Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in vivo rozwijającej się Drosophila

Aby przeprowadzić rekonstrukcje rozwijających się narządów w obrębie Drosophila melanogaster, musimy określić model do przodu, który najlepiej opisuje rozchodzenie się światła w samej poczwarce. Procedura rozpoczyna się od wybrania białej poczwarki wstępnej i przyklejenia jej na końcu rurki kapilarnej tak, aby przednia tylna oś poppy była zorientowana równolegle do rurki. Mała rurka kapilarna jest wypełniona barwnikiem fluorescencyjnym i włożona do obudowy źrenicy.

Po dokładnym ustawieniu osi poczwarka jest obracana o 360 stopni. Obrazy są uzyskiwane pod różnymi kątami. Pozyskane dane dotyczące fluorescencyjnego oświetlenia trans są wykorzystywane do określenia modelu do przodu, który zostanie wykorzystany do obrazowania rozwoju narządów.

Cześć, mam na imię Claudia i pracuję w Center for Assistance Biology w Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Nazywam się Ula Petou i pracuję w Paramount Lab w Harvard Medical School, nazywam się Daniel Różański i pracuję w Instytucie Obrazowania Biologicznego i Medycznego na Uniwersytecie Technicznym w Monachium oraz w Heliman Center w Monachium. Dziś pokażemy Wam zabieg trójwymiarowej rekonstrukcji całego ciała w Oph Melano Casta.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do wizualizacji in vivo rozwijających się narządów w okresie uczenia. Więc zacznijmy Zanim zaczniemy. Należy pamiętać, że nie ma dołączonego filmu, który powinien być oglądany przed tym filmem, w którym niektóre techniczne aspekty optycznej tomografii projekcyjnej są wyjaśnione bardziej szczegółowo niż tutaj.

Ponadto drugi film wyjaśnia obrazowanie przygotowanych tkanek lub narządów większych zwierząt. We wszystkich eksperymentach omówionych w tym filmie zostaną użyte transgeny kuźni Drosophila. Są to EL A gal cztery ulegający ekspresji w gruczołach ślinowych, apteris gal cztery, który ulega ekspresji w larwalnych tkankach prekursorowych dorosłego skrzydła i klatki piersiowej, transgenu wytwarzającego białko fluorescencyjne.

W odpowiedzi na gal cztery o nazwie U-A-S-G-F-P i biały 1118, niefluorescencyjne samce kontrolne przenoszące transgeny UAS są krzyżowane z dziewiczymi samicami posiadającymi cztery transgeny GAL w celu uzyskania tkanki. Specyficzną ekspresję krzyżówek GFP ustala się od ośmiu do 10 dziewiczych samic i samców na standardowych podłożach muchowych z posypką drożdży piekarskich. Na powierzchni fiolki są umieszczone w temperaturze 25 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności.

Dwa dni po zainicjowaniu krzyżówki, rodzice są przenoszeni do świeżej fiolki, a pięć do sześciu dni później PUI zacznie wypełniać fiolkę białym PrepU. Zostałem wybrany do ekspresji GFP pod fluorescencyjnym zakresem preparacyjnym. Selekcja białych pre pui zapewnia prawidłową inscenizację zwierząt, ponieważ pozostają one białe przez około godzinę.

Po źrenice stają się pigmentowane lub brązowawe. Ekspresję GFP PUI delikatnie pobiera się z fiolek za pomocą mokrego pędzla i umieszcza w kropli wody lub PBS na szalce Petriego, należy je wytrzeć z materiałów autofluorescencyjnych. Za pomocą pędzla powinny być teraz gotowe do obrazowania tomograficznego.

Jeśli PrepU I musi kontynuować starzenie się, aby osiągnąć prawidłowy etap rozwoju, można je pozostawić na szalce Petriego z mokrym ręcznikiem papierowym lub w fiolce z czystym jedzeniem. Zapewni to odpowiednią wilgotność i prawidłowy rozwój do obrazowania. PrepU musi być przyklejony do wnętrza szklanej rurki kapilarnej o średnicy 800 mikronów.

Pomaluj tylny koniec źrenicy super klejem, zorientuj sklejoną powierzchnię przedpoczwarki w rurce tak, aby przedni tylny dostęp muchy był równoległy do rurki. Przednia część zwierzęcia będzie zwisać z rurki kapilarnej. Rurka kapilarna jest teraz przymocowana do stolika obrotowego mikroskopu.

W pozycji pionowej wyreguluj oś nachylenia stolika obrotowego tak, aby oś obrotu rurki była równoległa do kolumn pikseli matrycy CCD do obrazowania. Po dostosowaniu pozycji muchy przystąp do obrazowania. W tym przykładzie zwierzęta z fluorescencyjnymi gruczołami ślinowymi mają być zobrazowane tak, aby OPH wyrażało GFP w ich gruczołach ślinowych, które można uzyskać ze skrzyżowania stad EAG four i U-A-S-G-F-P.

Zaczynamy od zamontowanej poczwarki wstępnej, oświetlamy ją wiązką wzbudzającą i zbieramy sygnał fluorescencyjny GFP. W transiluminacji obróć PrepU o 360 stopni wzdłuż jego osi pionowej i uzyskaj obrazy trans illumination. Każdy obraz odpowiada 10 stopniom obrotu.

Całkowity czas akwizycji zależy od ilości fluorescencji i od intensywności wiązki wzbudzenia. Typowe czasy są rzędu jednej minuty it. W tym przykładzie zobrazowana zostanie poczwarka DSO wyrażająca GFP w dyskach imaginalnych skrzydeł.

Poczwarkę tę można pobrać z fiolki krzyżówki między akcjami Aus GAL four i U-A-S-G-F-P. Poczwarka wstępna jest montowana zgodnie z wcześniejszym opisem. Ponieważ jednak czas obrazowania w tym eksperymencie wynosi około ośmiu godzin, bardzo ważne jest, aby środowisko pozostało wilgotne i miało temperaturę pokojową Aby uniknąć odwodnienia i śmierci zwierzęcia, nad wiązką wzbudzającą umieszcza się migawkę, aby zapobiec wygaszaniu kwiatowych czwórek w tkance będącej przedmiotem zainteresowania, a także aby zapewnić, że zwierzę nie zostanie spalone przez wiązkę laserową, jak wcześniej, oświetlić wiązką wzbudzenia i zebrać sygnał fluorescencyjny GFP przez oświetlenie trans.

Poczwarka wstępna jest całkowicie obrócona wzdłuż swojej osi pionowej. Podczas zbierania danych obrót trwa tylko jedną minutę i jest powtarzany w różnych odstępach czasu. Aby stworzyć serię poklatkowych zdjęć skrzydeł podczas rozwoju, dane mogą być pozyskiwane przez co najmniej sześć godzin z szybkością 100 obrazów na godzinę.

Bardzo ważne jest, aby całkowita ekspozycja na światło była kontrolowana za pomocą tej migawki, aby zapobiec uszkodzeniom lub wybielaniu zdjęć. Ten film pokazuje obrazy uzyskane między etapem PrepU a awersją do głowy źrenicy. Podczas rekonstrukcji obrazu trójwymiarowego występuje silne rozpraszanie do przodu, które należy uwzględnić, a którego nie można przybliżyć za pomocą dyfuzji.

Tak więc, aby rekonstrukcja była modelem rozpraszania do przodu rozchodzenia się światła, należy określić Dla uproszczenia zaniedbujemy absorpcję. Stopień rozproszenia jest testowany doświadczalnie. Aby to zrobić, ciało obce o standaryzowanej fluorescencji jest wprowadzane do niefluorescencyjnej białej poczwarki 1118, która jest następnie skanowana w celu wygenerowania danych modelu do przodu, zaczynając od napełnienia rurki kapilarnej z krzemionki o grubości 100 mikronów barwnikiem fluorescencyjnym PS 5.5.

Korzystając z działania kapilarnego, wepchnij rurkę kapilarną do poczwarki pod kątem 45 stopni do osi przedniej, zamontuj PrepU w kapilarze i ustaw go odpowiednio na obrotowym stoliku, jak opisano wcześniej. Teraz oświetl pre pupę wiązką lasera wzbudzającego z soczewką o niskiej aperturze numerycznej i zbierz obrazy fluorescencyjnego oświetlenia trans pre pupy. Jak opisano wcześniej, oprogramowanie MATLAB służy do dopasowania danych do jawnego teoretycznego modelu naprzód Aby ułatwić proces rekonstrukcji, wybiera się stałe przybliżenie równania transportu, ponieważ opisuje ono reżim rozpraszania do przodu, a także pasuje do danych eksperymentalnych.

Po ustaleniu prawidłowego modelu do przodu możemy zrekonstruować gruczoły ślinowe i uzyskać rekonstrukcje tomograficzne poklatkowe. Jeśli planowane jest korzystanie z tomografii w wolnej przestrzeni, można również skonfigurować algorytmy konfiguracyjne do dopasowywania indeksów. Po pierwsze, pokazujemy rekonstrukcję 3D gruczołów ślinowych na wczesnym etapie rozwoju.

Dla porównania, barwienie histologiczne gruczołów ślinowych pokazuje, że rekonstrukcje dobrze korelują z histologią. Ten film poklatkowy przedstawiający rozwój wyimaginowanych dysków skrzydła został uzyskany z pojedynczego żywego egzemplarza. Dla porównania, histopatyczne zabarwienie krążka skrzydła w tych samych punktach czasowych pokazuje, że rekonstrukcje dobrze korelują z histologią.

Właśnie pokazaliśmy, jak zbudować system do obrazowania trójwymiarowych struktur w oph in vivo i w czasie. To pozwala śledzić nas, morfogenezę u Drosophila, i śledzić rozwój skrzydeł przez sześć kolejnych godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wybrać odpowiedni model do przodu dla propagacji światła w obrębie drosophila.

Metoda ta może być stosowana w połączeniu z technikami histologicznymi, aby rzucić światło na rozwój narządów w stadiach źrenicy oph, a także może być modyfikowana do badania różnych organizmów o podobnej wielkości. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.