Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Myszy otrzymują 3% DSS ad libitum przez cztery dni. Podczas gdy codziennie rejestrowano masę ciała oraz występowanie biegunki i krwi w kale, po czwartym dniu DSS zastąpiono wodą autoklawowaną. Po trzech dniach pobierania wody myszy zostają uśmiercone, a ich okrężnice zostają usunięte.

Okrężnice są mierzone i ważone. Następnie okrężnice są formowane w postaci tzw. szwajcarek (Swiss rolls) lub parówek i badane pod mikroskopem. Niniejszy artykuł wideo zaprezentuje pobieranie i przetwarzanie okrężnic w mysim modelu zapalenia jelita grubego.

Niniejsza procedura jest stosowana do badania zapalenia jelita grubego w laboratorium dr. Christophera Williamsa z Katedry Biologii Nowotworów na Vanderbilt University przed rozpoczęciem leczenia siarczanem dekstranu sodu. Wagi wyjściowe są ustalane w trakcie całego eksperymentu. Pomiary masy ciała są wykonywane codziennie po zważeniu myszy; należy przygotować 3% roztwór (masy w objętości) soli siarczanu dekstranu sodu, czyli DSS, w wodzie.

Aby ten model był skuteczny, DSS musi mieć niską masę cząsteczkową; należy przygotować wystarczającą ilość roztworu DSS, aby napełnić butelkę z wodą dla każdej klatki z myszami, a następnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,45 µm. Butelkę z wodą pitną w klatce z myszami należy zastąpić butelką zawierającą 3% roztwór DSS. W przypadku korzystania w jednostce badawczej z automatycznego systemu pojenia, na wylotach wody należy zamontować końcówki blokujące, aby upewnić się, że myszy nie mają dostępu do żadnego innego źródła wody.

Po czterech dniach myszy są ponownie ważone, aby określić ogólnoustrojowe skutki zapalenia jelita grubego. Utrata masy ciała jest powszechna przy ciężkich uszkodzeniach, jednak może nie być zauważalna jeszcze przez kilka kolejnych dni. W czwartym dniu roztwór DSS należy zastąpić wodą na kolejne trzy dni, aby umożliwić częściową regenerację nabłonka jelita grubego.

Trzy dni później, w siódmym dniu, ponownie ważymy myszy. Następnie, zgodnie z opisem w kolejnej sekcji, można pobrać okrzelnicę od uśpionych myszy. Aby pobrać okrzelnicę, należy odsłonić stronę brzuszną uśpionej myszy, aby zapewnić niezakłócony dostęp do jamy brzusznej.

Całkowicie zwilżyć brzuch 70% ethanol. Chwycić linię środkową brzucha pęsetą chirurgiczną i unieść, tworząc namiot z skóry, a następnie przeciąć za pomocą nożyczek z cienkimi końcówkami.

Nacinamy brzuch, aby odsłonić jego zawartość. Przedłużamy nacięcie w linii środkowej aż do wierzchołka wyrostka mieczowatego, a następnie rozszerzamy je wzdłuż dolnej krawędzi łuków żebrowych po obu stronach. Identyfikujemy kątnicę jelita cienkiego oraz jelito grube.

Ostrożnie wypreparuj lub oddziel dwukropek od otaczającej go krezki. Następnie przetnij jelito grube głębiej w miednicy, aby uwolnić końcowy odcinek jelita grubego od odbytnicy.

Należy zachować ostrożność, aby nie przeciąć żadnych tętnic ani żył. Należy również pamiętać, że okrężnica może łatwo ulec rozerwaniu, dlatego należy delikatnie oddzielić ją od krezki.

Przetnij okrężnicę na wysokości marginesu Colona sequel, aby uwolnić jej część proksymalną. Usuń okrężnicę, a następnie, używając igły do karmienia o rozmiarze 20 G i strzykawki 10 ml, wprowadź kaniulę i płucz okrężnicę lodowatym roztworem PBS, aż EIT zostanie całkowicie oczyszczony z kału. Ważne jest zachowanie prawidłowej orientacji okrężnicy poprzez trzymanie jej końca dystalnego najbliżej siebie.

Zacznij od pomiaru długości jelita grubego za pomocą cyfrowego suwmiarki. Długość jelita grubego jest kolejnym wskaźnikiem stopnia ciężkości urazu. Zapalenie jelita grubego zwiększa obrzęki i prowadzi do skrócenia całkowitej długości jelita grubego.

Na tym etapie pobrane okrężnice można przetworzyć w formie „kiełbasek” (sausages) do analizy makroskopowej lub przygotować tzw. „szwajcarskie rolki” (Swiss roll) do analizy histologicznej ostrego zapalenia jelita grubego. W następnych sekcjach zaprezentujemy techniki przetwarzania okrężnicy w formie „kiełbasek”. Aby przeprowadzić analizę makroskopową całej okrężnicy, ważne jest zachowanie prawidłowej orientacji narządu. Dlatego też koniec dystalny okrężnicy powinien znajdować się najbliżej badacza.

Odetnij dwa kawałki nici niewchłanialnej, jeden o długości około jednej cali, a drugi o długości dwóch cali. Użyj dwucalowego fragmentu nici do podwiązania dystalnego końca okrężnicy jak najbliżej marginesu, dbając jednocześnie o zachowanie szczelności. Następnie wprowadź igłę do karmienia o rozmiarze 20G zawierającą 5 mL 10% buforowanego formaliny fosforanu do proksymalnego końca okrężnicy.

Luźno zawiąż pozostały fragment nici chirurgicznej bezpośrednio proksymalnie względem główki igły do infuzji. Teraz mocno chwyć okrężnicę w miejscu główki igły i wprowadź odpowiednią ilość formaliny, upewniając się, że okrężnica jest rozszerzona. Zaciśnij węzeł na nici podczas wycofywania igły, pozostawiając w ten sposób nasyconą i rozszerzoną okrężnicę.

Próbkę jelita grubego umieść w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów wypełnionej 10% buforem fosforanowym z formaldehydem i opisz probówkę. Umieść jelito w probówce i utrwalaj przez 24 godziny. Po 24 godzinach odlej utrwalacz do odpowiedniego pojemnika na odpady i zastąp go 70% etanolem na kolejne 24 godziny.

Jejuna można przechowywać w 70% etanolu w temperaturze pokojowej w nieskończoność. Gdy będziesz gotowy do analizy jelita grubego, wyjmij je z probówki stożkowej. Przetnij sznurki na obu końcach skalpelem, uważając, aby nie uszkodzić jelita.

Należy pamiętać, że koniec dystalny posiada najdłuższy odcinek sznurka. Przetnij okrężnicę wzdłużnie od końca dystalnego do proksymalnego, tak aby utworzyła długi płat. Okrężnicę można teraz oglądać pod mikroskopem stereoskopowym.

Przetnij okrężnicę wzdłużnie i rozłóż ją na płasko. Do zwijania okrężnicy wymagane są dwie pary pincet oraz technika dwuręczna. Chwyć pincetami oba boczne brzegi dystalnego odcinka okrężnicy, a następnie stopniowo zwijaj jelito, rotując i puszczając pincety w kierunku brzegu proksymalnego, tworząc w ten sposób spiralę w trzech wymiarach, tzw. szwajcarską roladę.

Jeśli jelito grube przywiera do papieru Watmana, należy zwilżyć papier i jelito niewielką ilością PBS, aby zachować jego kształt. Mocno chwycić zwój pęsetą i przeciąć igłą o rozmiarze 27,5 G. Zabezpieczyć zwój, zaginając igłę w miejscu, w którym wychodzi ona z tkanki.

Następnie należy umieścić zwitek w podpisanej kasecie do tkanek, a następnie włożyć kasetę do słoika z 10% buforowanym formalinem fosforanowym. Pozostawić w temperaturze pokojowej przez 24 godziny w celu utrwalenia tkanki. Po 24 godzinach należy odlać formalinę i zastąpić ją 70% etanolem na kolejne cztery godziny.

Jejuna można przechowywać w 70% etanolu w temperaturze pokojowej przez nieokreślony czas. Model ten pozwala badaczowi na pobranie, utrwalenie i analizę jelit grubych, co umożliwia ocenę stopnia nasilenia zapalenia jelit. W celu analizy makroskopowej całego jelita grubego można je przetworzyć w formie „kiełbasy”, która zostaje nasycona formaliną i całkowicie rozprostowana.

Rozcięta jelita powinny leżeć płasko. Jeśli metoda „kiełbasy” została wykonana prawidłowo, unieruchomiona okrężnica będzie rozszerzona, a cała powierzchnia błony śluzowej będzie można łatwo manipulować i oglądać pod mikroskopem stereoskopowym. Do analizy histologicznej okrężnicę można przetworzyć metodą tzw. szwajcarskiego rulonu.

Zwinięty fragment jest zabezpieczony igłą i umieszczony w kasecie do tkanek w celu utrwalenia. Po przecięciu i zamontowaniu, przy prawidłowym zwinięciu, powinien on tworzyć reprezentatywny przekrój całego jelita grubego; sekcje tzw. swiss roll można barwić hematyną i ASIN, aby określić zakres uszkodzeń jelita grubego. Należy pamiętać, że dystalny koniec jelita grubego znajduje się w centrum zwiniętego fragmentu na szkiełku.

W tym przykładzie stan zapalny oraz uszkodzenia krypt są widoczne w okrężnicy traktowanej DSS w porównaniu do kontroli traktowanej wodą. Przedstawiliśmy właśnie sposób pobierania i przetwarzania okrężnic z mysiego modelu ostrego zapalenia jelit. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby być dobrze zorganizowanym przed uśmierceniem zwierząt.

W przypadku myszy wszystkie probówki i kasety powinny być opisane dla każdego zwierzęcia, a wszystkie narzędzia i odczynniki powinny być przygotowane i dostępne. Ponadto należy prowadzić szczegółową dokumentację masy ciała myszy oraz długości jelita grubego. Na koniec upewnij się, że przeznaczyłeś wystarczająco dużo czasu na procesowanie próbek.

Wykonanie tej procedury zajmuje zazwyczaj 15 minut na jedną mysz w przypadku osoby początkującej oraz od sześciu do ośmiu minut w przypadku osoby bardziej doświadczonej w tej technice.