Name: Przygotowanie i hodowla eksplantatów nabłonka soczewki szczura do badania różnicowania końcowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Poznaj metodę hodowli eksplantatów nabłonka soczewki szczura do badania różnicowania końcowego komórek pod wpływem FGF-2. Technika ta umożliwia analizę ekspresji genów i sygnałowania w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przygotowanie eksplantatów nabłonka soczewki zostało zaadaptowane z metod opracowanych w laboratorium dr. Johna McAvoya 9. Praca ta jest finansowana przez National Eye Institute, Intramural Research Program Z01-EY000238-22

Część 1: Usunięcie soczewek
Materiały i odczynniki:
<ol>
<li>Nożyczki do mikrosekcji, zakrzywione, z tępymi końcówkami (np. RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD); pęseta do mikrosekcji, zakrzywiona końcówka (np. Roboz #RS5137).</li>
<li>Pożywka do zawiesiny: Medium 199 zawierające 0,1% albuminy surowicy bydlęcej, 100 units/ml penicyliny, 100μg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B. Odczynniki są dostępne w firmie Invitrogen, Carlsbad, CA.</li>
</ol>
Procedura:
<ol>
<li>Uśmierć noworodki szczurów (w wieku 2-4 dni) zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, Bethesda, MD.</li>
<li>Usuń powieki za pomocą nożyczek chirurgicznych. Delikatnie naciśnij zakrzywioną pęsetą po przeciwnych stronach oczodołu, aby wypchnąć gałkę oczną na zewnątrz. Wykonaj nożyczkami niewielkie nacięcie na tylnej stronie oka. Naciskając pęsetą bok oka przeciwległy do nacięcia, soczewkę wraz z niewielką ilością przylegającego ciała szklistego można wypchnąć przez otwór, co umożliwia pobranie soczewki zakrzywioną pęsetą. Należy zachować ostrożność, aby nie przerwać torebki soczewki.</li>
<li>Za pomocą zakrzywionej pęsety przenieś soczewki do plastikowej szalki hodowlanej o średnicy 60 mm zawierającej 5 ml ciepłego, sterylnego medium zawiesinowego.</li>
</ol>
Część 2: Mikrodysekcja eksplantów
Materiały i odczynniki:
<ol>
<li>Pęseta do mikrodisekcji, końcówki 0.1 mm (np. Roboz RS-4976). Stosujemy stop Dumostar ze względu na elastyczność końcówki, lecz dopuszczalne są również inne stopy stali. Nie zaleca się stosowania pęset z końcówkami cieńszymi niż 0.1 mm, ponieważ mają one tendencję do łamania się lub wyginania podczas tej procedury.</li>
<li>Medium do zawiesiny (patrz Część 1)</li>
<li>Nieuzupełnione medium Ham’s F12 lub Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)</li>
</ol>
Procedura:
<ol>
<li>Kolejne kroki należy przeprowadzić w czystym środowisku bez przeciągów, używając sterylnych narzędzi do mikrodysekcji oraz sterylnego medium.</li>
<li>Używając stereomikroskopu, oczyścić soczewki z przylegających tkanek za pomocą pęsety z końcówką 0,1 mm i przenieść je do drugiej szalki hodowlanej o średnicy 60 mm zawierającej 5 ml sterylnego medium zawiesinowego (krok ten pomaga zmniejszyć zanieczyszczenie). Pęsetą przenieść pożądaną liczbę soczewek do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm zawierającej 5 ml sterylnego, nieuzupełnionego medium. (W tym kroku często stosujemy medium Ham’s F12 (Invitrogen), ponieważ niższe stężenie barwnika ułatwia dysekcję; dopuszczalne jest jednak również Medium 199. Na tym etapie nie są wymagane antybiotyki ani inne dodatki). W centrum szalki tej wielkości można przygotować do 12 eksplantatów. Należy jednak używać szalki 35 mm nawet przy mniejszej liczbie eksplantatów, ponieważ w mniejszej szalce trudniej manipulować narzędziami do dysekcji). Szalkę z pozostałymi soczewkami przenieść do inkubatora do hodowli tkanek w temperaturze 37°C do czasu ich wykorzystania.</li>
<li>Zidentyfikować stronę tylną soczewki. Istnieje wiele sposobów na jej rozpoznanie: 1) Strona tylna jest bardziej okrągła niż przednia, która jest lekko spłaszczona; 2) W soczewkach noworodków szczurów w trakcie dysekcji, podczas chłodzenia do temperatury pokojowej, tworzą się tzw. zimne zaćmy. Jeśli zimna zaćma nie wypełniła całkowicie soczewki, stroną tylną jest ta, która znajduje się najdalej od obszaru nieprzezroczystego. Jeśli nieprzezroczystość wypełniła całą soczewkę, ogrzanie szalki do 37°C przez kilka minut cofnie ten proces. Stronę tylną można zidentyfikować, gdy zaćma ponownie uformuje się podczas chłodzenia. 3) Na stronie tylnej mogą być widoczne pozostałości tunica vasculosa lentis. 4) Na stronie tylnej może być widoczna szew tylny. Prawidłowa identyfikacja strony tylnej jest kluczowa, ponieważ to właśnie w tym miejscu zostanie otwarta torebka. Otwarcie soczewki od strony przedniej spowoduje rozerwanie nabłonka.</li>
<li>Po zidentyfikowaniu strony tylnej, należy ją odwrócić górą do góry i uchwycić soczewkę lewą pęsetą (w przypadku osoby praworęcznej). Następnie ucisnąć torebkę tylną prawą pęsetą, aby stworzyć małe zagięcie.</li>
<li>Trzymając torebkę tylną prawą pęsetą, uchwycić zagięcie torebki lewą pęsetą i rozsunąć obie pęsety w przeciwnych kierunkach, aby wykonać małe nacięcie w torebce.</li>
<li>Trzymając pęsetą krawędź odsuwanej torebki, pociągnąć ją w dół, najpierw z jednej strony, a potem z drugiej, dociskając ją pęsetą do plastiku szalki. Powtórzyć tę czynność kilka razy, przesuwając się wokół równika soczewki, aż torebka zostanie mocno przytwierdzona do płytki w wielu punktach. Trzymając torebkę w miejscu lewą pęsetą, delikatnie poruszać masą włókien prawą pęsetą, aby przerwać połączenie między komórkami włókien a komórkami nabłonka na równiku soczewki. Następnie odsunąć masę włókien, zsuwając ją z torebki/nabłonka, które pozostają przytwierdzone do dna szalki. Kontynuować ten proces dla wszystkich soczewek w szalce. Usunąć i zutylizować masy włókien (lub zamrozić je jako źródło białek soczewki do innych badań).</li>
</ol>
Część 3: Mikrodyssekcja i hodowla eksplantów centralnych
Materiały i odczynniki:
<ol>
<li>Sterylny skalpel jednorazowy, ostrze #15, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH)</li>
<li>Sterylny roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym z dodatkiem wapnia i magnezu (Invitrogen, Carlsbad, CA)</li>
<li>Pożywka hodowlana: pożywka do zawiesiny zawierająca 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO).</li>
</ol>
Procedura:
<ol>
<li>Za pomocą sterylnego skalpela odetnij nabłonek obwodowy (PE), który zawiera komórki we wczesnych stadiach różnicowania (Rycina 1A), pozostawiając centralny kwadrat o boku około 2,0 mm, składający się wyłącznie z centralnych komórek nabłonkowych (CE) (Rycina 1B).</li>
<li>Przenieś szalkę zawierającą eksplantaty centralne do komory z laminarnym przepływem powietrza. Przemyj 3 razy sterylnym PBS z dodatkiem wapnia i magnezu oraz raz 1 ml świeżego, zrównoważonego (37°C, 5% CO2) medium zawiesinowego. Przemycia te znacznie zmniejszają ryzyko kontaminacji.</li>
<li>Dodaj 2 ml pożywki hodowlanej w celu indukcji różnicowania1 i umieść eksplantaty w inkubatorze do hodowli tkanek z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5% CO2. Okresy hodowli mogą trwać od kilku godzin do dwóch lub trzech tygodni, w zależności od badanego parametru. Pożywkę należy wymieniać co dwa do trzech dni.</li>
</ol>
Część 4: Pozyskiwanie eksplantów do analizy zdarzeń związanych z różnicowaniem
1. Pobieranie eksplantów do analizy białek lub RNA 
	Materiały:
	<ol>
 	<li>Pęseta do mikrosekcji</li>
	<li>Bufor lizujący SDS lub RNA-later</li>
	</ol>
	Procedura:
	<ol>
		<li>Po zakończeniu okresu inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną.</li>
		<li>Używając stereomikroskopu sekcyjnego, delikatnie poluzować brzegi każdego eksplantu.</li>
		<li>Podnieść każdy eksplant pęsetą i przenieść go do probówki zawierającej około 100μl buforu lizującego SDS (do analizy białek) lub RNA-later (do analizy RNA). Poruszyć końcówką pęsety w roztworze, aby upewnić się, że eksplant nie przywarł do pęsety.</li>
	</ol>
2. Pobieranie eksplantów do immunofluorescencji
Materiały i odczynniki:
	<ol>
		<li>Fosforan buforowany roztwór soli z dodatkiem wapnia i magnezu (Invitrogen, Carlsbad, CA)</li>
		<li>Fosforan buforowany roztwór soli (bez wapnia i magnezu) (Invitrogen, Carlsbad, CA)</li>
		<li>4% paraformaldehyd (Boston Bioproducts, Worcester, MA)</li>
		<li>Pincety do mikrosekcji</li>
		<li>Hydrofobowy marker do znakowania</li>
		<li>Szklane laminki mikroskopowe</li>
		<li>0.25% Triton X-100 w fosforanie buforowanym roztworze soli.</li>
	</ol>
	Procedura:
	<ol>
		<li>Krótko opłucz eksplantaty w PBS zawierającym wapń i magnez.</li>
		<li>Utrwal tkanki, dodając 4% paraformaldehyd na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń utrwalacz i zastąp go solą fizjologiczną z buforem fosforanowym. Utrwalone eksplantaty stają się nieco sztywniejsze, co pozwala na ich podniesienie i przeniesienie na szkiełka przedmiotowe w celu przeprowadzenia immunobarwienia.</li>
		<li>Nanieś na szkiełko małą kroplę PBS (bez wapnia i magnezu), aby ułatwić ułożenie tkanki i zapobiec jej zwijaniu się. Używając pęsety do mikrodysekcji, podnieś eksplantat i umieść go w kropli na szkiełku. Nie dotykając eksplantatu, ostrożnie usuń nadmiar cieczy za pomocą papierowego knotka, aby spłaszczyć eksplantat na szkle, a następnie pozostaw tkankę do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 3 do 5 minut.</li>
	</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="fluorescence microscopy membrane structure, cross-section diagram, cellular study comparison" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> Rycina 1 A. Nabłonek obwodowy wykazuje ekspresję białek specyficznych dla różnicowania. Przedstawiony eksplant został poddany immunostainacji w kierunku N-kadheryny bezpośrednio po mikrodysekcji. Ekspresja jest widoczna w pasmie komórek w nabłonku obwodowym, co wskazuje na rozpoczęcie procesu różnicowania komórek w tym regionie. B. Obwodowy nabłonek można przyciąć, aby usunąć komórki wykazujące ekspresję N-kadheryny oraz innych białek specyficznych dla różnicowania. Czerwony pierścień oznacza obszar występowania komórek wykazujących ekspresję N-kadheryny, natomiast mały kwadrat obwiedziony szarym kolorem reprezentuje ćwiartkę nabłonka przedstawioną na panelu 1A. Nabłonek obwodowy można usunąć za pomocą czterech cięć skalpelem, pozostawiając centralny kwadrat zawierający wyłącznie komórki, które nie rozpoczęły jeszcze procesu różnicowania.

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

System eksplantów soczewki szczura był z sukcesem wykorzystywany przez wiele laboratoriów do badania terminalnego różnicowania się komórek nabłonka soczewki w włókna soczewki 21,3,4,5. Po ekspozycji na FGF-2 w stężeniu 100ng/ml eksplanty zaczynają wykazywać zmiany w sygnalizacji w ciągu kilku minut 6, natomiast zmiany w morfologii i ekspresji genów pojawiają się sekwencyjnie w ciągu kilku dni 3,4,5. Hodowle pozostają żywotne przez 2-3 tygodnie, pod warunkiem zachowania ostrożności w celu zapobiegania kontaminacji.
Wyjaśnione w niniejszym protokole eksplanty centralne są szczególnie użyteczne do badania sekwencji zdarzeń związanych z różnicowaniem, ponieważ zawierają niewiele lub żadnych komórek wykazujących ekspresję markerów różnicowania przed dodaniem FGF-2 1,5. Komórki różnicują się następnie synchronicznie, jako jedna grupa, co umożliwia śledzenie przebiegu czasowego zdarzeń sygnałowych i transkrypcyjnych związanych z różnicowaniem. Hodowla eksplantów przez różne okresy czasu dostarcza zatem dokładnych informacji czasowych na temat sekwencji zdarzeń. Do pożywki hodowlanej można dodać specyficzne inhibitory w celu zidentyfikowania istotnych szlaków sygnałowych. Eksplanty mogą być wykorzystywane do analizy ekspresji białek za pomocą elektroforezy w żelu SDS i immunoblotingu lub do analizy ekspresji specyficznych mRNA za pomocą RT-PCR. Wydajność białka wynosi od 20-50 μg/explant, a wydajność RNA wynosi około 200 – 600 ng/explant, w zależności od długości okresu hodowli. Zazwyczaj stwierdzamy, że 5-6 eksplantów na szalkę zapewni wystarczającą ilość białka lub RNA do przeprowadzenia kilku analiz. RNA z eksplantów może być również wykorzystane do przygotowania cDNA w celu oceny ekspresji genów za pomocą analizy mikromacierzy, która może zidentyfikować nowe geny krytyczne dla różnicowania. Eksplanty można również transfekować. Chociaż wydajność transfekcji jest zazwyczaj niska, jest ona wystarczająca do badania genów reporterowych 4;7;8. Mikroskopia immunofluorescencyjna eksplantów stanowi użyteczne uzupełnienie metod biochemicznych, pozwalając na określenie subkomórkowej lokalizacji białek zainteresowania. Zatem preparatyka i hodowla eksplantów soczewki szczura stanowi potężny system do badania terminalnego różnicowania soczewki u ssaków, który może uzupełniać techniki in vivo, takie jak generowanie myszy transgenicznych i knock-out.

przygotowanie i hodowla eksplantów nabłonka soczewki szczura do badań nad różnicowaniem terminalnym

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Przednia powierzchnia soczewki oka pokryta jest monowarstwą komórek nabłonkowych, które proliferują w strefie pierścieniowatej znajdującej się pod ciałem rzęskowym. Po podziale komórki te migrują w kierunku tylnym, gdzie dyfundujący z siatkówki FGF indukuje ich różnicowanie w tylny układ wydłużonych komórek włókien soczewki, które stanowią główną masę soczewki. Różnicowanie komórek nabłonkowych soczewki w włókna soczewki można indukować in vitro, hodując eksplanty centralnego regionu nabłonka przedniego w obecności FGF-2. Eksplanty przygotowuje się z soczewek nowonarodzonych szczurów poprzez usunięcie soczewki z oka i uchwycenie torebki soczewki po stronie tylnej pęsetą sekcyjną. Następnie tylna torebka jest delikatnie rozrywana i dociskana do plastikowego dna naczynia do hodowli tkanek. Regiony peryferyjne eksplantu usuwa się skalpelem, a obszar centralny hoduje się w obecności 100 ng/ml FGF-2 przez okres od 2 do 3 tygodni, w zależności od parametrów poddawanych badaniu. Ponieważ komórki nabłonkowe w hodowanych eksplantach różnicują się w przybliżeniu synchronicznie w okresie od kilku dni do kilku tygodni, przebieg czasowy sygnalizacji i ekspresji genów można określić za pomocą technik molekularnych, biochemicznych i farmakologicznych. Mikroskopia immunofluorescencyjna stanowi potężne uzupełnienie tych metod, ponieważ pozwala na wykazanie subkomórkowej lokalizacji interesujących białek oraz może ujawnić fizjologiczne skutki eksperymentalnych manipulacji szlakami sygnalizacyjnymi.

Eksplanty z regionu centralnego nabłonka soczewki szczura różnicują się synchronicznie podczas hodowli w obecności FGF-2. Mikroskopia immunofluorescencyjna takich hodowli może dostarczyć nowych informacji na temat ekspresji genów i zdarzeń sygnalizacyjnych związanych z różnicowaniem końcowym.

Przygotowanie i hodowla eksplantów nabłonka soczewki szczura do badań nad różnicowaniem terminalnym

Przednia powierzchnia soczewki oka jest pokryta monowarstwą komórek nabłonkowych, które proliferują w strefie pierścieniowatej położonej pod ciałem rzęskowym.

Procedura rozpoczyna się od usunięcia soczewek z szczurów w wieku od dwóch do czterech dni oraz oczyszczenia ich z przylegającej tkanki. Po zidentyfikowaniu tylnej strony soczewki w torebce wykonuje się niewielkie nacięcie. Następnie torebka jest odwarstwiana w dół i dociskana do dna naczynia.Proces ten powtarza się wokół całej soczewki. Masę włókien soczewki usuwa się poprzez kołysanie nią na boki. Nabłonek obwodowy zostaje wycięty, a następnie poddany hodowli.Na koniec przenosi się je do probówki w celu analizy biochemicznej lub na szkiełko przedmiotowe do badania mikroskopowego. Witam, jestem Peggy Lanka z laboratorium Biologii Molekularnej i Rozwojowej w Narodowym Instytucie Oka (National Eye Institute) w NIH. Witam, jestem Al Tu, również z laboratorium Biologii Molekularnej i Rozwojowej w Narodowym Instytucie Oka.Jestem Chung Ga, również z tego samego laboratorium w NEI. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i hodowli komórek nabłonka soczewki szczurów noworodków. Pokażemy, jak usunąć obwodowy region nabłonka, który zawiera komórki we wczesnych stadiach różnicowania.Następnie pokażemy, jak indukować różnicowanie pozostałych centralnych komórek nabłonka soczewki w celu utworzenia włókien soczewki poprzez poddanie ich działaniu FGF. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać czas przebiegu zdarzeń zaangażowanych w różnicowanie terminalne. Pobieramy EXPLAN w różnych odstępach czasu po dodaniu FGF do pożywki hodowlanej.Następnie analizujemy ekspresję białek za pomocą techniki western blotting, ekspresję RNA za pomocą R-T-P-C-R lub mikromacierzy, a następnie przeprowadzamy barwienie immunocytochemiczne eksplantów, aby określić lokalizację subkomórkową białek będących przedmiotem zainteresowania. Zacznijmy zatem od pobrania soczewek od noworodków szczurów. Na początek, użyj nożyczek do mikrodisekcji, aby usunąć soczewki z oczu uśpionych szczurów w wieku od dwóch do czterech dni, wykonując niewielkie nacięcie tylne i naciskając z przeciwległej strony.Przenieść soczewki do 60 milimetrowej plastikowej szalki hodowlanej zawierającej pięć mililitrów ciepłego, sterylnego medium zawiesinowego, używając pęsety z końcówkami 0,1 milimetra. Oczyścić soczewki z przylegającej tkanki i przenieść je do drugiej 60 milimetrowej szalki hodowlanej zawierającej pięć mililitrów sterylnego medium zawiesinowego. Pomaga to ograniczyć zanieczyszczenie wprowadzone pęsetą.Przenieś odpowiednią liczbę soczewek do 35 milimetrowej szalki hodowlanej zawierającej dwa mililitry sterylnego medium uzupełnionego o unsu. W centrum szalki o tej wielkości można przygotować do 12 eksplantów. Nadmiarowe soczewki można przechowywać we wspomnianej wcześniej drugiej 60 milimetrowej szalce w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza do godziny przed ich wykorzystaniem do przygotowania eksplantów.Teraz zidentyfikuj tylną stronę soczewki. W przypadku tych dwóch widzę, że leżą one stroną przednią do góry. Obrócę je krawędzią do góry, aby można było spojrzeć w głąb; wówczas będzie widoczna katarakta zimnowodna, czyli nieprzezroczysty obszar w centrum.Strona najdalej oddalona od nieprzezroczystego centrum to strona tylna. Odwracam więc preparat na stronę tylną. Na stronie tylnej widoczne są również te prążkowania, które są pozostałością tego zapalenia naczyń tenalnych.Jest to układ naczyń krwionośnych wokół obwodu soczewki, który wyznacza również jej stronę tylną. Zgadza się. Identyfikacja jest kluczowa, ponieważ to właśnie w tym miejscu zostanie dokonane otwarcie torebki. Otwarcie soczewki od strony przedniej spowoduje przerwanie nabłonka.Istnieje wiele sposobów na zidentyfikowanie strony tylnej. Po pierwsze, jest ona bardziej zaokrąglona niż strona przednia, która jest lekko spłaszczona. Po drugie, w soczewkach noworodków szczura podczas sekcji, w miarę chłodzenia do temperatury pokojowej, powstają tzw. zimne zaćmy.Jeśli zimna katarakta nie wypełniła jeszcze całkowicie soczewki, stroną tylną jest strona najdalej oddalona od obszaru nieprzezroczystego. Jeśli zmętnienie wypełniło soczewkę, ogrzanie naczynia do 37 °C przez kilka minut spowoduje jego cofnięcie. Stronę tylną można zidentyfikować w momencie, gdy katarakta ponownie formuje się podczas chłodzenia.Na stronie tylnej mogą być widoczne trzecie pozostałości tunica VASIs. Wreszcie, na stronie tylnej może być widoczna szew tylny. Po zidentyfikowaniu strony tylnej, należy obrócić ją ku górze i podtrzymać soczewkę lewym pęsetem.Następnie należy ucisnąć tylną torebkę prawą pęsetą, aby utworzyć małe fałdowanie, a trzymając tylną torebkę prawą pęsetą, chwycić fałd torebki lewą pęsetą i pociągnąć obie pęsety w przeciwnych kierunkach, aby wykonać małe nacięcie w torebce; trzymając krawędź cofającej się torebki pęsetą, należy pociągnąć ją najpierw w dół po jednej stronie, a następnie po drugiej, dociskając ją pęsetą do plastiku szalki. Czynność tę należy powtórzyć kilka razy, przesuwając się wokół całego równika soczewki, aż torebka zostanie mocno przytwierdzona do płytki. W wielu punktach, przytrzymując torebkę lewą pęsetą, należy delikatnie poruszać masą włókien prawą pęsetą, aby przerwać połączenie między komórkami włókien a komórkami nabłonka na równiku soczewki.Teraz delikatnie odciągnij masę włókien, zsuwając ją z torebki, która pozostaje przytwierdzona do dna szalki. Powtórz ten proces dla wszystkich soczewek w szalce. Masy włókien można wyrzucić lub zamrozić i zachować jako źródło białek soczewki do innych badań, kończąc tym samym mikrodysekcję całych eksplantów nabłonkowych.Przejdźmy do mikrodysekcji i hodowli centralnej części plamki. Za pomocą sterylnego skalpela odetnij nabłonek obwodowy, który zawiera komórki we wczesnych stadiach różnicowania. Pozostaw centralny kwadrat o boku około 2 mm, składający się z centralnych komórek nabłonka.Jedynie naczynie zawierające centralny eksplant przenieść do komory z laminarnym przepływem powietrza. Przemyć eksplanty trzykrotnie sterylnym PBS oraz raz jednym mililitrem świeżego, zrównoważonego medium zawiesinowego. Następnie dodać dwa mililitry medium hodowlanego w celu indukcji różnicowania i umieścić eksplant w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide.Okres hodowli może trwać od kilku godzin do dwóch lub trzech tygodni, w zależności od badanego parametru. Pożywkę należy wymieniać co dwa do trzech dni przy użyciu mikrodysekcji i pełnej kompletności Turinga. Przejdźmy do pobierania eksplantów do analizy.Po zakończeniu okresu inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pęsety mikrosekcyjnej. Delikatnie poluzować brzegi każdego eksplantu. Chwycić każdy eksplant pęsetą i przenieść go do probówki zawierającej około 100 µL buforu lizującego SDS do analizy białek lub RNA later do analizy RNA, poruszając końcówką pęsety w roztworze, aby upewnić się, że eksplant nie przywarł do narzędzia.Preparaty są teraz gotowe do analizy białek lub RNA; preparaty można również analizować za pomocą immunofluorescencji. Aby rozpocząć, krótko przepłucz preparaty w PBS. Utrwal tkanki, dodając 4% paraformaldehyd na 30 minut.W temperaturze pokojowej usunąć utrwalacz i zastąpić go PBS. Utrwalone wycinki stają się nieco sztywne, co umożliwia ich podniesienie i przeniesienie na szkiełka przedmiotowe w celu przeprowadzenia barwienia immunocytochemicznego. Na szkiełko nanieść małą kroplę PBS bez jonów wapnia i magnezu, aby ułatwić pozycjonowanie tkanki i zapobiec jej zwijaniu się. Za pomocą pęsety mikrodisekcyjnej podnieść wycinek i umieścić go w kropli na szkiełku, uważając, aby nie dotknąć samego wycinka. Ostrożnie użyć papierowego knotka do usunięcia nadmiaru cieczy i rozpłaszczenia wycinka na szkle.Pozostawić tkankę do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez trzy do pięciu minut. Implanty są teraz gotowe do analizy immunofluorescencyjnej. Przedstawiono tutaj przykład mikrodysekcji całego eksplantu nabłonkowego, który został poddany immunobarwieniu na NCO adher, będący markerem komórek.We wczesnych etapach różnicowania tylko komórki w obszarze obwodowym nabłonka wykazują pozytywne barwienie na to białko. Nabłonek obwodowy, opisany w niniejszym protokole, pozostawia centralną część, która zawiera niewiele lub żadnych komórek wykazujących ekspresję. Zostało to wykazane za pomocą techniki western blotting; tkanki nabłonka centralnego i obwodowego poddano analizie western blotting w celu oceny poziomu białka, a western blotting dla GAPDH wykorzystano do potwierdzenia, że próbki białek zostały naniesione w równych ilościach.Czas wystąpienia zdarzeń związanych z różnicowaniem można określić poprzez hodowlę centralnych eksplantów przez różne okresy czasu. Centralne eksplanty hodowano przez 2, 5, 24 i 48 godzin w pożywce z dodatkiem lub bez dodatku 100 ng/mL FGF. Eksplanty pobrano we wskazanych punktach czasowych i przeniesiono do buforu do próbek SDS w celu analizy metodą western blotting.Wyniki pokazują, że końcowa koherentna ekspresja białka jest indukowana po 24 do 48 godzinach hodowli. Analiza Western blot dla GA DH wykazuje, że próbki białek zostały naniesione w równych ilościach.Immunobarwienie eksplantów centralnych hodowanych przez cztery dni w obecności lub przy braku 100 ng/ml FGF wykazuje, że immunofluorescencja N-kadheryny jest silnie podwyższona w eksplantach narażonych na FGF. Immunofluorescencja pokazuje również subkomórkową lokalizację N-kadheryny na granicach międzykomórkowych.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przygotowania hodowli komórek nabłonka soczewki do badania różnicowania. Główną zaletą tego układu jest fakt, że komórki różnicują się synchronicznie. Umożliwia to określenie sekwencji zdarzeń.Dodatkowo do pożywki można dodać specyficzne czynniki wzrostu lub inhibitory, aby aktywować lub blokować określone szlaki sygnałowe. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapobiegać kontaminacji, przeprowadzając sekcję i przygotowując sterylne pożywki w czystym środowisku oraz dokładnie sprawdzając eksplantaty przed ich hodowlą. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu. Do widzenia.

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie i hodowla eksplantów nabłonka soczewki szczura w celu badania różnicowania terminalnego

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Angiogeneza obejmuje interakcje wielokomórkowe, wielosystemowe, które muszą być badane w fizjologicznie odpowiednim środowisku. Celem tego badania jest wykazanie zdolności modelu hodowli krezki szczurów do dokonywania poklatkowych porównań nienaruszonych sieci mikronaczyniowych podczas angiogenezy.

Metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Protokół opisuje organotypowe eksplantaty myszy neuroretina, hodowana razem z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE), w pożywce zdefiniowanej przez R16, wolna od surowicy i antybiotyków. Metoda ta jest stosunkowo prosta do wykonania, tańsza i bardziej czasochłonna w porównaniu z eksperymentami in vivo i może być dostosowana do wielu zastosowań eksperymentalnych.

Długotrwała, pozbawiona surowicy hodowla organtypowych eksplantatów siatkówki myszy z nienaruszonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wideo do hodowli komórek nabłonka soczewki pierwotnej (LEC), mający na celu poprawę odtwarzalności i pomoc w badaniach nad zaćmą i zmętnieniem torebki tylnej (PCO). Oferuje instrukcje krok po kroku dotyczące rozwarstwiania soczewek, izolacji LEC i walidacji, służąc jako cenny przewodnik, szczególnie dla nowicjuszy w tej dziedzinie.

Optymalizacja hodowli komórek nabłonka soczewek pierwotnych myszy: kompleksowy przewodnik po trypsynizacji

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Protokół ten szczegółowo opisuje oddzielenie nabłonka soczewki oka myszy od masy masowej komórek włóknistych, a następnie izolację RNA i analizę qPCR. Metoda ta pozwala na oddzielenie przedziałów komórek soczewki w celu bardziej szczegółowej analizy transkryptomu i procesów biologicznych w komórkach nabłonkowych w porównaniu ze zróżnicowanymi komórkami włóknistymi.

Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych

Poznaj metodę hodowli eksplantatów nabłonka soczewki szczura do badania różnicowania końcowego komórek pod wpływem FGF-2. Technika ta umożliwia analizę ekspresji genów i sygnałowania w biologii rozwoju.

Przygotowanie i hodowla eksplantów nabłonka soczewki szczura do badań nad różnicowaniem terminalnym

Przeglądaj więcej filmów