Name: Wstrzyknięcie zaoczodołowe u dorosłych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Poznaj technikę wstrzyknięcia zaoczodołowego u dorosłych danio pręgowanego w badaniach nad przeszczepianiem komórek macierzystych krwi. Metoda umożliwia wizualizację komórek dawcy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca jest wspierana przez Howard Hughes Medical Institute oraz grant z NIH na badanie hematopoezy embrionalnej.

Część 1. Przygotowanie materiału do wstrzyknięcia
<ol>
 <li>Komórki Tg(globin:GFP):</li>
 <li>Pobierz krew z dorosłych ryb dawców, używając końcówki pipety 10ul pokrytej heparyną (1unit/ul), nakłuwając rybę za skrzela.</li>
 <li>Odessaj erytrocyty i przenieś je do buforu komórkowego (0,9X PBS + 5% FBS + 1% Pen/Strep).</li>
 <li>Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sito 40uM i wyznacz stężenie komórek za pomocą komory licznikowej, zgodnie z wcześniejszym opisem LeBlanc i wsp.</li>
 <li>Odwiruj i resuspenderuj w buforze komórkowym do pożądanego stężenia, tak aby końcowa objętość iniekcji nie przekraczała 5ul. W tej procedurze wstrzykujemy 1,5-2 miliona komórek na rybę biorcę.</li>
 <li>W przypadku dekstranu Texas Red®, rozpuść barwnik w DPBS, aby uzyskać końcowe stężenie iniekcyjne 10-12 mg/mL. Zaplanuj wstrzyknięcie 4 uL na rybę.</li>
</ol>
Część 2. Iniekcja
<ol>
 <li>Zanurzyć ryby w roztworze trikainy w celu znieczulenia (4,2 ml (4 mg/ml) trikainy/100 ml wody dla ryb).</li>
 <li>Przed iniekcją przemyć strzykawkę Hamiltona 3-4 razy 70% etanolem. Następnie przepłukać 3-4 razy 0,9X DPBS.</li>
 <li>Umieścić rybę na wilgotnej gąbce grzbietem do góry, skierowaną prawą stroną.</li>
 <li>Trzymać strzykawkę Hamiltona w prawej ręce, opierając palec wskazujący na tłoku. Delikatnie ustabilizować ciało ryby lewą ręką.</li>
 <li>Ustawić igłę ściętym końcem do góry w taki sposób, aby – przyjmując oko ryby za tarczę zegara – igła wskazywała godzinę 7:00 i była ustawiona pod kątem 45 stopni względem ryby (rycina 1).</li>
 <li>Delikatnie wprowadzić igłę na głębokość 1-2 mm w pozycji godziny 7:00 i powoli nacisnąć tłok.</li>
 <li>Pozostawić rybę do regeneracji w świeżej wodzie E3.</li>
 <li>Między iniekcjami różnych odczynników przemyć igłę zgodnie z powyższym opisem.</li>
 <li>Co kilka minut delikatnie potrząsnąć zawiesiną komórkową w celu resuspensji komórek i zapobiegania ich agregacji.</li>
 <li>Przez 1 tydzień utrzymywać ryby poza przepływem, dokonując codziennych podmian wody, aby uniknąć infekcji. W tym okresie ryby utrzymujemy w wodzie ICU (10 mL Stress coat + 5 mL pemafix + 5 mL melafix na 38 litrów wody E3).</li>
</ol>
Część 3. Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym wykonaniu możliwe jest zwizualizowanie wstrzykniętego materiału, jeśli został on w jakiś sposób znakowany. Na przykład, krwinki czerwone Tg(globin:GFP) powinny być widoczne pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym, krążące w układzie naczyniowym ryb biorców casper wkrótce po wstrzyknięciu, jak pokazano na rysunku 2. Podobnie, wstrzyknięcie dekstranu 70kDa, sprzężonego z Texas Red®, może być zwizualizowane w układzie naczyniowym przezroczystych ryb bezpośrednio po wstrzyknięciu zaocznojemiołkowym (rysunek 3). Fluorescencyjne komórki nerek od ryb dawców Tg(β-actin:GFP) mogą być również wstrzykiwane zaocznojemiołkowo do napromieniowanych ryb biorców casper. Komórki te z czasem zlokalizują się w szpiku biorcy (rysunek 4a), a następnie mogą repopulować nerki po kilku tygodniach (rysunek 4b).
Jeśli wstrzyknięcie jest zbyt płytkie lub kąt wprowadzenia igły omija jamę zatoki żylnej okołogałkowej, wstrzyknięty materiał może gromadzić się wokół oka lub wypływać z niego. Z kolei, jeśli wstrzyknięcie jest zbyt głębokie, u ryb może dojść do uszkodzenia tkanek lub nadmiernego krwawienia, choć mogą one nadal przeżyć. Przy prawidłowym wykonaniu, śmiertelność po wstrzyknięciu okołogałkowym powinna wynosić mniej niż 5% wszystkich wstrzykniętych ryb, a skuteczność wprowadzenia substancji do krwiobiegu powinna przekraczać 90% wszystkich wstrzykniętych ryb.
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="Badanie rytmu okołodobowego u rybek zebra; ilustracja metody wstrzykiwania w określonych odstępach czasu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1: Ilustracja techniki wstrzykiwania za gałkę oczną. Prawe oko ryby przedstawiono jako zegar analogowy, w którym pozycja godziny siódmej odpowiada właściwemu miejscu wstrzyknięcia.
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, lokalizacja białka, struktura komórkowa, eksperyment mikroskopowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2: Krwinki czerwone Tg(globin:GFP) krążące w naczyniach krwionośnych ogona dorosłej ryby casper trzy dni po iniekcji zaocznej. 
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="Mikroskopia ryb zebrafish, czerwona fluorescencja podkreślająca strukturę mięśni płetwy i morfologię ciała." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rycina 3"> Rycina 3: Pomyślna iniekcja dekstranu 70kDa sprzężonego z Texas Red® używanego jako barwnik pozwala na uzyskanie fluorescencyjnego układu naczyniowego u przezroczystej dorosłej ryby casper , co jest łatwo widoczne przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej całego organizmu. 
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="Detekcja emisji fluorescencji, obraz mikroskopowy, obszar wyróżniony, analiza biologiczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 4a"> Rysunek 4a: Trzy dni po wstrzyknięciu do zatoki okołogałkowej pełnych komórek szpiku nerkowego od ryb dawców Tg(β-actin:GFP), można zaobserwować migrację komórek do szpiku nerkowego napromieniowanych dorosłych ryb biorców casper.
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej danio pręgowanego, podkreślający ekspresję GFP w tkance nerwowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rycina 4b"> Rycina 4b: Cztery tygodnie po wtryśnięciu do przestrzeni zakrwawnej za gałką oczną komórek szpiku całej nerki od ryb dawców Tg(β-actin:GFP), repopulacja nerki biorcy zielonymi komórkami szpiku całej nerki dawcy może być zwizualizowana u napromieniowanych dorosłych ryb biorców casper.

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

Wstrzykiwanie do przestrzeni zaocznej u dorosłych danio pręgowanych zapewnia najwyższą wydajność dostarczania wstrzykniętego materiału do krwiobiegu przy najniższym wskaźniku śmiertelności. Ze względu na charakter miejsca wkłucia, punkt nakłucia goi się szybko, co zmniejsza ryzyko infekcji oraz ilość utraconej krwi. W tym samym miejscu można przeprowadzać wielokrotne iniekcje w krótkich odstępach czasu, na przykład w celu codziennego podawania leków.
Tradycyjne metody leczenia dorosłych ryb, ...

<table><tbody><tr><td>Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelita świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>Zważona fiolka zawierająca 300 jednostek USP</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Texas Red&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5mM NaCl&lt;br/&gt;0,17 mM KCl&lt;br/&gt;0,33 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Strzykawka mikrolitrowa</td><td>Hamilton Co</td><td>80300</td><td>701N 10uL SYR (26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Leczenie farmakologiczne całych organizmów jest niezbędnym narzędziem w każdym systemie modelowym wykorzystywanym w badaniach farmakologicznych i chemicznej genetyce. Wtryskiwanie dożylne (IV) jest często najskuteczniejszą i najmniej inwazyjną formą podawania interesującego związku. U danio przeżebrowanego (Danio rerio), wstrzykiwanie leków dożylnie (IV) od dawna stanowiło wyzwanie ze względu na małą średnicę naczyń. Okazało się to również istotną przeszkodą w przypadku wstrzykiwania komórek podczas transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych. Historycznie wstrzyknięcia do krwiobiegu wykonywano bezpośrednio przez serce. Jednak ta procedura wewnątrzsercowa wiąże się z bardzo wysokim wskaźnikiem śmiertelności, ponieważ podczas wstrzykiwania często dochodzi do przebicia serca, co naraża ryby na infekcje, masową utratę krwi lub śmiertelne uszkodzenie organów. Korzystając z naszego doświadczenia z myszami, opracowaliśmy nową procedurę wstrzykiwania u danio-zebry, w której miejsce iniekcji znajduje się za okiem, w zatoki żylne zaocznej. Ta technika wstrzykiwania zaocznego (RO) została z sukcesem zastosowana zarówno do podawania leków dorosłym rybom, jak i do transplantacji całych komórek szpiku nerkowego. Wstrzykiwanie RO charakteryzuje się znacznie niższą śmiertelnością niż tradycyjne wstrzykiwanie wewnątrzsercowe. Ryby poddane iniekcji zaocznej wykazują tendencję do mniejszych krwawień po zabiegu i są znacznie mniej narażone na uszkodzenie kluczowych organów, takich jak serce. Co więcej, przy prawidłowym wykonaniu, wstrzyknięte komórki i/lub leki szybko przedostają się do krwiobiegu, co pozwala związkom wywierać działanie na cały organizm ryby, a komórkom nerkowym na łatwe dotarcie do ich niszy. Tym samym ta nowa technika wstrzykiwania minimalizuje śmiertelność, umożliwiając jednocześnie efektywne dostarczanie materiału do krwiobiegu dorosłych ryb. W niniejszej pracy demonstrujemy tę technikę poprzez wstrzyknięcie zaoczne Tg(globinakomórki (GFP) do osobników dorosłychcasperryb, jak również wstrzyknięcie czerwonego barwnika fluorescencyjnego (dekstran, Texas Red ) w osobników dorosłychcasperryb. Następnie wizualizujemy udane wstrzyknięcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całego organizmu.

W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Leczenie farmakologiczne całych organizmów jest niezbędnym narzędziem w każdym systemie modelowym wykorzystywanym w badaniach farmakologicznych i chemicznej genetyce. Iniekcja dożylna (IV) jest...

Krwinki czerwone dawcy są najpierw pobierane od transgenicznych ryb z GFP globiną poprzez nakłucie serca zwierzęcia dawcy i aspirację erytrocytów. Po przygotowaniu komórek do iniekcji, ryby biorcy zostają poddane iniekcji zaocznej, a następnie obrazowane za pomocą standardowej fluorescencyjnej mikroskopii całego organizmu w celu potwierdzenia pomyślnego wstrzyknięcia komórek znakowanych fluorescencyjnie. Analogicznie przygotowywany jest kolorowy barwnik dekstryna sprzężona z Texas Red, który jest wstrzykiwany zaocznie, a następnie obrazowany w celu potwierdzenia skuteczności iniekcji.Cześć, jestem Emily Atch z laboratorium Leonarda Zana w Departamencie Hematologii i Onkologii w Children's Hospital Boston. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę iniekcji okołopodbieżnej u dorosłych rybek zebrafish. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.Zacznijmy zatem. Zaprezentujemy iniekcje zaoczodołowe transgenicznych komórek globiny GFP oraz czerwonego fluorescencyjnego barwnika dekstryny sprzężonej z Texas Red u dorosłych ryb Casper, czyli przezroczystej odmiany danio pręgowanego. Aby przygotować transgeniczne komórki globiny GFP

retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wstrzyknięcie do obszaru zaoczodołowego u dorosłych danioni pardalis

Prezentujemy technikę wstrzykiwania dosytniewnego u dorosłych rybek danio-ostrobramkowych. Używamy mikrosyringi NanoFil o pojemności 10 μl, sterowanej za pomocą kontrolera Micro4 oraz pompy UltraMicroPump III. Demonstracja obejmuje wykorzystanie zimnej wody jako środka znieczulającego.

Wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Wprowadzamy skuteczną metodę wstecznego oznaczania komórek zwojowych siatkówki (RGC) u dorosłych ryb pręgowanych.

Wsteczne znakowanie komórek zwojowych siatkówki u dorosłych danio pręgowanego za pomocą barwników fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu komórek mięśni szkieletowych danio pręgowanego i embrionalnego mięsaka prążkowanokomórkowego (ERMS) do dorosłego homozygotycznego mutanta rag2E450fs z obniżoną odpornością. Protokół ten pozwala na sprawną analizę regeneracji i przemian złośliwych komórek mięśniowych.

Normalny i złośliwy przeszczep komórek mięśniowych dorosłym danio pręgowanym z obniżoną odpornością

Ta metoda polega na wstrzyknięciu 0,5−3 μL roztworu do klatki piersiowej dorosłego danio pręgowanego. Procedura skutecznie dostarcza białka i związki chemiczne w pobliże serca danio pręgowanego, nie uszkadzając przy tym narządu. Podejście to nadaje się do badania wpływu czynników egzogennych na różne tkanki serca.

Wstrzyknięcie do klatki piersiowej w celu zbadania serca dorosłego danio pręgowanego

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany i skuteczny protokół dożylnego wstrzykiwania komórek lub środków farmakologicznych dorosłemu danio pręgowanemu, co skutkuje zwiększonym wszczepieniem komórek i zwiększonymi wskaźnikami przeżycia leczonego danio pręgowanego.

Zoptymalizowane wstrzyknięcie dożylne dorosłym danio pręgowanym

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół automatycznego wszczepiania ksenoprzeszczepu nowotworowego larwam danio pręgowanego za pomocą nowoczesnego robotycznego systemu iniekcji. Ponadto prezentujemy filmy z iniekcjami oraz dane walidacyjne pokazujące skuteczną wydajność systemu.

Automatyzacja implantacji guzów w larwach danio dano młodego dla badań i medycyny nowotworowej

W niniejszym artykule prezentujemy metodę przeprowadzania HCT u dorosłych danio pręgowanych.

Przeszczepianie całego szpiku nerkowego u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj technikę wstrzyknięcia zaoczodołowego u dorosłych danio pręgowanego w badaniach nad przeszczepianiem komórek macierzystych krwi. Metoda umożliwia wizualizację komórek dawcy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Przeglądaj więcej filmów