Name: Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in vivo rozwijającej się Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Poznaj mezoskopową tomografię fluorescencyjną do obrazowania in vivo rozwijających się narządów u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia trójwymiarową wizualizację całego ciała owada z wykorzystaniem modelu propagacji światła.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

C. Vinegoni potwierdza wsparcie z grantu National Institutes of Health (NIH) nr 1-RO1-EB006432.

The Drosophila melanogaster szczepy wykorzystane w tym eksperymencie to:
<ul style="list-style-type:none;">
<li>elav-Gal4 (FBti0002575)</li>
<li>ap-Gal4md544 (FBal0051787)</li>
<li>UAS-srcEGFP (FBti0013990)</li>
<li>w1118 (FBal0018186)</li>
</ul>
W przypadku wszystkich eksperymentów system UAS-Gal4 został wykorzystany do nadekspresji GFP w badanej tkance (tj. w gruczołach ślinowych lub krążkach skrzydeł). Bardziej szczegółowo, samice much transgeniczne z odpowiednim Gal4 krzyżowano z transgenicznymi partnerami UAS-EGFP. Krzyżówki hodowano w temperaturze 25°C w nawilżanym inkubatorze. Gdy poczwarki zaczynały pojawiać się w fiolkach (około 5-6 dni po rozpoczęciu krzyżowania), wyselekcjonowano je pod kątem fluorescencji GFP w białym stadium przedpoczwarkowym (0-1 h po utworzeniu puparium) i zebrano do obrazowania tomograficznego.
<ol>
 <li>Przygotować odpowiednie krzyżówki i hodować w temperaturze 25°C</li>
 <li>5-6 dni po rozpoczęciu krzyżówki wybrać fluorescencyjne potomstwo do obrazowania. Do delikatnego usuwania białych przepoczwarek ze ścianek fiolki należy użyć wilgotnego pędzla.</li>
 <li>Umieścić przepoczwarki w kropli wody lub PBS w szalce Petriego, aby usunąć cząsteczki pokarmu oraz klej pokrywający poczwarkę, który powoduje autofluorescencję preparatu. Delikatnie oczyścić pędzlem. Jeśli konieczne jest postarzenie poczwarek, wybrane białe przepoczwarki należy umieścić w szalce Petriego z mokrym ręcznikiem papierowym (komora wilgotna) lub na ściankach czystej fiolki z pokarmem dla much. Zapewni to odpowiednią wilgotność niezbędną do prawidłowego rozwoju zwierzęcia.</li>
</ol>
Drosophila – preparaty trwałe
<ol>
 <li>Przyklej dolną część poczwarki do szklanej rurki kapilarnej (średnica 800 mikronów) w taki sposób, aby oś przednio-tylna muchy była zorientowana równolegle do rurki.</li>
 <li>Umoć rurkę kapilarną pionowo na stole obrotowym.</li>
 <li>Wyreguluj oś nachylenia stołu obrotowego tak, aby oś obrotu była równoległa do kolumn pikseli matrycy CCD kamery.</li>
</ol>
Wyznaczenie modelu bezpośredniego
<ol>
 <li>Utrwal poczwarkę w kapilarze szklanym i zamocuj zgodnie z wcześniejszym opisem</li>
 <li>Wypełnij kapilarę kwarcową (100 micronów, OD) barwnikiem fluorescencyjnym (Cy5.5)</li>
 <li>Wprowadź kapilarę do wnętrza poczwarki pod kątem 45 stopni względem osi przednio-tylnej</li>
 <li>Naświetl poczwarkę wiązką lasera wzbudzającego przy użyciu soczewki o niskiej aperturze numerycznej. Wykonaj obrazy fluorescencyjne w prześwietleniu, obracając poczwarkę o 360 stopni wokół jej osi pionowej.</li>
 <li>Dopasuj dane eksperymentalne do odpowiedniego modelu wyprzedzającego</li>
</ol>
Obrazowanie gruczołów ślinowych
<ol>
 <li>Zamocuj poczwarkę wykazującą ekspresję GFP w gruczołach ślinowych zgodnie z wcześniejszym opisem</li>
 <li>Oświetl preparat wiązką wzbudzenia i zarejestruj w transiluminacji sygnał fluorescencji GFP w zakresie 360 stopni, obracając poczwarkę wokół jej osi pionowej.</li>
 <li>Zrekonstruuj uzyskane dane, wykorzystując model przewodni (forward model)</li>
</ol>
Obrazowanie poklatkowe
<ol>
 <li>Zamocuj białą przedpoczwarkę z ekspresją GFP w tarczach wyobraźnych skrzydeł</li>
 <li>Utrzymuj wilgotne środowisko obrazowania w temperaturze pokojowej, aby uniknąć odwodnienia poczwarki.</li>
 <li>Zastosuj migawkę, aby uniknąć ciągłego oświetlania</li>
 <li>Oświetl próbkę wiązką wzbudzenia i zbierz sygnał fluorescencji GFP w trybie transiluminacji w zakresie 360 stopni, obracając poczwarkę wokół jej osi pionowej. </li>
 <li>Zrekonstruuj pozyskane dane, wykorzystując model przedni.</li>
</ol>
Histologia
<ol>
 <li>Wypreparować gruczoły ślinowe, OUN/dyski oka w 1x PBS.</li>
 <li>Utrwalić tkanki w 4% Formaldehydzie, 1x PEM (100mM Pipes, 1mM EGTA, 1mM MgCl2) przez 20min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Usunąć utrwalacz i zamontować w Vectashield z dapi (Vector).</li>
 <li>Wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
Histologia w trybie poklatkowym
<ol>
 <li>Zebrać białe prepoczwarki i umieścić je w komorze wilgotnościowej.</li>
 <li>Zebrać poczwarki na różnych etapach rozwoju.</li>
 <li>Przed utrwaleniem dwa razy przebić poczwarkę cienką igłą (szpilka entomologiczna 000, FST) (0 h po utworzeniu puparium).</li>
 <li>Utrwalić poczwarki w 8% formaldehydzie, 1x PEM przez 6-8 h w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.</li>
 <li>Po zakończeniu utrwalania i przemyciu 1x PBS, przeciąć utrwaloną poczwarkę ostrym ostrzem na dwie części prostopadle do osi A/P.</li>
 <li>Zanurzyć oba fragmenty w medium Vectashield z dapi (Vector) i zamontować na szkiełkach podstawowych z przykrywkami (Lab-Tek) do obrazowania.</li>
 <li>Wykonać zdjęcia za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1510/1510fig1thumb.jpg" alt="Obrazowanie fluorescencyjne, schematy przedstawiające ekspresję białek u myszy, punkty czasowe, analiza optyczna." border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1510/1510fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.

<ol><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+and+listening+to+light%3A+the+evolution+of+whole-body+photonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging.</a> Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Na Rys. 1(a) przedstawiono rekonstrukcje in-vivo poczwarki oraz wykazujących ekspresję GFP gruczołów ślinowych prepupy D. melanogaster (pasek skali: 500 microns) wraz z odpowiadającą im histologią (kolor niebieski: barwienie dapi; kolor zielony: fluorescencja GFP). Na Rys. 1(b) przedstawiono serię obrazów time-lapse krążków imaginalnych skrzydła D. melanogaster. Obrazy zostały pozyskane z jednego żywego osobnika w czterech różnych punktach czasowych (0, 3.0, 3.5 i 6.5 hours). W pierwszej kolumnie pokaza...

mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Wizualizacja formowania się rozwijających się organów, a także progresji i leczenia chorób, często w dużym stopniu opiera się na możliwości optycznego badania zmian molekularnych i funkcjonalnych w nienaruszonych żywych organizmach. Większość istniejących metod obrazowania optycznego jest nieodpowiednia do obrazowania w wymiarach leżących pomiędzy granicami penetracji nowoczesnej mikroskopii optycznej (0,5-1mm) a ograniczeniami dyfuzyjnymi makroskopii optycznej (&gt;1cm) [1]. W związku z tym wiele ważnych organizmów modelowych, np. owady, embriony zwierzęce lub kończyny małych zwierząt, pozostaje niedostępnych dla optycznego obrazowania in-vivo.
Mimo rosnącego zainteresowania opracowywaniem metod obrazowania optycznego o rozdzielczości nanometrycznej, nie podjęto wielu skutecznych prób zwiększenia głębokości penetracji obrazowania. Możliwość wykonywania obrazowania in-vivo poza limitami mikroskopii napotyka w rzeczywistości trudności związane z rozpraszaniem fotonów występującym w tkankach. Niedawne próby obrazowania całych embrionów, na przykład [2,3], wymagają specjalnej obróbki chemicznej preparatu w celu usunięcia rozpraszania, co sprawia, że procedura ta nadaje się wyłącznie do obrazowania post-mortem. Metody te dowodzą jednak potrzeby obrazowania większych obiektów niż te, które są zazwyczaj dopuszczalne w mikroskopii dwufotonowej lub konfokalnej, szczególnie w biologii rozwoju i w poszukiwaniu nowych leków.
Opracowaliśmy nową technikę obrazowania optycznego o nazwie mezoskopowa tomografia fluorescencyjna [4], która jest odpowiednia do nieinwazyjnego obrazowania in vivo w wymiarach od 1mm do 5mm. Metoda ta poświęca rozdzielczość na rzecz głębokości penetracji, ale oferuje bezprecedensową wydajność obrazowania tomograficznego i została opracowana, aby wprowadzić czas jako nowy wymiar w obserwacjach biologii rozwoju (oraz potencjalnie w innych obszarach badań biologicznych), nadając zdolność obrazowania ewolucji odpowiedzi znakowanych fluorescencyjnie w czasie. W ten sposób może ona przyspieszyć badania zależności morfologicznych lub funkcjonalnych od mutacji genowych lub bodźców zewnętrznych i, co istotne, uchwycić pełny obraz rozwoju lub funkcji tkanki, umożliwiając podłużną wizualizację time-lapse tego samego, rozwijającego się organizmu.
Technika ta wykorzystuje zmodyfikowany mikroskop laboratoryjny oraz oświetlenie wieloprojekcyjne do zbierania danych w projekcjach 360 stopni. Stosuje ona uproszczenie Fermiego do rozwiązania równania Fokkera-Plancka dla równania transportu fotonów, w połączeniu z zasadami optyki geometrycznej, w celu opracowania realistycznego schematu inwersji odpowiedniego dla zakresu mezoskopowego. Umożliwia to wizualizację in-vivo całego ciała nieprzezroczystych struktur trójwymiarowych w próbkach o rozmiarach do kilku milimetrów.
Wykazaliśmy skuteczność tej techniki in vivo, obrazując trójwymiarowe struktury rozwijających się tkanek Drosophila in vivo oraz śledząc w czasie rzeczywistym morfogenezę skrzydeł u nieprzezroczystych pociorek Drosophila przez sześć kolejnych godzin.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Wizualizacja formowania się rozwijających się organów, a także progresji i leczenia chorób, często w dużej mierze opiera się na zdolności do optycznego badania...

Aby przeprowadzić rekonstrukcje rozwijających się organów u Drosophila melanogaster, musimy określić model przedni, który najlepiej opisuje propagację światła wewnątrz poczwarki. Procedurę rozpoczyna się od wyboru białej przepoczwarki i przyklejenia jej do końca rurki kapilarnej w taki sposób, aby oś przednio-tylna poczwarki była zorientowana równolegle do rurki. Małą rurkę kapilarną wypełnia się barwnikiem fluorescencyjnym i wprowadza do osłonki poczwarki.Po dokładnym ustawieniu osi, poczwarka zostaje obrócona o 360 stopni. Obrazy są pozyskiwane pod różnymi kątami. Uzyskane dane z fluorescencyjnego oświetlenia przechodzącego są wykorzystywane do określenia modelu bezpośredniego, który zostanie zastosowany do obrazowania rozwoju narządów.Witajcie, nazywam się Claudia i pracuję w Centrum Biologii Wspomagającej (Center for Assistance Biology) w Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Jestem Ula Petou z laboratorium Paramount w Harvard Medical School, a ja jestem Daniel Rozanski z Instytutu Obrazowania Biologicznego i Medycznego na Uniwersytecie Technicznym w Monachium oraz w Centrum Heliman w Monachium. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę trójwymiarowej rekonstrukcji cał

mesoscopic-fluorescence-tomography-for-vivo-imaging-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tomografia fluorescencyjna mezoskopowa do in-vivo obrazowania rozwijających się Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Metoda Tomato/GFP-FLP/FRT polega na wizualizacji mozaikowych komórek fotoreceptorowych u żywych Drosophila. Może być używany do śledzenia losów poszczególnych komórek fotoreceptorowych w siatkówce przez kilka dni lub tygodni. Metoda ta idealnie nadaje się do badań nad zwyrodnieniami siatkówki i chorobami neurodegeneracyjnymi czy rozwojem komórek fotoreceptorowych.

Metoda pomidorów/GFP-FLP/FRT do obrazowania na żywo mozaikowych dorosłych komórek fotoreceptorowych Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Poznaj mezoskopową tomografię fluorescencyjną do obrazowania in vivo rozwijających się narządów u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia trójwymiarową wizualizację całego ciała owada z wykorzystaniem modelu propagacji światła.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Przeglądaj więcej filmów