Modelowanie mysiego zapalenia jelita grubego przy użyciu siarczanu dekstranu sodu (DSS)

Myszom podaje się 3% DSS przy libido przez cztery dni. Podczas gdy masa ciała i obecność biegunki i krwi kałowej jest rejestrowana codziennie, TSS jest zastępowany wodą z autoklawu po czwartym dniu. Po trzech dniach na wodzie myszy są poddawane eutanazji, a ich okrężnice są usuwane.

Okrężnice są mierzone i ważone. Okrężnice są następnie formowane w szwajcarskie bułki lub kiełbasy i badane pod mikroskopem. W tym artykule wideo zademonstrujemy zbieranie i przetwarzanie okrężnicy w modelu murn zapalenia jelita grubego.

Procedura ta jest stosowana do badania zapalenia jelita grubego w laboratorium dr Christophera Williamsa z Wydziału Biologii Nowotworów na Uniwersytecie Vanderbilt przed rozpoczęciem leczenia siarczanem dekstryny i sodu. Masy wyjściowe uzyskuje się przez cały czas trwania eksperymentu. Dzienne masy ciała są pobierane po zważeniu myszy, należy wykonać 3% masy na objętość, roztwór soli sodowej siarczanu dekstryny lub DSS w wodzie.

Aby ten model był skuteczny, DSS musi mieć niską masę cząsteczkową, przygotuj wystarczającą ilość roztworu DSS, aby napełnić butelkę z wodą dla każdej klatki myszy i przefiltruj roztwór za pomocą filtra z octanu celulozy o grubości 0,45 mikrometra. Zastąp butelkę z wodą pitną w klatce dla myszy na butelkę zawierającą 3% roztwór DSS. Jeśli Twoja instytucja korzysta z automatycznego systemu pojenia, umieść wskazówki dotyczące wyłączania na dziobkach do podlewania, aby upewnić się, że myszy nie mają dostępu do żadnego innego źródła wody.

Po czterech dniach myszy są ponownie ważone w celu ilościowego określenia ogólnoustrojowych konsekwencji zapalenia jelita grubego. Utrata masy ciała jest powszechna w przypadku poważnych obrażeń, jednak może nie być widoczna przez kilka kolejnych dni tego samego dnia. Czwartego dnia zastąp roztwór DSS wodą na dodatkowe trzy dni, aby umożliwić regenerację nabłonka okrężnicy.

Trzy dni później, w siódmym dniu, myszy są ponownie ważone. Okrężnica może być następnie pobrana od myszy poddanych eutanazji, jak pokazano w następnej sekcji. Aby pobrać okrężnicę, należy odsłonić brzuszną stronę myszy poddanej eutanazji, aby zapewnić niezakłócony dostęp do brzucha.

Całkowicie zwilż brzuch 70% etanolem. Chwyć linię środkową brzucha kleszczami tkankowymi i unieś się. W ten sposób napinając skórę za pomocą nożyczek z cienką końcówką.

Naciąć brzuch, aby odsłonić zawartość jamy brzusznej. Przedłuż nacięcie do czubka wyrostka mieczykowatego w linii środkowej, a następnie rozciągnij wzdłuż dolnej części brzegów żebrowych obustronnie. Zidentyfikuj jelito cienkie, jelito ślepe i okrężnicę.

Ostrożnie wypreparuj cięcie, drażnij okrężnicę z otaczającej krezki. Następnie przeciąć okrężnicę, pogłębić miednicę, aby się uwolnić. Dystalna część okrężnicy od odbytnicy.

Należy zachować ostrożność, aby nie doszło do przecięcia tętnic ani żył. Należy również pamiętać, że okrężnica może się łatwo rozerwać. Więc delikatnie usuń okrężnicę z krezki.

Przeciąć okrężnicę na marginesie kontynuacji okrężnicy, aby uwolnić proksymalną okrężnicę. Usuń okrężnicę i sumę za pomocą igły do karmienia o rozmiarze 20 i 10-mililitrowej strzykawki, zaintubuj i przepłucz okrężnicę lodowatym PBS, aż EIT całkowicie oczyści się ze stolca. Ważne jest, aby utrzymać prawidłową orientację jelita grubego, utrzymując dystalny koniec okrężnicy najbliżej siebie.

Zacznij od zmierzenia długości okrężnicy za pomocą suwmiarki cyfrowej. Długość jelita grubego jest kolejnym wskaźnikiem ciężkości urazu. Zapalenie jelita grubego zwiększa obrzęk i skraca całkowitą długość jelita grubego.

W tym momencie zebrane okrężnice można przetworzyć na kiełbasy do analizy makroskopowej lub przetworzyć na szwajcarską bułkę do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego. W poniższych sekcjach zademonstrujemy te techniki, aby przetworzyć okrężnicę jako kiełbasę W analizie makroskopowej całej okrężnicy ważne jest utrzymanie prawidłowej orientacji okrężnicy. Dlatego trzymaj dystalny koniec okrężnicy jak najbliżej siebie.

Wytnij dwa kawałki niewchłanialnego szwu, jeden o długości około jednego cala, a drugi o długości dwóch cali. Użyj dwucalowego kawałka szwu, aby związać dystalny koniec okrężnicy jak najbliżej brzegu, zachowując przy tym dobre uszczelnienie. Następnie umieść igłę do karmienia o rozmiarze 20 zawierającą pięć mililitrów 10% buforowanego fosforanu formaliny w bliższym końcu okrężnicy.

Luźno przywiąż pozostały kawałek szwu bezpośrednio proksymalnie do gruszki igły do karmienia. Teraz chwyć mocno okrężnicę za gruszkę igły do karmienia i wlej wystarczającą ilość formaliny, upewniając się, że okrężnica jest rozszerzona. Zaciśnij węzeł w szwie, wycofując igłę do karmienia, pozostawiając w ten sposób rozszerzoną okrężnicę.

Jako kiełbasę napełnij 15-mililitrową stożkową rurkę 10% buforem, formalem i fosforanem, a następnie oznacz probówkę. Umieść okrężnicę w probówce i zamocuj na 24 godziny. Po 24 godzinach odlej forminę do odpowiedniego pojemnika na odpady i zastąp ją 70% etanolem na dodatkowe 24 godziny.

Okrężnicy mogą być przechowywane w 70% etanolu przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej. Kiedy będziesz gotowy do analizy okrężnicy, usuń ją ze stożkowej rurki. Przetnij sznurki na każdym końcu skalpelem, uważając, aby nie uszkodzić okrężnicy.

Pamiętaj, że dystalny koniec ma najdłuższy kawałek sznurka. Przetnij okrężnicę wzdłużnie od dystalnego do bliższego końca, tak aby utworzyła długi arkusz. Okrężnica może być teraz oglądana pod mikroskopem preparacyjnym.

Przetnij okrężnicę wzdłuż i ułóż dwukropek jako płaski arkusz. Zwijanie okrężnicy wymaga dwóch par kleszczy i techniki oburęcznej. Chwyć obie boczne krawędzie dystalnego brzegu okrężnicy za pomocą kleszczy przystąp do sekwencyjnego zwijania okrężnicy, obracając i zwalniając kleszcze idące do bliższego brzegu, tworząc w ten sposób spiralę z trzecim wymiarem lub rolką szwajcarską.

Jeśli dwukropek przylega do papieru watmana, zwilż papier i dwukropek niewielką ilością PBS, aby zachować formę. Chwyć mocno rolkę kleszczami i przetnij igłą o rozmiarze 27 i pół raziku. Zabezpiecz rolkę, zginając igłę podczas wychodzenia z rolki.

Teraz umieść rolkę w oznakowanej kasecie na chusteczki i umieść kasetę w słoiku z 10% buforowanym fosforanem formaliny. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aby utrwalić tkankę. Po 24 godzinach odlej formalinę i zastąp ją 70% etanolem na dodatkowe do czterech godzin.

Okrężnicy mogą być przechowywane w 70% etanolu przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej. Model ten pozwala badaczowi uzyskać, naprawić i przeanalizować jelita grubego, umożliwiając w ten sposób analizę nasilenia zapalenia jelita grubego. Do analizy makroskopowej całej okrężnicy, okrężnica może być przetwarzana jako kiełbasa, która jest nasączona formaliną i całkowicie rozprężona.

Otwarta kiełbasa powinna leżeć płasko. Jeśli metoda kiełbasy została wykonana prawidłowo, nieruchoma okrężnica zostanie rozszerzona, a cała powierzchnia błony śluzowej będzie mogła być łatwo manipulowana i oglądana pod mikroskopem preparacyjnym. Do analizy histologicznej okrężnica może być przetwarzana jako szwajcarska bułka.

Rolka jest zabezpieczona igłą i umieszczona w kasecie na chusteczki w celu utrwalenia. Po przecięciu i zamontowaniu rolki powinna ona stanowić reprezentatywny wycinek całej okrężnicy, jeśli jest prawidłowo zwijana, odcinki szwajcarskiej rolki można zabarwić hematyną i ASIN w celu określenia zakresu uszkodzenia okrężnicy. Pamiętaj, że dystalny koniec okrężnicy znajduje się w środku rolki na szkiełku.

W tym przykładzie stan zapalny i uszkodzenie krypty są widoczne w okrężnicy leczonej DSS w porównaniu z kontrolą traktowaną wodą. Właśnie pokazaliśmy, jak zbierać i przetwarzać okrężnice z mysiego modelu ostrego zapalenia jelita grubego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, abyś był dobrze zorganizowany przed poświęceniem.

Myszy, na przykład, mają wszystkie probówki i kasety oznaczone dla każdej myszy oraz wszystkie narzędzia i odczynniki są łatwo dostępne. Ponadto prowadź szczegółowe zapisy dotyczące wagi myszy i długości okrężnicy. Na koniec upewnij się, że masz wystarczająco dużo czasu na przetworzenie.

Zwykle zajmuje to 15 minut na mysz dla nowicjusza i od sześciu do ośmiu minut dla kogoś bardziej doświadczonego w tej technice.