje się 1 μl wirusa z prędkością 0,1 μl/min.</li>
 <li>Po wstrzyknięciu pozostawia się preparat na 30 minut.</li>
 <li>Po powolnym wyjęciu zestawu injektorów z mózgu, pompę Hamiltona ustawia się na infuzję z tą samą prędkością 0,1 μl/min, aby sprawdzić, czy w każdym injektorze nie wystąpiły zatory.</li>
 <li>Następnie injektory czyści się poprzez napełnienie i infuzję 1,5 μl etanolu z prędkością 2 μl/min.</li>
 <li>Na koniec injektory ponownie napełnia się olejem silikonowym, aby zachować 2 μl strefy buforowej w każdej strzykawce Hamiltona.</li>
<li>Wszystkie urządzenia należy wysterylizować przed i po procedurze, zgodnie z protokołami bezpieczeństwa biologicznego i wykorzystania zwierząt obowiązującymi w danej instytucji.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Równoległy układ wstrzykiwaczy przyspiesza zabieg mniej więcej o współczynnik równy liczbie wstrzykiwaczy, nie licząc czasu przygotowania i rekonwalescencji, choć poszczególne czasy będą zależeć od umiejętności operatora. W przypadku wstrzyknięcia 1 µL zazwyczaj obserwowaliśmy ekspresję lentiwirusa w sferze o średnicy około 1 mm (Rys. 1E). Precyzja wstrzykiwania była taka, że zmienność w pozycjonowaniu końcówki z próby na próbę wynosiła około 45 µm (odchylenie standardowe odległości od pozycji końcówki do zamierzonej pozycji końcówki).
<img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Schemat konfiguracji systemu HPLC do iniekcji stereotaksycznej, z układem wstrzykiwaczy i rurkami polietylenowymi." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Projekt, implementacja i zastosowanie równoległego układu wstrzykiwaczy wirusów. A, schemat systemu równoległego układu wstrzykiwaczy, przedstawiający konfigurację potrójnego wstrzykiwacza do trzech jednoczesnych iniekcji. B, fotografia potrójnego równoległego układu wstrzykiwaczy zgodnie ze schematem w punkcie A. C, zacisk stereotaksyczny, przedstawiony w rzucie z góry. D, ilustracja techniki wydajnego, minimalizującego uszkodzenia otwierania otworów w czaszce w celu wprowadzenia wstrzykiwacza do mózgu: za pomocą wiertarki stomatologicznej należy zredukować grubość czaszki do ~50 mikronów, a następnie użyć czubka ostrej igły, aby wykonać małą kraniotomię. E, obraz fluorescencyjny przedstawiający komórki znakowane channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP w trzech obszarach kory mysiej, zgodnie z celowaniem potrójnego układu wstrzykiwaczy pokazanego w B.

<ol><li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).</li>
<li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li>
<li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li>
<li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li>
</ol>

Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi NIH Guide for Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez komitety MIT Animal Care and Use oraz Biosafety Committees.

W ostatnich latach szereg genetycznie kodowanych sensybilizatorów optycznych umożliwiło aktywację i wyciszanie neuronów in vivo w sposób precyzyjny czasowo, w odpowiedzi na krótkie impulsy światła (np. 1,4,5,6,7,8,11). Kluczową metodą sensybilizacji neuronów na światło w mózgu ssaków jest wykorzystanie wirusów, takich jak lentiwirusy i wirusy adeno-zależne (AAV), które mogą w bezpieczny i trwały sposób dostarczać geny kodujące opsyny do mózgów zwierząt, od myszy po małpy (np. 2,9,10). Wirusy pozwalają na szybszą realizację badań niż transgenika, zwłaszcza w przypadku organizmów, które nie są modelami genetycznymi, takich jak szczury i małpy, a w przypadku opsyn mogą zapewnić wysoki poziom ekspresji, który mógłby być nieosiągalny w scenariuszach transgenicznych. Przedstawiamy tutaj równoległą macierz wstrzykiwaczy zdolną do szybkiego tworzenia tzw. „transgeniki na poziomie obwodów”, co umożliwia celowanie wirusowe w całe trójwymiarowe struktury mózgu za pomocą jednego genu w ramach jednego kroku chirurgicznego. Macierz wstrzykiwaczy składa się z jednej lub więcej pomp przemieszczeniowych, z których każda napędza zestaw strzykawek, a każda z nich doprowadza ciecz do kapilary z poliimidu/stopionego krzemionki za pomocą złącza odpornego na wysokie ciśnienie. Kapilary są dobierane pod kątem rozmiaru, a następnie wprowadzane w pożądane miejsca określone przez specjalnie frezowaną płytkę do pozycjonowania stereotaktycznego, co pozwala na dostarczenie wirusów lub innych odczynników do wybranej grupy obszarów mózgu. Aby użyć urządzenia, chirurg najpierw całkowicie wypełnia podsystem płynowy olejem, wstecznie wypełnia kapilary wirusem, wprowadza urządzenie do mózgu, a następnie powoli infunduje odczynniki (&lt;0.1 μL/min). 
Technologia ta umożliwi przeprowadzenie szerokiej gamy nowych rodzajów eksperymentów, takich jak wyłączanie struktur o złożonym kształcie (np. hipokampa) w skali milisekundowej w precyzyjnie określonych momentach podczas zachowania, czasowo precyzyjna inaktywacja struktur obustronnych, które mogą działać redundantly (np. lewego i prawego ciała migdałowatego), a także perturbacja wielu oddzielnych obszarów mózgu (np. wymuszanie pracy dwóch połączonych obszarów w przeciwfazie w celu zbadania, w jaki sposób synchronizacja międzyobszarowa zależy od aktywności w każdym z tych obszarów, lub stymulowanie wejść do danego obszaru przy jednoczesnym wyciszaniu części celów, aby zrozumieć, które z nich są kluczowe dla pośredniczenia w efektach tych wejść). W przypadku dużych mózgów, takich jak u naczelnych, w których niedawno wykazaliśmy optyczną, specyficzną dla typu komórek aktywację neuronalną3, perturbacja aktywności w obszarze istotnym dla zachowania może wymagać znakowania wirusowego dużych i złożonych struktur. Zauważamy, że równoległe układy injektorów mogą być wykorzystane do podawania niemal każdego ładunku – leków, neuromodulatorów, neuroprzekaźników, a nawet komórek – w złożonych wzorach 3D w mózgu, w sposób czasowo precyzyjny. Wreszcie, z punktu widzenia translacyjnego, możliwe jest szybkie projektowanie i wytwarzanie spersonalizowanych dla pacjenta urządzeń do terapii genowej lub dostarczania leków, dopasowanych do indywidualnej geometrii mózgu, co może wesprzeć nowe metody leczenia różnych patologii, potencjalnie poprzez zastosowanie cząsteczek sterowanych optycznie.
Układy wstrzykiwaczy zostały zaprojektowane w celu zapewnienia wysokiej precyzji, zarówno przestrzennej, jak i wolumetrycznej. W kierunkach X i Y osiągnięto to poprzez wiercenie bardzo precyzyjnie rozmieszczonych otworów za pomocą niedrogiego mini-frezera, przy czym otwory są na tyle małe, aby ściśle dopasować wstrzykiwacze, co gwarantuje ich wzajemną równoległość oraz precyzyjne rozmieszczenie. W kierunku Z wstrzykiwacze są przycinane przy użyciu aparatu stereotaksycznego, co pozwala na uzyskanie poziomu precyzji odpowiadającego samej operacji stereotaksycznej. Precyzja wolumetryczna wynika z dokładności pompy Hamiltona oraz zastosowania złączy o niemal zerowej objętości martwej, zaadaptowanych z dziedziny wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Wstrzykiwacze wykonane są z kapilar z topionego szkła krzemowego, które są wystarczająco wytrzymałe i sztywne, aby zachować precyzyjny kształt i odstępy pod wpływem ciśnienia, bez konieczności stosowania grubych ścianek typowych dla alternatyw, takich jak kaniule stalowe. Można łatwo wprowadzić niewielkie modyfikacje, aby dostosować równoległy układ wstrzykiwaczy do różnych eksperymentów. Na przykład, jeśli wymagana jest mniejsza objętość wirusa lub gęstsze rozmieszczenie, można zastosować cieńsze kapilary wraz z odpowiadającym im mniejszym wiertłem. Przyszłe urządzenia mogą wykorzystywać kanały i pompy mikroprzepływowe w celu zwiększenia liczby równoległych wstrzykiwaczy oraz zminimalizowania rozmiarów (co być może umożliwi montaż takich urządzeń na głowach zwierząt poruszających się swobodnie).

<table><tbody><tr><td>Narzędzie Dremel</td><td>Narzędzie</td><td>Dremel</td><td>3956-02</td><td></td></tr><tr><td>Wytryskacz laserowy</td><td>Narzędzie</td><td>Universal Laser Systems</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet z klejem na gorąco</td><td>Narzędzie</td><td>Stanley Bostitch</td><td>GR20</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa do wstrzykiwania i wycofywania (pompa Hamiltona)</td><td>Narzędzie</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;strzykawki Hamiltona</td><td>Narzędzie</td><td>Hamilton Co</td><td>701N</td><td>Wymagana jedna sztuka na każde miejsce wstrzyknięcia</td></tr><tr><td>Stereotaksja myszy</td><td>Narzędzie</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725D</td><td></td></tr><tr><td>Model mini-młyna</td><td>Narzędzie</td><td>Roland</td><td>MDX-15</td><td></td></tr><tr><td>0.011&quot; średnica wiertła do mini frezarki</td><td>Narzędzie</td><td>McMaster-Carr</td><td>8915A12</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; średnica wiertła do mini-frezarki</td><td>Narzędzie</td><td>McMaster-Carr</td><td>8848A35</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka stomatologiczna wysokobiegowa</td><td>Narzędzie</td><td>Ryś</td><td>333</td><td></td></tr><tr><td>Akcesoria do wiertarki stomatologicznej</td><td>Narzędzie</td><td>Testy Pearsona</td><td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td><td></td></tr><tr><td> </td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>kaniula ze stali nierdzewnej o średnicy zewnętrznej (OD) 1,5 mm</td><td>Materiały</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-15R</td><td></td></tr><tr><td>śruba maszynowa z łbem szczelinowym do opraw 1-72</td><td>Materiały</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0172B</td><td></td></tr><tr><td>nakrętka sześciokątna 1-72</td><td>Materiały</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0172</td><td></td></tr><tr><td>płytka prototypowa PCB, 1/32&quot; gruby</td><td>Materiały</td><td>Digi-Key</td><td>PC57-T-ND</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz akrylowy, 1/8&quot; gruby</td><td>Materiały</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>Złącza HPLC</td><td>Materiały</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (niektóre z nich można kupić w opakowaniach po 10 sztuk; należy po prostu dodać an &amp;#8216;Proszę wprowadzić tekst źródłowy do tłumaczenia.&amp;rsquo; do końca numeru katalogowego)</td><td>Wymagany jeden na wtrysk na każdy punkt, z wyjątkiem F-252, P-627 i P-235, które mogą być użyte ponownie</td></tr><tr><td>Kapilara z topionego kwarcu, średnica zewnętrzna: 245 &amp;mu;m, ID: 100 &amp;mu;m</td><td>Materiały</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000022-10M</td><td></td></tr><tr><td>5-minutowa żywica epoksydowa ogólnego przeznaczenia</td><td>Materiały</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td>5-minutowa uniwersalna żywica epoksydowa</td></tr><tr><td>Przewód polietylenowy 0,066 x 0,095 cala</td><td>Materiały</td><td>VWR international</td><td>63018-827</td><td></td></tr></tbody></table>

skalowalne macierze wtryskiwaczy płynowych do wirusowego targetowania nienaruszonych trójwymiarowych obwodów mózgowych

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Nasze zrozumienie obwodów neuronalnych – tego, w jaki sposób pośredniczą one w obliczeniach służących czuciu, myśleniu, emocjom i działaniu oraz w jaki sposób ulegają one zaburzeniom w schorzeniach neurologicznych i psychiatrycznych – zostałoby znacznie ułatwione dzięki technologii szybkiego celowania w geny w obrębie złożonych trójwymiarowych obwodów neuronalnych, umożliwiając szybkie tworzenie „transgeników na poziomie obwodu”. Opracowaliśmy niedawno metody, w których wirusy kodujące białka światłoczułe mogą uwrażliwiać konkretne typy komórek na aktywację i wyciszanie w skali milisekundowej w nienaruszonym mózgu. Przedstawiamy tutaj projekt i implementację matrycy wtryskiwaczy zdolnej do dostarczania wirusów (lub innych płynów) do kilkunastu określonych punktów w obrębie trójwymiarowej struktury mózgu (Rycina. 1A, 1BUkład wtryskiwaczy składa się z jednej lub większej liczby pomp wyporowych, z których każda napędza zestaw strzykawek, z których każda jest podłączona do kapilary polimidowo-krzemionkowej poprzez złącze odporne na wysokie ciśnienie. Kapilary są dobierane pod kątem rozmiaru, a następnie wprowadzane do wybranych lokalizacji określonych poprzez niestandardowe frezowanie płytki do pozycjonowania stereotaktycznego, co umożliwia dostarczenie wirusów lub innych odczynników do pożądanego zestawu obszarów mózgu. Aby skorzystać z urządzenia, chirurg najpierw całkowicie wypełnia podsystem płynowy olejem, wypełnia kapilary wirusem od tyłu, wprowadza urządzenie do mózgu i powoli infunduje odczynniki (&lt;0.1 microliters/min). Równoległa budowa układu wtryskiwaczy ułatwia szybkie, dokładne i solidne znakowanie całych obwodów neuronalnych ładunkami wirusowymi, takimi jak sensory optyczne, aby umożliwić aktywację światłem i wyciszanie określonych obwodów mózgowych. Wraz z innymi technologiami, takimi jak układy światłowodowe do dostarczania światła do wybranych zestawów obszarów mózgu, mamy nadzieję stworzyć zestaw narzędzi umożliwiający systematyczne badanie przyczynowych funkcji neuronalnych w nienaruszonym mózgu. Technologia ta może nie tylko otworzyć drogę do takich systematycznych podejść w neuronauce skoncentrowanej na obwodach u ssaków i ułatwić znakowanie obszarów mózgu u dużych zwierząt, takich jak naczelne niebędące ludźmi, ale może również otworzyć kliniczną ścieżkę translacyjną dla protez optycznego sterowania specyficznego dla komórek, których precyzja może umożliwić lepsze leczenie trudnych do opanowania schorzeń mózgu. Wreszcie, urządzenia opisane w niniejszym tekście mogą ułatwić precyzyjnie czasowe dostarczanie innych ładunków, takich jak komórki macierzyste i środki farmakologiczne, do struktur trójwymiarowych w sposób łatwo dostosowywalny przez użytkownika.

Kontrola i analiza obwodów neuronalnych in vivo zostałyby ułatwione dzięki technologii dostarczania wirusów i innych odczynników do wybranych trójwymiarowych zestawów obszarów mózgu. Prezentujemy wykonanie zindywidualizowanej macierzy wtryskiwaczy płynowych oraz dostarczanie kodowanych wirusowo sensybilizatorów optycznych, co umożliwia optyczną manipulację złożonymi obwodami mózgowymi.

Skalowalne macierze wtryskiwaczy płynowych do wirusowego targetowania nienaruszonych trójwymiarowych obwodów mózgowych

Nasze rozumienie obwodów neuronalnych – tego, w jaki sposób pośredniczą one w obliczeniach służących percepcji, myśleniu, emocjom i działaniu oraz w jaki sposób ulegają one zaburzeniom ...

Dwa prostokątne kawałki akrylu zostają wycięte laserowo, a następnie zmontowane w celu utworzenia uchwytu stereotaktycznego, który służy do sztywnego zamocowania matrycy wtryskiwaczy względem punktów stereotaktycznych. Pompa strzykawkowa zostaje załadowana strzykawkami połączonymi rurkami polietylenowymi dla wybranego obwodu mózgowego. Do wywiercenia otworów, przez które wprowadza się rurki z topionego kwarcu, tworząc w ten sposób wtryskiwacze, używa się frezarki.Wtryskiwacze są zamontowane odwracalnie w zacisku, a następnie przycinane tak, aby celowały w interesujące badacza obwody mózgowe. Każdy wtryskiwacz jest połączony z pojedynczym kanałem polietylenowym. Przygotowanie systemu do użycia polega na napełnieniu go za pomocą strzykawek olejem silikonowym, a następnie załadowaniu odczynników płynnych do wtryskiwaczy.Następnie równoległy injektor zostaje wprowadzony do obszarów docelowych mózgu i podawane są odczynniki. Cześć, jestem Stephanie Chan z Grupy Syntetycznej Neurobiologii w MIT. Do tej pory ekspresja genów w przestrzennie złożonych obwodach mózgowych wymagała albo powolnego i kosztownego tworzenia zwierząt transgenicznych, albo żmudnego procesu iniekcji wirusowych, które muszą być wykonywane po jednej stronie naraz.Dzisiaj pokażemy Państwu, jak zbudować i wykorzystać równoległy układ wstrzykiwaczy, który umożliwia dostarczanie płynów do złożonych, trójwymiarowych wzorców w mózgu. Używamy tego układu do szybkiego tworzenia myszy transgenicznych o specyficznych obwodach, dostarczając wirusy równolegle poprzez zestaw wstrzykiwaczy, aby jednocześnie osiągnąć wszystkie cele. Nasz wstrzykiwacz może być wykorzystany do dostarczania dowolnego odczynnika płynnego do złożonego rozkładu miejsc w mózgu.Naszym celem na dziś jest dostarczenie wirusów kodujących białka światłoczułe, aby umożliwić nam precyzyjne w czasie włączanie i wyłączanie specyficznych typów komórek w konkretnych obwodach. W naszym laboratorium wykorzystujemy tę technologię w połączeniu z macierzami światłowodów, które dostarczają światło w sposób specyficzny dla danego obwodu. Zatem zacznijmy.W pierwszej kolejności budujemy uchwyt stereotaktyczny, który trzyma matrycę wstrzykiwaczy i może zostać zamontowany na aparacie stereotaktycznym. Do wykonania uchwytu potrzebne są następujące elementy: stalowa kaniula o długości dwóch cali i średnicy zewnętrznej (OD) 1,5 mm z jednym spłaszczonym końcem, mały kawałek płytki prototypowej PCB o wymiarach około 0,5 na 0,5 cm oraz dwa identyczne prostokąty.Każdy z dwóch prostokątów akrylowych powinien mieć wymiary 1/2 na 3/8 cala i zostać wycięty z arkusza akrylu o grubości 1/8 cala. Należy wyciąć dwa okrągłe otwory w przeciwległych narożnikach. Pierwszy otwór powinien mieć średnicę 1,5 mm i być na tyle duży, aby ciasno utrzymywać metalową kaniulę.Drugi otwór powinien mieć średnicę 1/16 cala. Wprowadź metalową kaniulę do otworu o średnicy 1,5 mm w jednym prostokącie, a następnie przez otwór o średnicy 1,5 mm w drugim prostokącie; wyrównaj dolny koniec kaniuli z dolną powierzchnią dolnego prostokąta, tak aby utworzyć kształt kija hokejowego, a następnie umieść przekładkę pomiędzy dwoma prostokątami. Plastelina może być pomocna w utrzymaniu elementów podczas tego procesu, zapewniając mocne dociśnięcie przekładki między dwoma prostokątami.Sklej tę konstrukcję, nakładając klej na gorąco wokół kaniuli oraz otworów o średnicy 1,5 mm. Należy uważać, aby nie przykleić dystansera do prostokątów. Po wyschnięciu kleju nałóż nakrętkę sześciokątną 1-72 na otwór 1/16 cala, a następnie wkręć śrubę 1-72 z przeciwległej strony prostokątów.Nanieś niewielkie ilości pięciominutowego kleju epoksydowego wokół krawędzi nakrętki, aby przymocować ją do prostokąta. Należy uważać, aby klej nie dostał się do gwintów nakrętki ani śruby. Po utwardzeniu się żywicy epoksydowej włóż śrubę 1 72 do otworu o średnicy 1/16 cala od górnej strony prostokątów i wkręć ją w nakrętkę.Usuń plastelinę modelarską i upewnij się, że dystansownik jest stabilnie zamocowany poprzez dokręcenie śruby. System macierzy wtryskiwaczy można dostosować do niemal dowolnego zestawu współrzędnych w mózgu. Najpierw ustal współrzędne wybranych miejsc wtryskiwania w atlasie mózgu odpowiedniego gatunku, a następnie przelicz je na właściwe współrzędne stosowane w stereotaksji.W tej demonstracji posłużymy się myszą; przewidziano trzy miejsca wstrzyknięcia, a tym samym trzy probówki dla wstrzykiwaczy. Współrzędne X, Y i Z będą odpowiadać współrzędnym boczno-przyśrodkowym, przednim, tylnym oraz brzuszny współrzędnym atlasu mózgu myszy. Następnie umieść trzy strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL w pompie do wstrzykiwania i pobierania, takiej jak ta firmy Harvard Apparatus, a następnie bezpiecznie przymocuj do igły każdej strzykawki Hamiltona kawałki rurek polietylenowych o długości trzech stóp.Nasunąć tuleję rurki F 2 52 na otwarty koniec i przytwierdzić ją do adaptera rurki P 6 27, używając nakrętki P 2 35 oraz P 200 fal. Aby zbudować zindywidualizowaną macierz wtryskiwaczy, należy użyć mini frezarki modela oraz wiertła o średnicy 0,011 cala, aby wywiercić trzy otwory w płytce prototypowej PCB o grubości 1/32 cala. Trzy otwory należy wywiercić zgodnie z względnymi współrzędnymi X i Y miejsc wtryskiwania, a następnie, przed zdjęciem płytki z frezarki, wywiercić prostokąt wokół małych otworów, używając wiertła o średnicy 1/32 cala.Następnie poszczególne injektory wprowadza się do połowy każdego otworu, tak aby były mocno osadzone i ustawione równolegle względem siebie. Należy przymocować je do płytki za pomocą epoksydowej żywicy, tworząc w ten sposób macierz injektorów. Następnie należy przymocować macierz injektorów do uchwytu stereotaksycznego.Umieść jeden róg płytkistykowej pomiędzy akrylowymi prostokątami i dokręć śrubę uchwytu stereotaksycznego. Następnie przymocuj metalną kaniulę uchwytu do aparatu stereotaksycznego, korzystając z mechanizmu mocowania stereotaksycznego. Kolejne kroki wykonuje się pod mikroskopem dla jednego z zewnętrznych injektorów, do którego można podejść z boku prostą krawędzią, nie uderzając w żadne z pozostałych injektorów.Odetnij końcówkę wystającą poza dolną krawędź płytki prototypowej. Wyrównaj końcówkę za pomocą narzędzia typu dremel. Następnie wybierz stabilny punkt odniesienia w zasięgu ramienia stereotaktycznego i przesuń zespół inżektorów tak, aby wyrównana końcówka zewnętrznego inżektora znajdowała się w tym punkcie odniesienia.Wybierz drugi wtryskiwacz wraz z odpowiadającymi mu współrzędnymi. Przesuń zespół wtryskiwaczy wzdłuż osi Z o wartość różnicy wysokości lub kierunku Z między współrzędnymi pierwszego a drugiego wtryskiwacza. Przytnij ten drugi wtryskiwacz tak, aby jego końcówka znajdowała się na wysokości punktu odniesienia, a następnie wyrównaj ją za pomocą narzędzia Dremel.Macierz injektorów można przesuwać w kierunkach X i Y, aby ułatwić porównanie końcówki injektora z punktem odniesienia. Po powtórzeniu tego procesu przycinania dla pozostałych injektorów, macierz injektorów jest gotowa do montażu w całym systemie. Montaż całego systemu wymaga wcześniej skonstruowanego zacisku stereotaktycznego oraz dostosowanej macierzy injektorów.Po sterylizacji zestawu wtryskiwaczy należy wsunąć tylną część każdego wtryskiwacza (koniec nieprzycięty) do niebieskiej tulei rurki F dwa 40. Używając nakrętki P 2 35 oraz złączki P 200, należy przymocować tylną część wtryskiwacza do adaptera gwintowanego, który jest już połączony z pompą Hamilton za pomocą rurki polietylenowej. Za pomocą igły 27G należy wstrzyknąć sterylny olej silikonowy do tylnej części strzykawek Hamilton w taki sposób, aby cały system został wypełniony od strzykawek Hamilton aż po końcówki wtryskiwaczy.Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza, w przeciwnym razie objętość wstrzykniętego wirusa będzie błędna lub wirus może w ogóle nie zostać wstrzyknięty. Podczas wymiany strzykawek Hamiltona w pompie Hamiltona, w strzykawkach utrzymuje się jak największą możliwą objętość oleju silikonowego. Jeśli eksperyment wymaga więcej niż dwóch strzykawek, w pompie Hamiltona można umieścić przekładki, tak jak zrobiliśmy to tutaj.Alternatywnie można zakupić w firmie Harvard Apparatus zestaw rozszerzenia do wielu statywów, który pozwala na jednoczesne umieszczenie do 10 strzykawek. Aby wstrzyknąć wirusa do mózgu myszy, należy rozpocząć od podania leków przeciwbólowych zgodnie z protokołem dotyczącym zwierząt. Umieść znieczuloną mysz w aparacie stereotaksycznym i potwierdź za pomocą odruchu z palca u stopy, że zwierzę jest dostatecznie znieczulone.Następnie wykonaj pojedyncze nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry, od miejsca między oczami do miejsca między uszami. Odchyl skórę, aby odsłonić czaszkę, i oczyść powięź. Przymocuj wyciągniętą pipetę szklaną do stereotaktyki.Dostosuj położenie uchwytów usznych, aż bgma i lambda znajdą się na tej samej wysokości, a linia łącząca je będzie równoległa do osi Y aparatu stereotaksycznego. Wyzeruj aparat stereotaksyczny, ustawiając końcówkę pipety szklanej w punkcie bgma, a następnie umieść końcówkę nieco powyżej czaszki, w współrzędnych x i Y jednego z miejsc wstrzyknięcia. Za pomocą wiertarki dentystycznej ostrożnie wywierć otwór w czaszce pod końcówką, aż pozostanie niezwykle cienka warstwa kości. Używając igły o rozmiarze 30 G, delikatnie usuń mały fragment tej warstwy we właściwych współrzędnych x i y, aby odsłonić oponę twardą.Otwór ten powinien być na tyle duży, aby w ten sposób zmieścił się jeden z inżektorów. W czaszce wykonuje się małe otwory o szerokości 0.25 mm w współrzędnych x i y odpowiadających każdemu miejscu iniekcji. Po zakończeniu wiercenia należy usunąć szklaną pipetę pozycjonującą i przymocować dostosowany zestaw inżektorów do stereotaksy za pomocą zacisku stereotaksycznego.Aby prawidłowo ustawić kąt macierzy wtryskiwaczy, należy wybrać dwa zewnętrzne wtryskiwacze, które zostaną skalibrowane względem danego punktu odniesienia. Po dopasowaniu jednego z wtryskiwaczy do punktu odniesienia, należy uwzględnić względne odległości w osiach X i Y pomiędzy miejscami wstrzyknięcia dla tego wtryskiwacza a drugim wtryskiwaczem. Przesuń macierz wtryskiwaczy w kierunkach x i y o te względne odległości. Jeśli drugi wtryskiwacz nie jest wyrównany z punktem odniesienia, należy poluzować i obrócić metalową kaniulę.Powtarzaj ten proces iteracyjnie, aż macierz wtryskiwaczy zostanie ustawiona pod odpowiednim kątem. Ustaw szybkość uzupełniania pompy Hamilton na 1 µL na minutę i uzupełnij wtryskiwacze olejem silikonowym, aż strzykawki osiągną poziom 2 µL lub więcej. Zapewnia to zapas oleju, dzięki czemu wszelkie pęcherzyki powietrza lub zatory w końcówce można łatwo usunąć, przepychając olej do przodu za pomocą pompy Hamilton, bez konieczności ponownego napełniania całego systemu olejem silikonowym od tyłu strzykawek, zgodnie z wcześniejszym opisem.Umieść czysty kawałek parafomy na czaszce i delikatnie opuść injektory na parafomę. Jeśli do każdego miejsca ma zostać dostarczony 1 µL wirusa, nanieś pipetą 1,5 µL wirusa na parafomę dla każdego miejsca, zachowując taką samą prędkość dopełniania wynoszącą 1 µL na minutę. Dopełnij każdy injektor 1,2 µL wirusa.Wyprowadź końcówkę najdłuższego injektora do punktu zero w bgma, a następnie przesuń macierz injektorów do współrzędnych x i Y tego injektora. Obniż macierz injektorów przez małe otwory wykonane igłami 30 G, aby skorygować głębokość Z. Wstrzyknij jeden mikrolitr wirusa przez każdy injektor z prędkością 0,1 mikrolitra na minutę lub wolniej.Pozostaw wstrzyknięcia w spokoju na 30 minut, aby substancje mogły się rozprzestrzenić. Po 30 minutach powoli wyjmij macierz wstrzykiwaczy z mózgu. Następnie ustaw pompę Hamiltona na taką samą prędkość infuzji, wynoszącą 0,1 µL na minutę, aby sprawdzić, czy któryś z wstrzykiwaczy nie jest zatkany.Następnie należy oczyścić injektory, ponownie napełniając je i podając 2 µL etanolu z prędkością 2 µL na minutę. Na koniec należy ponownie napełnić injektory olejem silikonowym, aby utrzymać 2 µL strefy buforowej w każdej strzykawce Hamiltona. Na tej ilustracji przedstawiono wynik zastosowania zaprezentowanej wcześniej macierzy injektorów zawierającej trzy kaniule do podawania odczynników wirusowych do rozproszonych części mózgu myszy.W tym przypadku ładunek genetyczny wirusa zawiera fluorescencyjną cząsteczkę GFP, co pozwala na uzyskanie trzech fluorescencyjnych obszarów znakowanych komórek w jednym etapie. W zasadzie do stworzenia macierzy wstrzykiwaczy wirusowych można wykorzystać dowolną liczbę kaniul. Przedstawiono tutaj, na przykład, macierz wstrzykiwaczy odpowiednią do obustronnego celowania w obszar ca1 hipokampa, składającą się z 16 wstrzykiwaczy.Korzystając z zaprezentowanego dzisiaj protokołu, będą Państwo w stanie wprowadzić wirusa do mózgu w układzie trójwymiarowym, co pozwoli na skuteczne tworzenie transgenicznych układów na poziomie obwodowym. Ponadto macierz inżektorów równoległych może być wykorzystana do podawania dowolnych odczynników płynnych do mózgu, co może umożliwić na przykład wprowadzenie agonistów dopaminergicznych w określonym wzorze do konkretnych obwodów neuronalnych u unieruchomionego w głowie zwierzęcia podczas zachowań. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Skalowalne tablice wtryskiwaczy płynów do ukierunkowanego ataku wirusowego na nienaruszone trójwymiarowe obwody mózgu

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wykonywania szklanych igieł kapilarnych o świetle 50-μm. Technika ta znacząco ogranicza uszkodzenia mózgu, minimalizuje pasywną dyfuzję leków i pozwala na precyzyjne celowanie w mózg gryzonia.

Celowanie w głębokie struktury mózgu za pomocą mikroiniekcji w celu dostarczania leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórkowych

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

Źródło: Pereira, M. et al., In Vivo Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek glejowych do interneuronów przez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do kory mózgowej transgenicznej myszy w celu dostarczenia zależnego od Cre przeprogramowania neuronów i fluorescencyjnych genów reporterowych do komórek glejowych.

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych do przeprogramowania komórek glejowych w modelu mysim

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Tutaj pokazujemy wspomagane dostarczanie wektorów wirusowych do kory mózgowej za pomocą rezonansu magnetycznego (MR) jako skuteczne i uproszczone podejście do osiągnięcia ekspresji optogenetycznej w dużych obszarach korowych w mózgu makaka.

Konwekcja wzmocniła dostarczanie optogenetycznego wektora wirusowego związanego z adenowirusem do kory mózgowej makaka rezusa pod nadzorem obrazów MRI online

Opisana tutaj jest procedura stereotaktyczna, która może celować w trudne i trudno dostępne obszary mózgu (ze względu na ograniczenia przestrzenne) przy użyciu kątowego podejścia koronalnego. Protokół ten można dostosować zarówno do modeli mysich, jak i szczurzych i może być stosowany do różnych zastosowań neuronaukowych, w tym implantacji kaniuli i mikroiniekcji konstruktów wirusowych.

Adaptacyjne kątowe podejście stereotaktyczne dla wszechstronnych technik neurobiologicznych

Ten protokół demonstruje użycie platformy robotycznej do mikroiniekcji do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych i neuronów w wycinkach mózgu. Technika ta jest wszechstronna i oferuje metodę śledzenia komórek w tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Manipulacja pojedynczymi neuronalnymi komórkami macierzystymi i neuronami w wycinkach mózgu za pomocą mikroiniekcji robotycznej

Zgodnie z obecną implementacją, optogenetyka u naczelnych wymaga wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu. Optymalna metoda iniekcji powinna być niezawodna i, w przypadku wielu zastosowań, zdolna do celowania w pojedyncze miejsca o dowolnej głębokości, które można łatwo i jednoznacznie zidentyfikować w histologii pośmiertnej. Przedstawiono metodę iniekcji o tych właściwościach.

Wstrzyknięcia wektorów AAV do optogenetyki w znieczulonym i przytomnym, zachowującym się mózgu naczelnych innych niż człowiek

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo to potężna technika do badania dynamiki neuronów i mikroobwodów u swobodnie zachowujących się myszy. Protokół ten opisuje wykonywanie operacji mózgu w celu uzyskania dobrego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniskopu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

Poznaj metodę równoległego wstrzykiwania wirusów do mózgu za pomocą skalowalnego układu wtryskiwaczy płynów. Technologia ta umożliwia precyzyjną manipulację optyczną obwodów nerwowych in vivo.

Skalowalne macierze wtryskiwaczy płynowych do wirusowego targetowania nienaruszonych trójwymiarowych obwodów mózgowych

Przeglądaj więcej filmów