Name: Izolacja i wyprowadzanie mysich embrionalnych komórek rozrodczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Poznaj izolację pierwotnych komórek rozrodczych z mysich zarodków w wieku 10,5–11,5 dpc. Ta metoda pozwala badać różnicowanie komórek germinalnych oraz ma zastosowanie w badaniach nad niepłodnością i rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za nieocenioną pomoc:
dr. Neala Firsta i Kourtney Wilkinson za redakcję manuskryptu; dr Lucy Senter, dr Brigit Willeford i Mike'owi Basettowi za pomoc w szkoleniu i opiece nad zwierzętami w akredytowanym ośrodku mysim MSU ALAC; dr. Dwayne'a Wise'a za pomoc w mikroskopii i przechwytywaniu obrazów; Cesarowi Monroyowi, Hannah Swoope i Bobbie Huddleston za pomoc w produkcji wideo na MSU. Badania te zostały sfinansowane przez Office of Institutional Research oraz Department of Biological Sciences na Mississippi State University.

Część 1: Laparotomia u ciężarnej myszy
<ol>
 <li>uśmiercić za pomocą zwichnięcia szyi ciężarną samicę myszy C57BL6J w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (dpc).</li>
 <li>oczyścić brzuch mydłem przeciwdrobnkowym, a następnie go ogolić.</li>
 <li>po ogoleniu przemyć brzuch roztworem soli fizjologicznej.</li>
 <li>następnie osuszyć brzuch sterylną gazą.</li>
 <li>przykryć mysz nowym jałowym polem operacyjnym.</li>
 <li>wykonać nacięcie brzuszne za pomocą pęsety i nożyczek sekcyjnych.</li>
 <li>zidentyfikować i usunąć całą macicę z jamy brzusznej. Zarodki myszy będą widoczne wewnątrz macicy.</li>
 <li>przenieść macicę do szalki Petriego wypełnionej D-PBS i przechowywać w lodzie.</li>
 <li>za pomocą sterylnego skalpela i pęsety usunąć łożysko oraz tkanki pozazarodkowe każdego zarodka.</li>
 <li>przenieść zarodki do nowej szalki Petriego wypełnionej D-PBS.</li>
 <li>zmierzyć długość zarodków myszy. Stwierdzono, że rozmiary różniły się w zależności od wieku zarodka. Na przykład w 8,5 dpc średnia długość wynosiła 6 mm, w 10,5 dpc średnio 11 mm, a w 12,5 dpc średnio 16 mm.</li>
 <li>następnie odciąć ogony w celu ekstrakcji DNA.</li>
</ol>
Część 2: Disekccja grzebienia gonadalnego
Pod stereomikroskopem i źródłem światła Schott Fostec
<ol>
 <li>Umieść papier filtracyjny w szalce Petriego. Następnie połóż na nim zarodek myszy, aby go osuszyć i unieruchomić przed sekcją.</li>
 <li>Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj cięcie poprzeczne zarodka myszy powyżej miejsca przyczepu pępowiny.</li>
 <li>Pod stereomikroskopem, używając sterylnej pęsety precyzyjnej i sterylnej igły preparacyjnej, usuń jelita oraz wątrobę tak, aby układ moczowy stał się widoczny. 
 Nerki znajdują się bocznie w jamie brzusznej, a pęcherz moczowy znajduje się przyśrodkowo i bardziej ku dołowi w porównaniu do nerek. Zarodek można zidentyfikować jako samca, ponieważ grzebienie gonadalne znajdują się po obu stronach pęcherza. U samicy grzebienie gonadalne są ściśle przytwierdzone do boczno-tylnego końca nerek.</li>
 <li>Oddziel grzebień gonadalny, przesuwając igłę za niego. Grzebień gonadalny usuwa się poprzez odcięcie tkanek go podtrzymujących.</li>
 <li>Przenieś grzebienie gonadalne do nowej szalki Petriego wypełnionej świeżym D-PBS. 
 Pod mikroskopem męski grzebień gonadalny powinien być gładki, duży i mieć kształt owalny. W przeciwieństwie do niego, żeński grzebień gonadalny powinien być nakrapiany, mieć kształt wydłużony i być mniejszy w porównaniu do męskiego grzebienia gonadalnego.</li>
</ol>
Część 3: Trawienie grzebienia gonadalnego
 Pod stereomikroskopem:
<ol>
 <li>Disekcja mezonefryka: Oddziel gonadę od mezonefryka i grzebienia za pomocą cienkiej, ostrej igły.
<ul>
 <li>Ważne jest usunięcie mezonefryka z grzebienia gonadalnego, ponieważ jest to tkanka somatyczna, która nadmiernie rozrośnie się w procesie wyprowadzania PGC.</li>
</ul>
</li>
 <li>Trawienie grzebienia gonadalnego: Zbierz czyste grzebienie gonadalne w kropli 0,5ul świeżego D-PBS. Dodaj 20 ml roztworu kolagenazy/dispazy (stężenie końcowe 1mg/ml).<ul>
 <li>Zarodki należy przetwarzać indywidualnie. Każdy zarodek powinien znajdować się w oddzielnej, oznakowanej szalce Petriego.</li>
</ul>
</li>
<li>Siekane grzebienia gonadalnego: Pokrój grzebień gonadalny na małe kawałki, używając sterylnej igły i sterylnej cienkiej pęsety nr 4.</li>
<li>Inkubacja: Szalki Petriego przenieś do inkubatora w temperaturze 37°C na 15 minut.
 <ul>
 <li>Czas inkubacji może się różnić w zależności od tkanki.</li>
 </ul>
</li>
<li>Pipetowanie: Po 15 minutach tkankę można rozdzielić poprzez pipetowanie. Używając dociąganych szklanych kapilar o średnicy od 40 do 100 mm, rozbij kawałki poprzez wielokrotne pobieranie i wypuszczanie cieczy. Powstaną w ten sposób małe grudki. Przenieś grudki do kropli 0,5ml uprzednio ogrzanego D-PBS w celu końcowego płukania.</li>
 <li>Po płukaniu przenieś grudki do probótek Eppendorf.
 <ul>
 <li>Nie wystawiaj tkanki na działanie kolagenazy zbyt długo.</li>
 <li>Nie twórz zawiesiny pojedynczych komórek. Jest to istotne dla formowania kolonii. W przypadku zawiesiny pojedynczych komórek, PGC mają tendencję do różnicowania i migracji.</li>
 <li>Proces ten nie powinien trwać dłużej niż 20 minut, w przeciwnym razie komórki utracą żywotność.</li>
</ul>
</li>
 <li>Wiruj przy 2000 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Po wirowaniu usuń nadsącz i resuspenduj osad w 0,5 ml suplementowanej pożywki knock out (uprzednio ogrzanej do 37°C).</li>
</ol>
Część 4: Hodowla pierwotnych komórek zarodkowych
"Kolejne kroki należy wykonać szybko, aby zachować żywotność PGC do izolacji i pochodzenia.
<ol>
 <li>Na 24 godziny przed rozpoczęciem tego procesu należy przygotować mitotycznie inaktywowaną warstwę karmioną MEF-CF1 zgodnie z protokołem Zhang J. et al 2008.
<ul>
 <li>Przygotuj 20 naczyń dla jednej ciężarnej myszy (6-8 embrionów).</li>
 <li>MEF tracą zdolność do pełnienia funkcji warstwy karmionej (stymulowania wzrostu i zapobiegania różnicowaniu) po 5-6 pasażach.</li>
 <li>Nie należy używać komórek MEF starszych niż 48 godzin.</li>
</ul>
</li>
 <li>Bezpośrednio przed wysianiem PGC należy powoli usunąć pożywkę MEF z warstwy karmionej MEF.</li>
 <li>Następnie do warstwy karmionej MEF należy dodać 0.5 ml/studzienkę uprzednio ogrzanej, uzupełnionej pożywki knockout.
<ul>
 <li>Pożywki MEF zawierają płodowe serum bydlęce, które indukuje różnicowanie PGC.</li>
 <li>Pożywkę knockout należy uzupełnić o gatunkowo swoiste czynniki wzrostu bezpośrednio przed użyciem, aby zapewnić aktywność czynnika wzrostu.</li>
</ul>
</li>
 <li>Wysiej PGC na warstwę karmioną MEF, zachowując symetryczny rozkład.
<ul>
 <li>Jeśli fragmenty znajdują się zbyt blisko siebie, mają tendencję do agregowania i tworzenia gęstych kolonii, które słabo przylegają lub zaczynają się różnicować.</li>
 <li>Naczynia hodowlane muszą być opisane nazwą linii embrionalnych komórek zarodkowych, numerem pasażu i datą.</li>
</ul>
</li>
 <li>Ostrożnie przenieś naczynia hodowlane do inkubatora w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
 <li>Monitoruj komórki co 24 godziny.</li>
 <li>Po 48 godzinach usuń 250 ml pożywki z samej góry hodowli, aby uniknąć naruszenia przylegania kolonii. Następnie dodaj 250 ml świeżej uzupełnionej pożywki knockout (uprzednio ogrzanej do 37°C).</li>
 <li>Po kroku 7 odczekaj kolejne 48 godzin, a następnie całkowicie usuń całą pożywkę i zastąp ją świeżą uzupełnioną pożywką knockout (uprzednio ogrzaną do 37°C). Powtarzaj tę czynność co 2 dni przez 8-10 dni, aż do czasu uformowania się kolonii PGC.</li>
</ol>
Część 5: Zarodkowe komórki linii zarodkowej
<ol>
 <li>Po 10 dniach izolacji PGC tworzą się kolonie embrionalnych komórek zarodkowych.</li>
 <li>Linie embrionalnych komórek zarodkowych utrzymuje się przy życiu poprzez manualne pasażowanie co 8-10 dni. Zachowują one niezróżnicowaną morfologię i wykazują ekspresję markerów pluripotencji, takich jak fosfataza alkaliczna, Oct-4, SSEA-1 oraz SOX-2.</li>
</ol>
Uwagi
<ul>
 <li>W pomieszczeniu hodowlanym niezbędne jest zachowanie warunków sterylnych/aseptycznych.</li>
 <li>Podczas izolacji i hodowli PGC są przetwarzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II.</li>
 <li>Inkubacje odbywają się w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.</li>
 <li>Wszystkie pożywki i odczynniki przed użyciem są filtrowane przez filtr 0,2 µm, przechowywane w temperaturze 4°C i wstępnie ogrzewane do 37°C.</li>
 <li>Podczas etapów sekcji wszystkie embriony i tkanki muszą być utrzymywane w lodzie.</li>
 <li>Wszystkie kolby z odczynnikami są odkażane etanolem przed umieszczeniem w komorze.</li>
 <li>Obowiązkowe jest stosowanie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i czepek.</li>
</ul>
Podsumowanie
Przygotowaliśmy film instruktażowy przedstawiający sposób izolacji, wyprowadzenia i hodowli embrionalnych komórek linii zarodkowej z grzebieni gonadalnych zarodków myszy w wieku 10,5–11,5 dpc. Powtarzalna izolacja i długoterminowa hodowla linii embrionalnych komórek linii zarodkowej stanowią kluczową podstawę do badania wczesnego rozwoju embrionalnego, genetycznych i epigenetycznych wzorców linii zarodkowej, formowania gonad, wpływu środowiskowego sąsiednich organów podczas procesu gametogenezy u zarodków męskich i żeńskich oraz określania ścieżek prowadzących do nowotworów i niepłodności.
<img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="Morfologia zarodkowych komórek germinalnych myszy, mikroskopia kontrastowa, 20X-60X, badanie struktury komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1">

<ol><li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeFelici%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A laboratory Handbook</a>. 1, Second Edition, 73-85 (1998).</li>
<li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li>
<li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabosky%2C+PA+%22Molecular+embryology%3A+methods+and+protocols%22">Molecular embryology: methods and protocols</a>. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).</li>
<li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li>
<li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+MEFs+to+Matrigel+I%3A+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Badanie to zostało przeprowadzone po recenzji i zatwierdzeniu przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) naszego protokołu dotyczącego myszy nr 08030 (Rola reaktywnych form tlenu - ROS w rozwoju linii zarodkowej i powstawaniu nowotworów: Protokół utrzymania i rozrodu) na Uniwersytecie Stanowym Missisipi.

<table><tbody><tr><td>Ciężarna samica myszy szczepu C57BL6J w 10,5–11,5 dniu po kopulacji (dpc), skrzyżowana z samcem o tym samym tle genetycznym.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasty mysie MEF-CF1 ATCC</td><td></td><td>SCRC-1040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;bufor fosforanowy (D-PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190/086</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kolagenazy/dispazy</td><td>Grupa Roche</td><td>269638</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka MEF: Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) z GLUTAMAX, wysoka zawartość glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>10566024</td><td></td></tr><tr><td>10% płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>16000/044</td><td></td></tr><tr><td>1% antybiotyku-antymykotyku</td><td>Invitrogen</td><td>15420/096</td><td></td></tr><tr><td>Poziom Knockout: 80% knockout D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829/018</td><td></td></tr><tr><td>20% serum Knockout Invitrogen nr kat. 1028/028, 200 mM L-glutamina Invitrogen</td><td></td><td>25130/081</td><td>z &amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol Sigma numer katalogowy: M7522</td></tr><tr><td>1X roztwór aminokwasów nieessentialnych</td><td>Invitrogen</td><td>11140/050</td><td></td></tr><tr><td>1% antybiotyk-antymykotyk</td><td>Invitrogen</td><td>15420/096</td><td>suplementowane czynnikiem wzrostu w postaci 2500 j. czynnika hamującego białaczkę (mLIF-ESGRO), Millipore numer katalogowy: ESG1106</td></tr><tr><td>40 ng/ml rekombinowanego czynnika komórek macierzystych myszy (SCF) ReproTech</td><td></td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Szalka hodowlana z wgłębieniem środkowym Corning 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-79</td><td>probówka typu Eppendorf 1,5 ml oraz probówki typu Falcon 15 ml</td></tr><tr><td colspan="4">Pincety nr 14 i 15, skalpel 35 mm, nożyczki do dyssekcji, podkłady chirurgiczne, mydło przeciwbakteryjne, roztwór soli fizjologicznej 0,9%, gaza, styropianowe pojemniki z lodem, żyletka, skalpel 35 mm, pincety precyzyjne nr 4 i 5, precyzyjna igła do separacji z uchwytem, arkusze papieru filtracyjnego oraz wyciągane pipety szklane.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Sprzęt: stereomikroskop sekcyjny, źródło światła Schott Fostec, mikroskop odwrócony, mikropipety 10 i 200 µl, wirówka, komora z laminarnym przepływem powietrza.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Sprzęt: stereomikroskop sekcyjny, źródło światła Schott Fostec, mikroskop odwrócony, mikropipety 10 i 200 µl, wirówka, komora z laminarnym przepływem powietrza.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;br/&gt;Sprzęt: stereomikroskop sekcyjny, źródło światła Schott Fostec, mikroskop odwrócony, mikropipety 10 i 200 µl, wirówka, komora bezpieczeństwa biologicznego.</td></tr><tr><td colspan="4">Sprzęt: stereomikroskop sekcyjny, źródło światła Schott Fostec, mikroskop odwrócony, mikropipety 10 i 200 μl, wirówka, komora z laminarnym przepływem powietrza.</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych (EG) do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe (PGC) i w późniejszym etapie w gamety podczas wczesnych faz rozwoju stanowi doskonały model do weryfikacji naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad zarodków myszy w dniach 10,5–11,5 po zapłodnieniu (dpc). Rozwijające się grzebienie gonadalne z embrionów myszy (C57BL6J) poddano dysocjacji poprzez rozbicie mechaniczne z użyciem kolagenazy, a następnie wysiano na warstwę odżywczą z fibroblastów embrionalnych myszy (MEF-CF1), które uprzednio inaktywowano mitotycznie za pomocą mitomycyny C w obecności pożywki knockout, uzupełnionej o czynnik hamujący białaczkę (LIF), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) oraz czynnik komórek macierzystych (SCF). Zastosowanie tych zoptymalizowanych metod identyfikacji, izolacji i ustalenia warunków hodowli PGC umożliwia długoterminową hodowlę komórek EG przez ponad 40 dni. Linie embrionalnych komórek zarodkowych wykazywały fenotyp embrionalny oraz ekspresję powszechnie stosowanych markerów stanu pluripotencjalnego. Izolacja i wyprowadzenie komórek zarodkowych w hodowli stanowią narzędzie pozwalające zrozumieć ich rozwój in vitro oraz dają możliwość monitorowania kumulatywnych uszkodzeń na poziomie genetycznym i epigenetycznym po narażeniu na stres oksydacyjny.

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych (EG) do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe (PGC) i później w gamety podczas wczesnego rozwoju...

Witajcie, nazywam się Har Moreno i reprezentuję Laboratorium Genetyki Rozrodu i Komórek Macierzystych Uniwersytetu Stanowego w Mississippi. Witajcie, nazywam się Clara St. i również reprezentuję Laboratorium Genetyki Rozrodu i Komórek Macierzystych Uniwersytetu Stanowego w Mississippi. Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są prekursorami odpowiednio oocytów w jajnikach oraz plemników w jądrach.W embrionach myszy PGC migrują z jelita tylnego i przez grzebień płciowy między 8,5 a 9,5 dniem. PGC postum docierają do grzebienia płciowego między 10,5 a 11,5 dniem.TAs Postum i zaczynają formować prątek gonadalny u samic. PGCs migrują do bocznych końców nerki, aby rozpocząć tworzenie żeńskiego prątka gonadalnego. W przeciwieństwie do tego, u samców PGCs migrują na obie strony pęcherza.Rozpoczynajmy. Męskie komórki linii alridge Ger stanowią doskonały model badawczy do analizy szlaków rozwoju onickiego w obecności stresu oksydacyjnego jako przyczyny niepłodności i nowotworów. Zatem przejdźmy do szczegółów.Dzisiaj pokażemy Państwu, jak pobierać i izolować komórki PGC z rozwijających się listew gonadalnych zarodków myszy w wieku od 10,5 do 11,5 dnia po zapłodnieniu. Listwy gonadalne zarodków myszy są dysocjowane poprzez destrukcję mechaniczną, a następnie wysiewane na warstwę fibroblastów zarodkowych myszy. Po 10 dniach hodowli w zoptymalizowanych warunkach kolonie zarodkowych komórek linii płciowej wykażą fenotypy embrionalne. Po pasażowaniu można je również zidentyfikować na podstawie ekspresji markerów pluripotencji.Do tego etapu sterylnej sekcji niezbędne są następujące materiały. Pakiet zawierający pola sterylne, pęsety, nożyczki, żyletki, mydła przeciwdrobnoustrojowe, roztwory soli fizjologicznej, szalki Petriego wypełnione PBS Pep przechowywane w lodzie oraz gazę. Ciąża u samicy myszy BL6 w dniach 10,5–11 po zapłodnieniu; zwierzę zostaje uśpione poprzez zwichnięcie karku. Brzuch należy oczyścić mydłem przeciwdrobnoustrojowym, a następnie zgolić włosy.Przemyj brzuch roztworem soli fizjologicznej. Osusz go sterylną gazą. Przykryj mysz nowym sterylnym polem.Wykonaj nacięcie brzuszne za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych. Zlokalizuj i usuń całą macicę z jamy brzusznej. Wewnątrz macicy widoczne będą embriony.Bardzo ostrożnie. Przeciągnij przez więzadła, które wciąż są przytwierdzone do rogu macicy. Zakończ sekcję, wykonując cięcie poprzeczne wzdłuż pochwy.Przenieść macicę do szalki Petriego z GPVS i przechowywać w lodzie. Oddzielić tkanki pozazarodkowe od embrionów za pomocą sterylnego skalpela i pęsety.Przenieść embriony z widocznym otworem gębowym do nowej szalki Petriego wypełnionej DPBS. Zmierz długość embrionu z widocznym otworem gębowym. Stwierdzono, że rozmiary różniły się w zależności od wieku embrionu.Na przykład w 8,5 dnia po zapłodnieniu średnia długość wynosiła 6 mm, w 10,5 dnia po zapłodnieniu średnio 11 mm, a w 12,5 dnia po zapłodnieniu średnio 16 mm. Odciąć ogony w celu ekstrakcji DNA. Do sekcji niezbędne są następujące materiały: stereomikroskop, komora z laminarnym przepływem powietrza, PDS, steryльный skalpel.Sterylna pęseta precyzyjna, sterylna igła preparacyjna z uchwytem, szalki Petriego, arkusze papieru filtrującego. Umieść papier filtrujący w szalce Petriego, a następnie połóż na nim embrion w stadium formowania się otworu gębowego, aby go osuszyć i unieruchomić przed sekcją. Używając sterylnego skalpela, wykonaj cięcie poprzeczne embrionu powyżej miejsca przyczepu pępowiny pod mikroskopem stereoskopowym.Używając sterylnej pęsety precyzyjnej i sterylnej igły do preparatyki, usuń jelita oraz wątrobę tak, aby układ moczowy stał się widoczny. Pęcherz moczowy znajduje się w płaszczyźnie przyśrodkowej.Zarodek można zidentyfikować jako męski, ponieważ grzebienie gonadalne znajdują się po obu stronach pęcherza. Używając sterylnej pęsety precyzyjnej i sterylnej cienkiej igły, usuń prawy męski grzebień płciowy, odcinając tkankę go podtrzymującą. Zastosuj tę samą procedurę w celu usunięcia lewego męskiego grzebienia płciowego.Pod mikroskopem przenieś obie grzebienie narządów płciowych samca do małej szalki Petriego zawierającej świeży DPDS. Pod mikroskopem stereo można zobaczyć grzebień gonadalny samca przytwierdzony do nefryka. Grzebienie gonadalne samca powinny mieć kształt podłużny i owalny.Usuń jelita, używając sterylnej precyzyjnej pęsety i sterylnej cienkiej igły do preparowania. Nerki znajdują się bocznie w jamie brzusznej, a pęcherz moczowy jest położony bardziej przyśrodkowo i ku końcowi ogona w porównaniu z nerkami. Grzbiet gonadalny u samicy różni się od grzbietu gonadalnego u samca pod względem morfologii i lokalizacji anatomicznej.Grzebienie gonad żeńskich są mocno przytwierdzone do bocznego końca ogonowego nerki. Używając sterylnej pęsety precyzyjnej i sterylnej cienkiej igły, usuń lewy grzebień gonady żeńskiej, odcinając tkanki łączące go z nerką.Powtórz tę samą procedurę, aby usunąć prawą grzebień gonadalny samicy. Przenieś oba grzebienie genitalne samicy pod mikroskopem do małej szalki Petriego zawierającej świeże PDS. Możesz zwizualizować grzebień gonadalny samca przytwierdzony do Neso Nera.Należy zlokalizować żeńskie grzebienie gonadalne, które powinny mieć wydłużony kształt i być mniejsze w porównaniu do męskich grzebieni gonadalnych, wykorzystując do tego sterylne, cienkie i ostre igły. Oddziel żeńskie grzebienie gonadalne od mezynerosu oraz innych tkanek somatycznych, używając sterylnych, cienkich i ostrych igieł. Oddziel męskie grzebienie gonadalne od mezynerosu i innych tkanek somatycznych.Ważne jest usunięcie grzbietu mesonefrosu z grzbietu genitalnego, ponieważ jest to tkanka somatyczna, która nadmiernie rozrostłaby się w procesie pochodzenia PGC. Grzbiet genitalny należy zebrać w kropelce 0,5 µL świeżego DPVS z roztworami kolagenazy. Pod mikroskopem stereoskopicznym tkanki gonad zostają pocięte na małe kawałki przy użyciu sterylnych, cienkich i ostrych igieł.Szalki Petri przenosi się do inkubatora w temperaturze 37 °C na 15 minut. Po 15 minutach tkankę można poddać dysocjacji poprzez pipetowanie przy użyciu wyciągniętych szklanych pipet kapilarnych o różnych średnicach od 40 do 100 µm. Rozdrabnia się fragmenty, pipetując je w górę i w dół.Powstaną w ten sposób małe grudki. Grudki te są przemywane 0,5 µL DPDX po przeprowadzeniu płukania. Następnie są one przenoszone do kostek Eend przy 2000 RPM przez pięć minut.W temperaturze pokojowej, po wirowaniu, usuwa się nadsącz, a osad resuspensuje w 0,5 mililitra uzupełnionej pożywki knockout, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Przed tym procesem należy przygotować warstwę feederową z nieaktywowanych fibroblastów zarodkowych myszy CCF1 bezpośrednio przed wysiewaniem PGC. Pożywkę należy usunąć z przygotowanej warstwy feederowej.Następnie na warstwę karmioną meth dodaje się odpowiednią liczbę mililitrów uzupełnionego medium knockout, uprzednio ogrzanego do 37 °C. Pod mikroskopem stereoskopowym, stosując symetryczny rozkład, na warstwy karmione meth nanosi się niewielkie ilości PT GC. Jeśli fragmenty te znajdują się zbyt blisko siebie, mają tendencję do agregacji i tworzenia gęstych kolonii, które słabo przylegają lub zaczynają ulegać różnicowaniu hodowli.Naczynia muszą zostać opisane nazwą linii embrionalnych komórek zarodkowych, numerem pasażu oraz datą. Ostrożnie przenieś naczynia hodowlane do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO₂; po 10 dniach od izolacji można zidentyfikować kolonie embrionalnych komórek zarodkowych na podstawie ich charakterystycznej morfologii. Ponadto, po pierwszym pasażu można je zidentyfikować na podstawie ekspresji markerów pluripotencji, takich jak fosfataza alkaliczna, Oct4, SSEA-1 oraz Sox2.W dzisiejszym filmie przedstawimy sposób izolacji i hodowli embrionalnych komórek zarodkowych z PGC myszy w dniach 10,5 i 11,5 po zapłodnieniu. Charakterystyka embrionalnych komórek zarodkowych jako prekursorów gamet jest niezbędna dla badań nad gametogenezą, płodnością i nowotworami.Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

isolation-and-derivation-of-mouse-embryonic-germinal-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i pochodzenie zarodkowych komórek embrionalnych myszy

Ten film demonstruje protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek kory mózgowej z grzbietowo-bocznego kresomózgowia embrionów myszy.

Izolacja i hodowla komórek z zarodka myszy Grzbietowo-boczne kresomózgowie

W ostatnich latach tworzenie komórek rozrodczych przy użyciu metod hodowli in vitro zostało zademonstrowane przy użyciu kilku różnych typów somatycznych komórek macierzystych. W tym artykule wizualnie przedstawimy różnicowanie nowonarodzonych komórek macierzystych pochodzących od myszy do wczesnych komórek podobnych do oocytów.

Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro

Opracowaliśmy protokół do generowania agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują samoorganizację, łamanie symetrii i wydłużanie równolegle do rozwoju osiowego. Technika ta pozwala na badanie osiowych procesów rozwojowych i generowanie typów komórek, które w innym przypadku są trudne do wykonania w hodowli jednowarstwowej.

Generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.

Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Poznaj izolację pierwotnych komórek rozrodczych z mysich zarodków w wieku 10,5–11,5 dpc. Ta metoda pozwala badać różnicowanie komórek germinalnych oraz ma zastosowanie w badaniach nad niepłodnością i rakiem.

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Przeglądaj więcej filmów