Name: Hodowla prekursorów mysich neuronalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 44 s
Description: Naucz się izolować prekursory neuronalne z kory mózgowej myszy embrionalnych. Ta metoda obejmuje wyłuskiwanie tkanek, trawienie enzymatyczne i hodowlę komórek na lamininie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
<li>Mysie prekursory neuronalne (NPCs) wyizolowano z kory zarodka w stadium E12.5.</li>
<li>Warstwy skóry oraz mezenchymy usunięto z wypreparowanych pęcherzyków mózgowia przedniego.</li>
<li>Pęcherzyki inkubowano przez 20 minut w temperaturze 37°C w 0,05% trypsynie z 0,02% EDTA i 0,2% BSA w HBSS.</li>
<li>Trypsynizację przerwano, dodając równą objętość 1 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej (Sigma #T6522) w HBSS.</li>
<li>Trawione tkanki rozdzielono za pomocą kilku cykli trituracji przy użyciu wypalanych pipet Pasteura.</li>
<li>Komórki przemyto raz w 0,2% BSA w HBSS i wysiano w zagęszczeniu 50 000 cells/ml na pokrywki szkiełkowe pokryte lamininą w pożywce zawierającej 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF2 (R&amp;D Systems lub Peprotech) oraz 2 ug/ml heparyny (Sigma).</li>
</ol>

<ol><li>Currle, D., Cheng, X., Hsu, C., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+roles+of+CNS+dorsal+midline+cells+in+choroid+plexus+epithelial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect roles of CNS dorsal midline cells in choroid plexus epithelial formation.</a> Development. 132 (15), 3549-3559 (2005).</li>
<li>Flanagan, L., Rebaza, L., Derzic, S., Schwartz, P., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J Neurosci Res. 83, 845-856 (2006).</li>
</ol>

Znaczące postępy w rozumieniu rozwoju OUN oraz biologii komórek macierzystych stały się możliwe dzięki zdolności do pozyskiwania, izolowania i hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych. Niniejszy film prezentuje sekcję kory mózgowej myszy w stadium E12.5, a następnie dysagregację i hodowlę embrionalnych neuralnych komórek macierzystych. Wiele innych podobnych metod zostało z powodzeniem zastosowanych przez innych badaczy.

<table><tbody><tr><td>Proste nożyczki irydologiczne</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki średnie</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Pierwotne hodowle neuralnych komórek macierzystych są przydatne w badaniu mechanizmów leżących u podstaw rozwoju ośrodkowego układu nerwowego. Badania nad komórkami macierzystymi zwiększą naszą wiedzę na temat układu nerwowego i mogą pozwolić na opracowanie metod leczenia obecnie nieuleczalnych chorób i urazów mózgu. Ponadto komórki macierzyste powinny być wykorzystywane w badaniach ukierunkowanych na szczegółową analizę mechanizmów różnicowania i transróżnicowania neuralnego oraz sygnałów genetycznych i środowiskowych, które kierują specjalizacją komórek w konkretne typy komórkowe. Niniejszy film prezentuje technikę stosowaną do dysagregacji komórek z grzbietowej części przedmózgowia myszy w 12,5 dniu embrionalnym. Procedura sekcji obejmuje pobranie embrionów myszy E12.5 z macicy, usunięcie „skóry” za pomocą precyzyjnej pęsety i wreszcie wyizolowanie fragmentów kory mózgowej. Po sekcji tkanka zostaje poddana trawieniu i dysocjacji mechanicznej. Resuspensowane, zdysocjowane komórki są następnie hodowane w pożywce do „komórek macierzystych”, która sprzyja wzrostowi neuralnych komórek macierzystych.

W tym filmie opisano metodę izolacji neuroprekursorów z rozwijającej się kory zarodków myszy. Przedstawiono procedurę usuwania zarodków z macicy, wycinania tkanki korowej oraz trawienia wyizolowanej kory mózgu.

Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

Podstawowe hodowle neuralnych komórek macierzystych są użyteczne w badaniu mechanizmów leżących u podstaw rozwoju ośrodkowego układu nerwowego. Badania nad komórkami macierzystymi przyczynią się do zwiększenia...

Jest to pierwszy krok w procesie izolacji, dysocjacji i hodowli prekursorowych komórek neuronalnych. Najpierw powlekam płytkę 24-dołkową. Nie jest ona przeznaczona do hodowli tkankowej.Pokryję to lamininą, aby komórki mogły przylgnąć. Najpierw pokryję powierzchnię mieszaniną wody i poli-D-lizyny. Dodam około 450 µL na dołek.Więc teraz, pokryłem połowę płytki, te dwa rzędy tutaj, roztworem poli-D-lizyny. Będę inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, tutaj w dygestorium. Minęło pięć minut inkubacji.Usunę teraz roztwór PDL za pomocą odsysacza. Standardowy odsysacz laboratoryjny. Teraz ponownie wypłuczę dołki wodą, około 450 µL.Rzeczywiście, płukanie wodą nie wymaga inkubacji. Przystępuję zatem do odessania wody. Teraz dodam roztwór laminujący.Lamininę rozpuszczono w pożywce EM EM w stężeniu 2 µg/mL. Do każdej studzienki dodam teraz 450 µL roztworu lamininy; w tej chwili używam plastiku, ale w studzienkach można było również zastosować szkiełka podstawowe.Komórki będą inkubowane w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkankowych przez co najmniej cztery godziny. Posiadam dwie pęsety precyzyjne zgięte pod kątem 45 stopni oraz nożyczki precyzyjne, również zgięte pod kątem 45 stopni.Kilka pęset tępych do wstępnej sekcji macicy oraz duże nożyczki do rozcinania tkanek samicy. Dobrze, to jest samica CD1, normalna. Jest w ciąży z embrionami w 12,5 dniu rozwoju.Zutylizowałam już zwierzę, stosując uduszenie CO2 oraz zwichnięcie stawów atlasowo-oczodołowych. Teraz przystąpię do usunięcia macicy, a następnie embrionów. Najpierw muszę zdezynfekować obszar brzucha za pomocą 70% etanolu.Dużą pęsetą chwytam środek jamy brzusznej i jej dolną połowę, wykonuję jedno cięcie, odkładam instrumenty i po prostu rozrywam skórę, ponownie odsłaniając jamę brzuszną, chwytając w tym samym miejscu. Wykonuję kolejne cięcie w środku i tnę bocznie, otwierając samicę. Teraz odsłaniam embriony.Oto jej macica, powiększona przez embriony. Wykonuję zatem pierwsze cięcie tuż poniżej jajników, odcinając po drodze tkankę tłuszczową i pociągając ku górze. Kładę tę stronę na dole i chwytam jedynie przestrzenie między embrionami.Oczywiście, chwytanie embrionów od góry mogłoby uszkodzić tkankę. Jest to oczywiste. Przypominają one kiść winogron.Chwyć ponownie pomiędzy winogronami, przecinając nad zalążnią z drugiej strony i usuwając nadmiar tkanki. Ostatnie cięcie zostanie wykonane tutaj, w środku. Ponownie usuwam nadmiar tkanki.Oto macica z zarodkami. Jako medium do sekcji stosuję PBS z 0,6% glukozy oraz penicyliną i streptomycyną. Najpierw przepłuczę zarodki w medium do sekcji, aby usunąć krew.Moja sekcja jest zatem czysta. Przetnę teraz wzdłuż macicy po przeciwnej stronie niż znajduje się tkanka tłuszczowa, aby odsłonić zarodki. Gdzie jest tkanka tłuszczowa?Znajduje się po drugiej stronie, dlatego go nie widać. Tutaj mamy odsłonięty embrion. Mogę pokazać Państwu, jak to wygląda pod mikroskopem.Oto jak wygląda to pod mikroskopem. Będę ciąć wzdłuż tej strony macicy. Po przeciwnej stronie znajduje się tkanka tłuszczowa.Tutaj widać tkankę tłuszczową, wyraźnie ją dostrzegam. Przetnę więc wzdłuż całej długości, aż do samego dołu. Widać, że zarodki będą wyskakiwać w miarę jak będę przecinać macicę w dół.Trochę bardziej na północ. O, jest jeden. Wspaniały. Zatem tniemy wzdłuż strony przeciwległej do tłustych embrionów, które właśnie wypadają.Tak, wszystkie takie są. Jest tu kilka elementów, do których trzeba czasem wrócić i coś otworzyć, jeśli się to przeoczyło. Zatem to jest błona owodniowa, a to jest błona pozaplacentowa – to tutaj jest błona pozaplacentowa.Błona owodniowa znajduje się wewnątrz i jest ściśle powiązana z zarodkiem. Widzą państwo, że z tej perspektywy nie można dostrzec owodni. Gdy wyjmę zarodek, będę mógł stwierdzić, że te są zbyt małe i nie będę z nich korzystał.W ten sposób wszystkie zarodki zostały odsłonięte. Teraz, gdy zarodki są odsłonięte, będę usuwać warstwy z zarodka, a następnie przeniosę go do czystej szalki w celu przeprowadzenia precyzyjnej sekcji.Oto pierwsza warstwa. Po jej usunięciu zazwyczaj szukam pępowiny. Jest to dość twarda tkanka.A następnie mogę podnieść zwierzę za pępowinę. To właśnie to. Czy możesz na nią wskazać?Tak, dokładnie tam. Proszę spojrzeć na to czerwone naczynie, tę cienką strukturę. Tak. To jest pępowina, która przyczepia się do brzucha; zazwyczaj po prostu sięgam do środka i ją chwytam.Gotowe. Teraz usunę skórę z głowy zarodka. W ten sposób odsłonię korę mózgową, z której pobiorę komórki.Zatem lewą ręką przebiję tylną część zarodka, aby go tak przytrzymać. Przytrzymuję go przy dnie płytki. Prawą ręką, za pomocą pęsety, wejdę pod oko, pod skórę, przebijając ją, a następnie ją oderwę.Mam teraz krawędź, którą mogę chwycić. Dobrze. Następnie drugą ręką chwytam przeciwległą krawędź i oddzielam skórę, a zazwyczaj wraz z nią odchodzi leżący pod nią mezenchym. Teraz widać odsłoniętą prawą półkulę.Obrócę zarodek i spróbuję znaleźć inną krawędź, którą można chwycić. Oto kolejna krawędź skóry. Obracam go i kontynuuję oddzielanie.Gotowe. Odsłoniliśmy korę mózgową. Teraz po prostu odetnę głowę, co pozwoli mi zająć lepszą pozycję do usunięcia fragmentów kory mózgowej.Chwytam więc pęsetą, pocieram drugą pęsetą od spodu, odcinając fragment. Oto widok grzbietowy. Tutaj można zobaczyć widok grzbietowy przedmózgowia, dwie półkule kory mózgowej, diencefalon, a w tej okolicy śródmózgowie.Oto sposób pobierania fragmentów do hodowli neuronalnych komórek macierzystych. Teraz chwytam zarodek lewą pęsetą, aby go w ten sposób unieruchomić. Ustawiam go w odpowiedniej pozycji i pod takim kątem, aby wyciąć fragmenty kory.Teraz za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonuję nacięcie przedniej kory mózgowej w ten sposób. Wycinam otwór, aby móc wykonać cięcie boczne; prowadzę je blisko grzbietowej linii środkowej, unikając jednak komórek linii środkowej, aby wyizolować prekursory neuronalne znajdujące się w korze. To jest fragment kory mózgowej.Jak widać, po prawej stronie znajduje się tutaj pogrubienie. Jest to w rzeczywistości początek bocznego wyniesienia GIC, którego w naszym preparacie nie chcemy, ponieważ interesują nas prekursory z kory grzbietowej. Dlatego zamierzam to po prostu odciąć.Pozostawiam teraz jedynie komórki z kory grzbietowej. Przechodzę zatem do drugiej strony, stosując tę samą metodę.Jest to nieco bardziej kłopotliwe, ponieważ jestem praworęczny, ale ponownie wykonaj nacięcie przednie i wprowadź nożyczki do otworu. Przetnij wzdłuż strony grzbietowej oraz bocznej. Tym razem postaram się uniknąć uszkodzenia zwoju korzenia grzbietowego.Oto dwa fragmenty z półkul kory grzbietowej. Teraz użyję przyciętego końcówki pipety P 1000, aby przenieść korę do 15 ml probówki stożkowej zawierającej medium do sekcji, w której będą pozostawać podczas sekcji pozostałych osobników z miotu. Teraz odsączę jeden fragment.Teraz przenoszę korę z szalki do stożkowej probówki 15 ml zawierającej pożywkę do sekcji, w której tkanki będą pozostawać podczas sekcji pozostałych osobników z miotu. Po przeprowadzeniu sekcji całego miotu odsysam nadmiar pożywki do sekcji, pozostawiając niewielką ilość płynu oraz fragmenty kory. Następnie dodaję około 500 µL trypsyny i EDTA, a probówkę umieszczam w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 20 minut.Po 20-minutowej inkubacji dodaję 500 µL inhibitora trypsiny z soi. Teraz przystąpię do mechanicznego rozbijania lub dysocjacji komórek przy użyciu wypalanej nad płomieniem pipety Pasteura o bardzo małej średnicy otworu. Staram się nie wprowadzać zbyt wielu pęcherzyków powietrza, ale jeśli się to stanie, nie stanowi to problemu.Wykonać od pięciu do 10 pipetowań w górę i w dół, aż komórki rozproszą się w zawiesinie. Następnie odwiruję komórki z prędkością 1000 RPM w temperaturze 25 stopni przez jedną minutę. Po wirowaniu usunę nadmiar cieczy za pomocą aspiratora, pozostawiając niewielki, ledwo widoczny osad.W dolnej części tej probówki stożkowej widoczny jest niewielki osad SA. Uważam, że wystarczy niewielka ilość cieczy, zachowując szczególną ostrożność, aby nie odessać pelletu. Teraz oczywiście dodaję roztwór płuczący do pelletu.Dobrze, kolejna wirowka przy 1000 RPM, 25 stopni przez jedną minutę. Ponownie odessam nadmiar cieczy, pozostawiając jedynie osad komórkowy i bardzo niewielką ilość płynu po aspiracji. Następnie dodam pożądane medium wzrostowe z czynnikami wzrostu.Oczywiście, w zależności od eksperymentu z kulturą, objętość, jaką dodam, zależy od liczby wypreparowanych embrionów oraz ich wieku. Zazwyczaj w przypadku całego miotu embrionów E 12,5 można dodać do około 700 µL. W tym przypadku dodam około 300 µL, aby nieco bardziej zagęścić komórki. Wyjmuję płytkę pokrytą lamininą z inkubatora.Upłynęły co najmniej cztery godziny. Teraz odessam medium laminujące, a następnie przeprowadzę płukanie przy użyciu medium wzrostowego.Płukanie wykonuję za pomocą około 300 µL, a następnie odsysam ciecz i dodaję 400 µL pożywki wzrostowej. Policzyłam komórki za pomocą hemacytometru i zamierzam wysiać około 100 000 komórek na dołek w tej płytce 24-dołkowej.Każdy eksperyment wymaga innej liczby komórek na dołek. W przypadku mojego konkretnego testu liczba 100 000 sprawdziła się dobrze. Umieszczę komórki w inkubatorze do hodowli tkanek, w temperaturze 37°C i 5%CO2, i pozostawię je do hodowli na około jeden dzień.Będą one przylegać do laminatu i rozprzestrzeniać się po 24 godzinach. Do mojego konkretnego testu dodam odpowiednie czynniki wzrostu.

culture-of-mouse-neural-stem-cell-precursors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kultura prekursorów ludzkich komórek macierzystych mózgu

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę izolacji mysich komórek macierzystych grzebienia neuronalnego naskórka (EPI-NCSC). Technika ta polega na mikrodysekcji mieszków włosów wibrysów, izolacji wybrzuszenia (bulge) i umieszczeniu go w hodowli tkankowej. EPI-NCSC zaczynają emigrować z eksplantów wybrzuszenia na podłoże w ciągu 3 - 4 dni.

Hodowle mysich macierzystych komórek grzebienia neuronalnego naskórka (EPI-NCSC)

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Izolacja embrionalnej grzebieni neuralnej z rurki neuralnej umożliwia zastosowanie metod in vitro do badania migracji, samoodnawiania oraz multipotencji grzebieni neuralnej.

Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Ustanowienie systemów hodowli do ekspansji dorosłych nerwowych komórek macierzystych (aNSC) pozwala na badanie i zastosowanie aNSC w terapii. Strefa podmodzelowa (SCZ) została niedawno uznana za nowy region tworzący neuroblasty u dorosłych myszy. W tym miejscu opisano metody izolacji, ekspansji i różnicowania SCZ-aNSC.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Naucz się izolować prekursory neuronalne z kory mózgowej myszy embrionalnych. Ta metoda obejmuje wyłuskiwanie tkanek, trawienie enzymatyczne i hodowlę komórek na lamininie.

Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

Przeglądaj więcej filmów