Name: Widok historyczny i pokaz fizjologii w NMJ mięśnia otwierającego raki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj metodę preparacji mięśnia otwierającego raka do badań fizjologii synaptycznej i plastyczności w złączu nerwowo-mięśniowym. Technika ta umożliwia rejestrację odpowiedzi synaptycznych i pomiar skuteczności synaptycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Przedstawiamy tutaj niektóre z kluczowych odkryć dokonanych z wykorzystaniem preparatu złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ) skorupiaków z otwieracza oraz wykazujemy, że model ten wciąż dostarcza wielu cennych informacji. Zrozumienie historii tego modelu pozwala docenić, dlaczego nawet dzisiaj NMJ to wciąż obszerny poligon doświadczalny do badania pytań dotyczących funkcji i plastyczności presynaptycznej oraz postsynaptycznej. Istotnymi zaletami są żywotność oraz łatwy dostęp do zakończenia nerwowego w celu prowadzenia elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej, a także obrazowania. Mechanizmy leżące u podstaw modulacji kinetyki pęcherzykowej i fuzji w zakończeniach o wysokiej i niskiej wydajności wymagają dalszych badań. Preparat ten stanowi również testowalny system modelowy dla oceny obliczeniowej i manipulacji w celu zbadania kluczowych zmiennych w teoretycznych modelach funkcji synaptycznej, na przykład dynamiki wapnia podczas krótkotrwałego ułatwienia. Złożoność synaptyczna strefy aktywnej oraz statystyczna natura uwalniania kwantowego stanowią również otwarte obszary przyszłych badań, zarówno eksperymentalnych, jak i obliczeniowych.

Mięsień otwierający odnóża raków został zaprezentowany ze względu na jego historyczne znaczenie oraz wszechstronność eksperymentalną w badaniach nad fenotypem mięśni, fizjologią synaptyczną i plastycznością.

Historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Przedstawiamy tutaj niektóre z kluczowych odkryć dokonanych z wykorzystaniem preparatu złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ) skorupiaków oraz wykazujemy, że istnieje...

Mięśnie otwierające pozyskiwane z odnóża krocznego rakowiego, które zostaje odcięte od zwierzęcia. Po odsłonięciu mięśnia, wzór innowacji można ujawnić za pomocą różnych procedur barwienia. Odpowiedzi synaptyczne w formie krótkotrwałego ułatwienia są łatwo rejestrowalne z mięśnia.Elektrodę typu macro patch w układzie ogniskowym można umieścić bezpośrednio nad zidentyfikowanymi żylakami wzdłuż zakończeń nerwowych. Następnie rejestrowane są odpowiedzi synaptyczne, które mogą służyć do pomiaru skuteczności synaptycznej na poziomie jakościowym w określonym miejscu zakończenia. Cześć, nazywam się Ann Cooper i pracuję w laboratorium dr. Robina Coopera w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Kentucky.Witam, nazywam się Robin Cooper. Wspólnie z moim studentem zaprezentujemy procedurę wypreparowania mięśnia otwierającego u raków oraz jego wykorzystania do rejestracji odpowiedzi synaptycznych przy zastosowaniu różnych paradygmatów stymulacji. Procedur tych używamy w naszym laboratorium do badania wydajności synaptycznej oraz zależności między ultrastrukturą a funkcją synapsy.Zacznijmy zatem. W 1879 roku zoolog TH Huxley napisał książkę zatytułowaną The Crayfish, która do dziś jest uważana za kompleksowy przewodnik po historii życia, anatomii i fizjologii tego skorupiaka. W tamtym okresie historii charakteryzowano innowacje dotyczące mięśnia otwierającego w odnóżach raków, a badania fizjologiczne nad mięśniami raków były już w toku.W rzeczywistości eksperymenty na rakach mogły być pierwszymi, które wykazały facylitację w złączeniu nerwowo-mięśniowym (NMJ). Dr Riche opublikował swoje pierwotne badania w podręcznikach medycznych, których używał do nauczania studentów medycyny o funkcji mięśni. W ciągu kolejnych kilku dekad NMJ raków opisywano pod kątem anatomicznym i fizjologicznym w odniesieniu do rozwoju napięcia oraz anatomii.W 1961 roku Doodle i Kler wykazali ułatwienie w mięśniu otwieracza raków, po raz pierwszy opisując zjawisko hamowania presynaptycznego oraz raportując o dualnej naturze przekazywania synaptycznego. W 1971 roku, badając tę płytkę motoryczną (NMJ), Sherman i Edward dokonali przełomowego odkrycia, że NMJ mięśnia otwieracza u raków wykazuje długotrwałe ułatwienie (LTF), oprócz krótkotrwałego ułatwienia (STF).Od tego okresu wielu badaczy skupiło się na cechach SDF i LTF, wykorzystując otwierający NMJ u raka do badania mechanizmów komórkowych. Obecnie preparat mięśnia otwierającego u raka jest nadal stosowany do badania podstaw przekazywania synaptycznego, ponieważ jest on łatwo dostępny i bardzo wytrzymały w porównaniu z wieloma innymi. W celu przygotowania preparatów synaptycznych do wycięcia nogi raka, raka o długości ciała od 6 do 10 cm indukuje się do autotomii pierwszej lub drugiej nogi krocznej poprzez silne uciśnięcie segmentu Iscu pod.Procedura ta nie powoduje śmierci raka, który został zwrócony do zbiornika hodowlanego. Umieść odnóże raka na kawałku chusteczki higienicznej na stoliku mikroskopu. Obracaj odnóże, aż jego zewnętrzna strona znajdzie się u góry.Zazwyczaj stroną wypukłą do góry. Użyj ostrego ostrza brzytwy, aby naciąć kutykulę, aż do niemal całkowitego przecięcia. Przy tym schemacie należy uważać, aby nie naciąć zbyt daleko dystalnie podczas cięcia od strony grzbietowej do brzusznej, w obrębie stawu od podstawy rdzeniowej do podstawy miedniowej.Pozostaw kutykulę na miejscu. Za pomocą ostrza skalpela nacinaj kutykulę wzdłuż odpowiedniego segmentu po jednej stronie, aż do przecięcia go w ten sposób. Następnie powtórz czynność po drugiej stronie, łącząc nacięcia proksymalne, aby uniknąć przecięcia mięśnia otwierającego; prowadź ostrze pod kątem w stronę mięśnia przyścisłego. Podczas przecinania kutykuli pozostaw ją na razie na miejscu.Następnie zanurz odnóże w soli fizjologicznej dla raków w naczyniu sekcyjnym z powłoką ochronną o grubości jednego centymetra na dnie. Za pomocą precyzyjnej pęsety wbij szpilkę w grzbietny róg sznura w obrębie nacięcia otworu wykonanego w meite, aby unieruchomić preparat. Lekko unieś kutykulę od strony końca dystalnego i za pomocą żyletki odetnij włókna mięśni zginaczy od kutykuli, prowadząc cięcie w kierunku proksymalnym.Następnie zdejmij okienko kutykuli. Po zdjęciu kutykuli ostrożnie odsuń ścięgno od jamistego wnętrza nogi i przetnij AEM na poziomie stawu meite-CARite. Należy uważać, aby przeciąć tylko ścięgno, a nie główny nerw nogi, który znajduje się po wewnętrznej stronie ścięgna.Chwyć pęsetą ścięgno w miejscu przecięcia i odsuń mięsień zginacz, podnosząc go w kierunku strunowym. Główny nerw kończyny oraz mięsień prostownik są teraz odsłonięte. Przejdź do segmentu odpowiedniej diety i przetnij w miejscu odpowiedniej diety do stawu lipidowego dactyla.Odciągnij segment brzuszny odpowiedniego odcinka w dół i do tyłu pod kątem prostym, tak aby widoczne były mięśnie przyczepione w obszarze strunowym. Przetnij te mięśnie brzytwą. Należy uważać, aby nie przeciąć gałęzi nerwu ruchowego prowadzącej do mięśnia otwierającego.Mięsień otwierający jest teraz wystawiony na działanie soli fizjologicznej. Powróć do najbardziej grzbietowej części segmentu meite, gdzie pęczek nerwowy nogi zazwyczaj składa się z dwóch oddzielnych pęczków nerwowych. Przetnij pęczek grzbietowy za pomocą precyzyjnych nożyczek.Następnie chwyć odcięty koniec pęsetą i delikatnie pociągnij go w kierunku dystalnym, aż zostanie osiągnięta około połowa długości segmentu meite. Ta długa gałąź nerwowa zawiera pobudzający nerw otwierający. Tymczasem większy pęczek nerwów zawiera hamujący neuron ruchowy mięśnia otwierającego.Przetnij preparat w segmencie meite po przekątnej w taki sposób, aby przez grzbietową część meite można było wbić szpilkę entomologiczną. Pozwoli to na ustawienie brzusznej części mięśnia otwieracza do góry, tak aby była ona skierowana w stronę obserwatora. Następnie usuń pozostałe włókna mięśnia zamykacza, które zasłaniają widok na mięsień otwieracza.Przez odepchnięcie włókien przeciwko kutykuli i poza jamę, główny nerw nogi, który biegnie wzdłuż mięśnia otwierającego i wchodzi do lipidów daktila, można delikatnie wyciągnąć za pomocą precyzyjnej pęsety, a następnie odciąć. W ten sposób mięśnie otwierające są odsłonięte, bez żadnych tkanek utrudniających dostęp. Aby zarejestrować pobudzeniowe potencjały postsynaptyczne (EPSP), należy umieścić preparat mięśnia otwierającego w komorze rejestracyjnej wyposażonej w plastikową elektrodę ssącą, używając elektrody wewnątrzkomórkowej lub ogniskowej elektrody makro-patch.Zastosowanie elektrody stymulującej wbudowanej w komorę eliminuje konieczność używania mikromanipulatora do umieszczania pinu elektrody stymulującej w preparacie w naczyniu pomiarowym oraz wprowadzania odgałęzienia nerwu zawierającego włókna pobudzające do elektrody ssącej. Mięsień otwierający dzieli się na trzy główne regiony: dystalny, centralny i proksymalny. Chociaż cały mięsień otwierający jest unerwiony przez pojedynczy neuron ruchowy, złącza nerwowo-mięśniowe (nj) różnią się od siebie strukturalnie i wykazują regionalne różnice w skuteczności synaptycznej.Ponieważ najbardziej dystalne włókna są łatwo wyodrębnialne, co zapewnia spójność między preparatami, w celu wywołania odpowiedzi w tej demonstracji wykorzystamy region dystalny. Akson pobudzający będzie selektywnie stymulowany za pomocą stymulatora Grass 88. Region dystalny mięśnia otwieracza zostaje przebity ostrą elektrodą wewnątrzkomórkową wypełnioną 3 M chlorkiem potasu.Do rejestracji wewnątrzkomórkowych EPSP używa się wzmacniacza Axon Clamp 2B oraz głowicy Axon One XL. Krótkotrwałe ułatwienie lub inne pożądane rodzaje odpowiedzi można uzyskać poprzez zmianę warunków stymulacji. STF uzyskuje się poprzez podanie serii 10 lub 20 impulsów w odstępach odpowiednio 10 lub 22 ms do nerwu pobudzającego.Częstotliwość stymulacji w obrębie serii impulsów może być zmienna. Wyjście urządzenia Grass jest podłączone do izolatora stymulacji, a przewód jest połączony ze srebrnym drutem znajdującym się w plastikowej elektrodzie ssącej. Przewód jest przymocowany do srebrnego drutu w kąpieli w celu bezpośredniego rejestrowania ogniskowych EPSP w określonych regionach zakończeń nerwowych.Zgrubienia synaptyczne są najpierw wizualizowane za pomocą żywego barwnika fluorescencyjnego four dye two A SP. Do rejestracji makropłatkowej (macro patch) zostanie użyta elektroda wykonana z szkła chix. Światło elektrody wypełnia się roztworem soli fizjologicznej. Pracując pod mikroskopem fluorescencyjnym, należy umieścić światło elektrody do rejestracji makropłatkowej bezpośrednio nad pojedynczym, odizolowanym zgrubieniem, aby pobudzić zakończenie nerwowe. Pobudzenie pobudzającego nerwu ruchowego przeprowadza się zgodnie z wcześniej zaprezentowaną metodą.Rejestracja spontanicznych, jak i wywołanych odpowiedzi qual jest możliwa wzdłuż ciągu zwizualizowanych zgrubień poprzez delikatne obniżanie i podnoszenie światła elektrody. Przy niskich częstotliwościach stymulacji możliwe jest bezpośrednie przeliczenie zdarzeń qual dla każdej wywołanej odpowiedzi w obrębie każdego zgrubienia. Liczbę zdarzeń qual można określić dla serii odpowiedzi.Zlicza się całkowitą liczbę zdarzeń jakościowych, aby następnie oszacować średnią zawartość jakościową na podstawie tych bezpośrednich zliczeń. Jednym z podejść do obliczenia średniej zawartości jakościowej jest zsumowanie całkowitej liczby wywołanych zdarzeń jakościowych danego typu podczas stymulacji i podzielenie tej wartości przez całkowitą liczbę prób stymulacji zgodnie z poniższym wzorem. Przedstawiono tutaj zestaw powtarzalnych prób stymulacji składających się z 30 impulsów o częstotliwości 40 hertz.Należy odnotować facylitację dla każdego powtórzenia oraz średnią odpowiedź w przypadku zwiększenia stymulacji do 60 hertz. Bardziej wyraźna facylitacja jest obserwowana podczas rejestracji elektrodą ogniskową nad żylastką i stymulacji z częstotliwością 1 hertz. Obserwuje się wywołane odpowiedzi qal.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić sekcję mięśnia otwierającego szczypce raka i wykorzystać go do rejestracji odpowiedzi synaptycznych przy zastosowaniu różnych paradygmatów i technik stymulacji. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby obchodzić się z neuronami z należytą ostrożnością, nie naciągać ich zbyt mocno i nie uciskać. Ponadto, podczas umieszczania ogniskowej makropipety patch-clamp na zwizualizowanych żylastościach, należy lekko przyłożyć elektrodę do tych żylastości, a następnie ją podnieść.Należy również pamiętać, aby nie wystawiać preparatu na działanie światła rtęciowego przez zbyt długi czas, ponieważ mogłoby to doprowadzić do uszkodzenia zakończeń nerwowych. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

historical-view-physiology-demonstration-at-nmj-crayfish-opener

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pogląd historyczny i demonstracja fizjologii w NMJ mięśnia otwierającego raków

Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzać rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi synaptycznych w mięśniu prostowniku nogi chodu raka oraz w jaki sposób wizualizować zakończenia nerwowe, aby wykazać ogólne różnice morfologiczne między zakończeniami nerwowymi o wysokiej i niskiej wydajności.

Rejestracje fizjologiczne złącza nerwowo-mięśniowego o wysokiej i niskiej wydajności w mięśniu prostowniku nogi raka

Doświadczenia te prezentują prosty sposób, dzięki któremu studenci mogą zdobyć doświadczenie w badaniu struktury mięśni, odpowiedzi synaptycznych oraz wpływu gradientów jonowych i przepuszczalności na potencjały błonowe. Przedstawiono również obwód sensoryczny-OUN-motoryczny-mięśniowy, aby pokazać metodę testowania wpływu związków chemicznych na obwód neuronalny.

Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Głównym celem niniejszego eksperymentu jest zrozumienie, w jaki sposób pierwotne neurony sensoryczne przekazują informacje o ruchach i pozycjach stawów jako informacje proprioceptywne u zwierzęcia. Dodatkowym celem niniejszego raportu jest przedstawienie anatomii preparatu poprzez sekcję i obserwację neuronów pod mikroskopem stereoskopowym.

Organy receptorowe mięśni w odwłoku raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów z zakresu propriocepcji

W niniejszym raporcie prezentujemy techniki, które mogą być wykorzystane do badania biologii jelita tylnego raków. Pokazujemy, jak przeprowadzić sekcję odwłoka raka oraz jak badać powiązaną z nim anatomię, fizjologię i modulację aktywności. Aktywność perystaltyczną oraz siłę skurczów mierzy się przy użyciu przetwornika siły.

Eksperymenty fizjologiczne z jelitem tylnym raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów

Niniejszy materiał stanowi demonstrację sposobu rozumienia błon biologicznych przy użyciu modeli elektrycznych. Przedstawiamy również procedury rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka, przeznaczone do wykorzystania w laboratoriach dydaktycznych.

Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Techniki fizjologiczne i anatomiczne są demonstrowane w celu rozwiązania funkcji i struktury proprioceptorów stawów oraz receptorów napięcia mięśniowego u kończyn chodzących skorupiaków.

Receptory propriocepcji i napięcia w kończynach kraba: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.

Disekcja NMJ larw Drosophila

Niniejszy protokół demonstruje sposób wykonania immunohistochemii na wypreparowanych larwach Drosophila.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Poznaj metodę preparacji mięśnia otwierającego raka do badań fizjologii synaptycznej i plastyczności w złączu nerwowo-mięśniowym. Technika ta umożliwia rejestrację odpowiedzi synaptycznych i pomiar skuteczności synaptycznej.

Historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Przeglądaj więcej filmów