Name: Modelowanie mysiego zapalenia jelita grubego przy użyciu siarczanu dekstranu sodu (DSS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę indukcji ostrego zapalenia jelita grubego u myszy za pomocą siarczanu dekstranu sodu (DSS). Protokół obejmuje podawanie DSS w wodzie do picia oraz przygotowanie tkanek do analizy histologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zapewnione przez NIH (1 K08 DK080221-01) oraz fundusze na rozwój instytucjonalny Vanderbilt.

Część 1: Model zapalenia jelita grubego w cyklu uszkodzenie-naprawa
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem podawania DSS należy zmierzyć masę początkową każdej myszy.</li>
<li>Przygotować 3% (w/v) roztwór siarczanu dekstranu sodu (DSS) w wodzie i przefiltrować go za pomocą filtra z octanu celulozy o wielkości porów 0,45 μm.</li>
<li>W klatkach z myszami zastąpić wodę pitną 3% roztworem DSS na okres czterech dni. Myszy nie powinny mieć dostępu do żadnego innego źródła wody (np. poprzez zastosowanie końcówek blokujących w automatycznych systemach pojenia).</li>
<li>W czwartym dniu zastąpić roztwór DSS wodą na kolejne trzy dni, aby umożliwić częściową regenerację nabłonka jelita grubego. W czwartym dniu należy zważyć myszy w celu określenia ogólnoustrojowych następstw zapalenia jelit. Utrata masy ciała jest częsta w przypadku ciężkich uszkodzeń.</li>
<li>W siódmym dniu zważyć i poświęcić myszy. Eutanazję myszy można przeprowadzić poprzez przedawkowanie izofluranu drogą wziewną lub za pomocą innych metod zatwierdzonych przez instytucjonalną komisję etyczną (IACUC).</li>
</ol>
Część 2: Nekropsja i pobieranie okrężnicy
<ol>
<li>Odsłoń stronę brzuszną myszy i unieruchom kończyny, aby zapewnić niezakłócony dostęp do jamy brzusznej. Całkowicie zwilż brzuch 70% etanolem.</li>
<li>Chwyć linię pośrodkową brzucha pęsetą anatomiczną i pociągnij ku górze, napinając skórę. Używając nożyczek z cienkimi końcówkami, wykonaj nacięcie brzucha, odsłaniając jego zawartość. Przedłuż nacięcie do konca wyrostka mieczowatego w linii pośrodkowej, a następnie wzdłuż dolnej krawędzi łuków żebrowych obustronnie.</li>
<li>Zidentyfikuj jelito cienkie, kątnicę oraz jelito grube. Ostrożnie oddziel jelito grube od otaczającej je krezki. Przetnij jelito grube głęboko w miednicy, aby uwolnić końcowy odcinek jelita grubego i odbytnicę. Przetnij jelito grube na granicy kątniczo-okrężniczej, aby uwolnić proksymalny odcinek jelita grubego. Podczas tego procesu należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić jelita grubego, ponieważ w przypadku perforacji oczyszczanie jelita będzie problematyczne.</li>
<li>Używając igły do karmienia 20G i strzykawki 10 ml, wprowadź kaniulę i przepłucz jelito grube lodowatym PBS, aż eluat będzie całkowicie wolny od treści kałowej.</li>
<li>Na tym etapie, jeśli planowana jest analiza makroskopowa z użyciem mikroskopu sekcyjnego, jelita grube można utrwalić w formie „kiełbasek”. Jeśli wymagana jest wyłącznie analiza histologiczna, przejdź do Części 4 „Przygotowanie Swiss Rolls do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego”.</li>
</ol>
Część 3: Przetwarzanie w formie „parówek” do analizy makroskopowej całego okrężnicy
<ol>
<li>Ważne jest zachowanie prawidłowej orientacji okrężnicy, dlatego należy trzymać jej koniec dystalny najbliżej operatora. Odciąć dwa kawałki nici niewchłanialnej (SP116 1.5 metric braided silk), jeden o długości około 1 cala, a drugi 2 cale.</li>
<li>Użyć 2-calowego kawałka nici, aby podwiązać koniec dystalny jak najbliżej marginesu, zachowując przy tym szczelność.</li>
<li>Wprowadzić igłę do karmienia 20G zawierającą 5 ml 10% buforowanego formaliny fosforanu do końca proksymalnego okrężnicy. Luźno zawiązać pozostały kawałek nici bezpośrednio proksymalnie względem kolby igły. Mocno chwycić okrężnicę w miejscu kolby igły i wstrzykiwać formalinę, aż okrężnica zostanie rozszerzona. Zaciągnąć węzeł nici podczas wycofywania igły, pozostawiając w ten sposób wypełnioną i rozszerzoną okrężnicę w formie „parówki”.</li>
<li>Napełnić stożkową probówkę 15 ml 10% buforowanym formaliny fosforanem i umieścić w niej okrężnicę. Fixować przez 24 godziny.</li>
<li>Odlać formalinę i zastąpić ją 70% EtOH na kolejne 24 godziny. (Okrężnice mogą być przechowywane w 70% EtOH w temperaturze pokojowej bezterminowo).</li>
<li>Wyjąć okrężnicę z probówki stożkowej i przeciąć nici na obu końcach skalpelem, uważając, aby nie uszkodzić tkanki. Należy pamiętać, że koniec dystalny ma najdłuższy kawałek nici. Przeciąć okrężnicę wzdłużnie od końca dystalnego do proksymalnego, tak aby utworzyła długi płat. Na tym etapie okrężnicę można oglądać pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
</ol>
Część 4: Przygotowanie rolek szwajcarskich do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego
<ol>
<li>Ważne jest zachowanie prawidłowej orientacji okrężnicy, dlatego należy umieścić jej koniec dystalny najbliżej operatora.</li>
<li>Zmierz długość jelita grubego. Parametr ten jest kolejnym wskaźnikiem ciężkości urazu. Zapalenie jelita grubego zwiększa obrzęk i skraca całkowitą długość jelita grubego.</li>
<li>Za pomocą nożyczek z cienkimi końcówkami wykonaj nacięcie wzdłużne od końca dystalnego do proksymalnego jelita grubego. Używając pęsety z cienkimi końcówkami, chwyć oba brzegi nacięcia i rozchyl je bocznie, przesuwając się w kierunku dystalnym.&gt;proksymalnie, rozkładając w ten sposób okrężnicę w formie płaskiego arkusza.</li>
<li>Rolowanie okrężnicy wymaga użycia pary pincet oraz techniki dwuręcznej. Za pomocą pincety należy chwycić jedną z krawędzi marginesu dystalnego. Następnie należy sekwencyjnie rolować okrężnicę poprzez obracanie i puszczanie pincety, kierując się w stronę marginesu proksymalnego. W ten sposób powstanie spirala z trzecim wymiarem, tzw. „Swiss Roll” (rolada szwajcarska). Aby utrzymać formę zwiniętą, należy mocno chwycić rulon pincetą i przeciąć go igłą 27G 1/2. Igłę należy zabezpieczyć, zaginając ją w miejscu wyjścia z rulonu. </li>
<li>Umieść zwitek w odpowiednio oznakowanej kasecie do tkanek, a następnie przełóż go do słoika z 10% buforowanym formalorem fosforanowym w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aby zapewnić utrwalenie tkanki.</li>
<li>Odlać formalinę i zastąpić ją 70% EtOH na kolejne 24 h. (Jelita grubie mogą być przechowywane w 70% EtOH w temperaturze pokojowej bezterminowo).</li>
<li>Po utrwaleniu próbkę można zalać parafiną, wykroić jej przekroje i nanieść na szkiełka przedmiotowe do analizy histologicznej.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki
Model DSS w ostrym zapaleniu jelita grubego umożliwia badaczowi pobranie, utrwalenie i analizę jelita grubego modelującego ten proces. Jeśli procedura „Swiss roll” zostanie wykonana prawidłowo, po rozcięciu i zamontowaniu próbki powinna ona tworzyć reprezentatywny przekrój całego jelita grubego (Rycina 1). Zamontowany zwój można barwić metodą H&amp;E, aby określić zakres uszkodzeń jelita grubego, od końca dystalnego (wewnętrznego) do proksymalnego (zewnętrznego) (Rycina 2). Na preparacie „Swiss roll” można również przeprowadzić immunohistochemię w celu identyfikacji i ilościowego określenia nacieków zapalnych. Jeśli metoda „sausage” została wykonana prawidłowo, utrwalone jelito grubego będzie rozszerzone, a całą powierzchnię śluzówki będzie można łatwo manipulować i oglądać pod mikroskopem stereoskopowym (Rycina 3).
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig1tmb.jpg" alt="Przygotowanie próbki tkanki do badania histologicznego; obraz mikroskopowy; zatapianie w parafinie; analiza przekrojów." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"></a> Rysunek 1. Poprawnie wykonana technika „szwajcarskiej rolki”. (A) Okrężnicę zwijano od końca dystalnego do proksymalnego, przecinano igłą i zabezpieczano poprzez zagięcie końcówki igły. Następnie umieszczano ją w kasecie tkankowej w celu utrwalenia. (B) Przekrój o grubości 5 μm barwiony H&amp;E z „szwajcarskiej rolki” wykonanej z okrężnicy myszy traktowanej DSS (d= okrężnica dystalna p= okrężnica proksymalna).
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig2tmb.jpg" alt="Porównanie histologiczne, woda vs DSS, tkanka jelita grubego, powiększenie 4x i 20x, obrazy mikroskopowe." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"></a> Rycina 2. Jelita grube traktowane DSS wykazują oznaki ostrego zapalenia jelit. W porównaniu z kontrolą traktowaną wodą, w jelicie grubym traktowanym DSS widoczne są stan zapalny oraz uszkodzenia krypt.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig3tmb.jpg" alt="Schemat szycia ścięgna; rozmieszczenie nici niepochłanialnej od końca proksymalnego do dystalnego w celu naprawy." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"></a> Rycina 3. Przykład „kiełbaski”. Kiełbaska nasycona formaliną i całkowicie rozszerzona. Wystąpi niewielki kąt wynikający z naturalnego zakrzywienia okrężnicy. Rozcięta kiełbaska powinna leżeć płasko.

<ol><li>Okayasu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Mtgr1+sensitizes+the+colonic+epithelium+to+dextran+sodium+sulfate-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis.</a> Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22Swiss+roll%22%3A+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).</li>
<li>Aharoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+therapeutic+effect+of+glatiramer+acetate+on+several+murine+models+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease.</a> J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).</li>
<li>Hahm, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+transforming+growth+factor+beta+signalling+in+the+intestine+contributes+to+tissue+injury+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 49 (2), 190-198 (2001).</li>
<li>Green, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+modulation+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+adherence+to+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).</li>
<li>Dieleman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+experimental+colitis+induced+by+dextran+sulphate+sodium+%28DSS%29+is+characterized+by+Th1+and+Th2+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines.</a> Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez Vanderbilt IACUC.

Niniejszy protokół można zmodyfikować w celu modelowania procesów ostrego uszkodzenia, naprawy po uszkodzeniu lub przewlekłego uszkodzenia okólniczego.
Modyfikacja ostrego urazu:
leczenie DSS ad lib przez 4-6 dni, a następnie natychmiastowe uśmiercenie zwierząt
Modyfikacja procesu uszkodzenia i naprawy:
Wywołanie urazu poprzez podawanie DSS przez 4-6 dni, po czym następuje okres rekonwalescencji trwający 3-4 dni ...

<table><tbody><tr><td>Siarczan dekstranu sodowy</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>9011-18-1</td><td>masa cząsteczkowa 40,000-50,000</td></tr><tr><td>10% buforowana formalina fosforanowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>NDC 57319-474-06</td><td></td></tr><tr><td>Kasety TISSUE PATH Macrosette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15182706</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka BD 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>E190</td><td>Rozcieńczyć do 70% wodą destylowaną</td></tr><tr><td>Prosta igła do żywienia 20G</td><td>VWR international</td><td>20068-612</td><td></td></tr><tr><td>Igła PrecisionGlide 27G1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do sekcji z ostrym/tępym końcem</td><td>VWR international</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Waugha</td><td>VWR international</td><td>82027-428</td><td></td></tr><tr><td>Niewchłanialna nić chirurgiczna</td><td>LOOK Surgical</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman do blotowania</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td>Dociąć według potrzeb</td></tr><tr><td>Filtr z octanu celulozy bez surfaktantów (SFCA) Nalgene</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06731-2</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy suwmiarka z kompozytu z włókna węglowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-007-958</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (dss)

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Zapalenie jelita grubego może być wynikiem infekcji wirusowych lub bakteryjnych, niedokrwienia lub schorzeń autoimmunologicznych; najczęściej dotyczy to wrzodziejącego zapalenia jelita grubego oraz postaci jelitowej choroby Crohn – zapalenia jelita grubego w przebiegu choroby Crohn. Ostre zapalenie jelita grubego może objawiać się bólem i wzdęciem brzucha, zaburzeniami wchłaniania, biegunką, krwieniami oraz obecnością śluzu w stolcu. Zaczynamy rozumieć złożone interakcje między środowiskiem, genetyką a dysfunkcją bariery nabłonkowej w nieswoistych zapaleniach jelit, a modele zwierzęce zapalenia jelita grubego okazały się kluczowe dla pogłębienia naszej wiedzy na temat tej choroby. Jeden z popularnych modeli polega na suplementacji wody pitnej myszy niskocząsteczkowym siarczanem dekstranu sodu (DSS), co prowadzi do uszkodzenia nabłonka i silnej odpowiedzi zapalnej w jelicie grubym trwającej kilka dni.1Warianty tego podejścia można wykorzystać do modelowania ostrego urazu, ostrego urazu z następującym po nim procesem naprawczym oraz powtarzających się cykli podawania DSS przeplatanych okresami rekonwalescencji w celu modelowania przewlekłych chorób zapalnych2Po jednorazowej czterodniowej kuracji 3% DSS w wodzie pitnej u myszy pojawiają się objawy ostrego zapalenia jelita grubego, w tym utrata masy ciała, krwawiste stolce i biegunka. Myszy są uśmiercane po zakończeniu cyklu leczenia, a podczas sekcji wycięte okrężnice są przetwarzane i mogą zostać poddane technice „szwajcarskiego rolowania” (Swiss roll).3aby umożliwić analizę mikroskopową całego jelita grubego lub nasyconą formaliną w formie tzw. „parówek” w celu umożliwienia analizy makroskopowej. Następnie tkankę zatapia się w parafinie, wykonuje skrawki i barwi w celu oceny histologicznej.

Dekstran siarczan sodu (DSS) podawany w wodzie pitnej jest uznanym mysim modelem uszkodzenia zapalnego w przebiegu ostrego colitis. Niniejszy protokół opisuje metodę podawania DSS oraz przygotowania tkanek.

Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Zapalenie jelita grubego może wynikać z infekcji wirusowych lub bakteryjnych, niedokrwienia lub schorzeń autoimmunologicznych; w szczególności wrzodziejącego zapalenia jelita grubego oraz wariantu jelita grubego w ramach...

Myszy otrzymują 3% DSS ad libitum przez cztery dni. Podczas gdy codziennie rejestruje się masę ciała oraz występowanie biegunki i krwi w kale, po czwartym dniu DSS zostaje zastąpiony wodą z autoklawu. Po trzech dniach dostępu do wody myszy są uśpiane, a następnie usuwa się ich okrężnice.Okrężnice są mierzone i ważone. Następnie okrężnice są formowane w postaci zwiniętych rulonów (tzw. swiss rolls) lub kciukowatych wałeczków i badane pod mikroskopem. Niniejszy artykuł wideo zaprezentuje sposób pobierania i przetwarzania okrężnic w mysim modelu zapalenia jelita grubego.Niniejsza procedura jest stosowana do badania zapalenia jelita grubego w laboratorium dr. Christophera Williamsa z Katedry Biologii Nowotworów na Uniwersytecie Vanderbilt przed rozpoczęciem leczenia dekstranem siarczanem sodu. Wagi wyjściowe są ustalane w trakcie całego eksperymentu. Codzienne pomiary masy ciała są przeprowadzane po zważeniu myszy, a następnie przygotowuje się 3% (w/v) roztwór soli dekstranu siarczanu sodu (DSS) w wodzie.Aby ten model był skuteczny, DSS musi mieć niską masę cząsteczkową. Przygotuj odpowiednią ilość roztworu DSS, aby napełnić butelkę z wodą dla każdej klatki myszy, a następnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,45 µm. Zastąp butelkę z wodą pitną w klatce myszy butelką zawierającą 3% roztwór DSS. Jeśli w Twojej instytucji stosowany jest automatyczny system pojenia, zamocuj końcówki blokujące na wylewkach, aby upewnić się, że myszy nie mają dostępu do żadnego innego źródła wody.Po czterech dniach myszy są ponownie ważone, aby określić systemiczne skutki zapalenia jelita grubego. Utrata masy ciała jest częsta przy ciężkich uszkodzeniach, jednak może nie być widoczna przez kilka kolejnych dni. Czwartego dnia roztwór DSS należy zastąpić wodą na kolejne trzy dni, aby umożliwić częściową regenerację nabłonka jelita grubego.Trzy dni później, w siódmym dniu, ponowno ważymy myszy. Następnie z uśpionych myszy można pobrać okrężnicę, zgodnie z opisem w następnej sekcji. Aby pobrać okrężnicę, należy odsłonić stronę brzuszna uśpionej myszy, aby zapewnić niezakłócony dostęp do jamy brzusznej.Całkowicie zwilżyć brzuch 70% etanolem. Chwycić linię środkową brzucha pęsetą anatomiczną i unieść ją, napinając skórę, a następnie naciąć ją nożyczkami o cienkich końcówkach.Nacinamy brzuch, aby odsłonić jego zawartość. Przedłużamy nacięcie w linii środkowej aż do wierzchołka wyrostka mieczykowatego, a następnie wzdłuż dolnej krawędzi łuków żebrowych obustronnie. Identyfikujemy kątnicę jelita cienkiego oraz okrężnicę.Ostrożnie odseparuj lub rozdziel okrężnicę od otaczającej ją krezki. Następnie przetnij okrężnicę głębiej w miednicy, aby uwolnić końcowy odcinek okrężnicy od odbytnicy.Należy zachować ostrożność, aby nie przeciąć żadnych tętnic ani żył. Należy również pamiętać, że okrężnica może łatwo ulec przerwaniu. Dlatego należy delikatnie oddzielić okrężnicę od krezki.Przetnij okrężnicę na marginesie Colona sequel, aby uwolnić jej część bliższą. Usuń okrężnicę, a następnie, używając igły do karmienia 20 G i strzykawki 10 ml, zaintubuj i przepłucz okrężnicę lodowatym PBS, aż EIT będzie całkowicie oczyszczone z treści kałowej. Ważne jest zachowanie prawidłowej orientacji okrężnicy poprzez trzymanie jej końca dalszego najbliżej siebie.Zacznij od zmierzenia długości jelita grubego za pomocą suwmiarki cyfrowej. Długość jelita grubego jest kolejnym wskaźnikiem stopnia ciężkości uszkodzenia. Zapalenie jelita grubego zwiększa obrzęk i skraca całkowitą długość jelita.Na tym etapie pobrane okrężnice można przetworzyć w formie „kiełbasek” do analizy makroskopowej lub przygotować tzw. „szwajcarski roladę” (Swiss roll) do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego. W następnych sekcjach zaprezentujemy techniki przetwarzania okrężnicy w formie kiełbasek. W celu przeprowadzenia analizy makroskopowej całej okrężnicy ważne jest zachowanie jej prawidłowej orientacji. Dlatego też należy umieścić koniec dystalny okrężnicy najbliżej siebie.Odetnij dwa kawałki nici niewchłanialnej, jeden o długości około jednej cala i drugi o długości dwóch cali. Użyj dwucalowego kawałka nici, aby podwiązać dystalny koniec jelita grubego tak blisko krawędzi, jak to możliwe, zapewniając jednocześnie szczelne zamknięcie. Następnie wprowadź igłę do karmienia o rozmiarze 20 G zawierającą pięć mililitrów 10% buforowanej formaliny fosforanowej do proksymalnego końca jelita grubego.Luźno zawiąż pozostały fragment nici chirurgicznej bezpośrednio proksymalnie względem głowicy igły do wprowadzania cieczy. Następnie mocno chwyć jelito grube w miejscu głowicy igły i wprowadź odpowiednią ilość formaliny, upewniając się, że jelito jest rozszerzone. Zaciśnij węzeł na nici podczas wyciągania igły, pozostawiając w ten sposób nasycone i rozszerzone jelito grube.Wypełnij 15 mililitrową probówkę stożkową 10% buforem formaldehydowo-fosforanowym i opisz probówkę. Umieść okrężnicę w probówce i utrwalaj przez 24 godziny. Po 24 godzinach odlej formalinę do odpowiedniego pojemnika na odpady i zastąp ją 70% etanolem na kolejne 24 godziny.Jejunia mogą być przechowywane w 70% etanolu w temperaturze pokojowej przez nieokreślony czas. Przed przystąpieniem do analizy jelita grubego należy wyjąć je z probówki stożkowej. Przeciąć sznurki na obu końcach skalpelem, uważając, aby nie uszkodzić jelita.Należy pamiętać, że koniec dystalny ma najdłuższy odcinek sznurka. Przetnij okrężnicę wzdłużnie od końca dystalnego do proksymalnego, tak aby utworzyła długi płat. Okrężnicę można teraz oglądać pod mikroskopem stereoskopowym.Przetnij okrężnicę wzdłużnie i rozłóż ją na płaskiej powierzchni. Zwijanie okrężnicy wymaga użycia dwóch par pincet i techniki dwuręcznej. Chwyć obie krawędzie boczne dystalnego brzegu okrężnicy pincetami, a następnie sukcesywnie zwijaj okrężnicę poprzez rotację i puszczanie pincet, kierując się w stronę brzegu proksymalnego, tworząc w ten sposób spiralę trójwymiarową, tzw. swiss roll.Jeśli jelito grube przylega do papieru Watmana, zwilż papier i jelito niewielką ilością PBS, aby zachować jego kształt. Mocno chwyć zwinięty fragment pęsetą i przetnij go igłą o rozmiarze 27,5 G. Zabeziecz zwinięty fragment, zginając igłę w miejscu, w którym opuszcza ona tkankę.Następnie umieść zwitek w opisowanej kasecie do tkanek, a kasetę w słoiku z 10% buforowanym formalinem fosforanowym. Pozostaw go w temperaturze pokojowej przez 24 godziny w celu utrwalenia tkanki. Po 24 godzinach zlej formalin i zastąp go 70% etanolem na kolejne cztery godziny.Jejunia mogą być przechowywane w 70% etanolu w temperaturze pokojowej bez ograniczeń czasowych. Model ten pozwala badaczowi na pobranie, utrwalenie i analizę jelit grubych, co umożliwia ocenę stopnia nasilenia zapalenia jelita grubego. W celu analizy makroskopowej całego jelita grubego można je przetworzyć w formie „kiełbasy”, która jest nasycana formaliną i całkowicie rozprostowana.Otwarta „kiełbaska” powinna leżeć płasko. Jeśli metoda „kiełbaski” została wykonana prawidłowo, utrwalone jelito grube będzie rozszerzone, a cała powierzchnia śluzówki będzie łatwo dostępna do manipulacji i obserwacji pod mikroskopem stereoskopowym. Do analizy histologicznej jelito grube można przetworzyć metodą „swiss roll”.Zwinięty fragment jest zabezpieczony igłą i umieszczony w kasecie tkankowej w celu utrwalenia. Po przecięciu i zamontowaniu, przy prawidłowym zwinięciu, powinien on tworzyć reprezentatywny przekrój całego okrężnika; sekcje tzw. szwajcarskiego rulonu (Swiss roll) można barwić hematyną i ASIN w celu określenia zakresu uszkodzeń okrężnicy. Należy pamiętać, że koniec dystalny okrężnicy znajduje się w centrum rulonu na preparacie.W tym przykładzie w jelicie grubym traktowanym DSS widoczne są stan zapalny i uszkodzenia krypt w porównaniu z kontrolą traktowaną wodą. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak pobierać i przetwarzać jelita grube z mysiego modelu ostrego zapalenia jelit. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby być dobrze zorganizowanym przed uśmierceniem zwierząt.W przypadku myszy wszystkie probówki i kasety dla każdego osobnika powinny być odpowiednio oznakowane, a wszystkie narzędzia i odczynniki muszą być łatwo dostępne. Ponadto należy prowadzić szczegółowe zapisy masy ciała myszy oraz długości jelita grubego. Na koniec upewnij się, że przeznaczyłeś wystarczająco dużo czasu na procesowanie próbek.Zazwyczaj zajmuje to 15 minut na jedną mysz w przypadku osoby początkującej oraz od sześciu do ośmiu minut w przypadku osoby bardziej doświadczonej w tej technice.

murine-colitis-modeling-using-dextran-sulfate-sodium-dss

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Modelowanie kolity u myszy za pomocą siarczanu dekstrany (DSS)

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Przedstawiamy protokół, w którym podanie genotoksycznego czynnika azoksymetanu (AOM), a następnie trzy cykle podania prozapalnego dekstranu siarczanu sodu (DSS), pozwala na szybkie i powtarzalne wywołanie guzów okrężnicy u myszy, wykazujących podobieństwa morfologiczne i molekularne do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego u ludzi.

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

Ten film demonstruje technikę generowania chemicznie wywołanego mysiego modelu zapalenia jelita grubego - choroby zapalnej jelit. Mysz może spożywać roztwór siarczanu sodu dekstranu (DSS) przez odpowiedni czas. Po spożyciu DSS uszkadza barierę warstwy śluzu i nabłonka w okrężnicy, umożliwiając drobnoustrojom jelitowym przedostanie się do leżącej poniżej tkanki – gdzie są wyczuwane przez rezydujące komórki odpornościowe, aby pośredniczyć w przesadnej odpowiedzi immunologicznej, powodując stan...

Technika generowania mysiego modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem sodu

Ten film demonstruje metodę barwienia hematoksyliny i eozyny (H&amp;E) do oceny uszkodzenia jelita grubego w mysim modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS - choroby zapalnej jelit. Po wyizolowaniu okrężnicy od myszy leczonej DSS i uzyskaniu skrawków tkanki, barwienie H&amp;E skrawków pomaga zidentyfikować uszkodzenia tkanek spowodowane stanem zapalnym.

Barwienie hematoksyliną i eozyną w celu oceny uszkodzenia jelita grubego w zapaleniu jelita grubego wywołanym przez DSS

Zapalenie jelita grubego wywołane DNBS/TNBS oferuje alternatywną i tanią metodę badania patobiologii nieswoistych zapaleń jelit. Protokół omówiony w tym artykule przedstawia skuteczne zastosowanie DNBS do wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy i szczurów oraz pozwala na dokładne zbadanie odpowiedzi jelitowych za pośrednictwem gospodarza.

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Mysia kolostomia dystalna, nowy model dywersyjnego zapalenia jelita grubego u myszy C57BL / 6

Brak standaryzacji przetwarzania tkanek mysich obniża jakość analizy histopatologicznej myszy w porównaniu do próbek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania badania histopatologicznego mysich tkanek okrężnicy objętych stanem zapalnym i bez stanu zapalnego, aby wykazać wykonalność systemów robotycznych rutynowo stosowanych do przetwarzania i osadzania próbek ludzkich.

Wykorzystanie systemów robotycznych do przetwarzania i osadzania próbek myszy okrężnicy do analiz histologicznych

Prezentowany protokół opisuje łatwe chirurgiczne usunięcie wyrostka robaczkowego (łaty kątniczej) u myszy, a następnie indukcję raka jelita grubego związanego z chorobą jelit grubego. Ten mysi model wyrostka robaczkowego umożliwia badanie biologicznej roli wyrostka robaczkowego w patogenezie chorób przewodu pokarmowego u ludzi.

Mysi model wycięcia wyrostka robaczkowego przewlekłego raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego poprzez precyzyjną lokalizację łaty kątniczej

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

Charles Taylor i John Marshall wyjaśniają użyteczność modelowania matematycznego w ocenie skuteczności strategii zastępowania populacji. Przedstawiono sposób, w jaki modele obliczeniowe mogą dostarczać informacji na temat dynamiki populacji komarów oraz rozprzestrzeniania się elementów transpozycyjnych w obrębie podgatunków A. gambiae. Omówiono również kwestie etyczne związane z uwalnianiem genetycznie zmodyfikowanych komarów do środowiska naturalnego.

Przewidywanie skuteczności strategii zastępowania populacji z wykorzystaniem modelowania matematycznego

Poznaj metodę indukcji ostrego zapalenia jelita grubego u myszy za pomocą siarczanu dekstranu sodu (DSS). Protokół obejmuje podawanie DSS w wodzie do picia oraz przygotowanie tkanek do analizy histologicznej.

Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Przeglądaj więcej filmów