Name: Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do transfekcji ogniw pierwotnych z wysoką wydajnością (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Poznaj optymalizację elektroporacji pierwotnych linii komórkowych przy użyciu systemu Gene Pulser MXcell. Protokół umożliwia szybkie testowanie wielu warunków transfekcji mysich fibroblastów zarodkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) Przygotowanie komórek
 <ol>
 <li>W przypadku użycia komórek adherentnych konieczne jest potraktowanie ich trypsyną i zebranie przed elektroporacją.</li>
 <li>Aby porównać wydajność transfekcji w czterech kulturach zarodkowych fibroblastów mysich (MEF), reprezentujących trzy różne numery pasażu, wykonaj następujące czynności w każdej kolbie.</li>
 <li>Odsaj cały pożywkę hodowlana.</li>
 <li>Dodaj PBS w celu przemycia komórek.</li>
 <li>Usuń PBS; dodaj odpowiednią ilość trypsyny, aby pokryć komórki, i odczekaj kilka minut, aby trypsyna mogła oddzielić komórki od podłoża.</li>
 <li>Sprawdź kolby pod mikroskopem, aby zweryfikować stan komórek, delikatnie uderz w kolbę, aby oddzielić komórki, a następnie ponownie sprawdź kolbę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały oddzielone.</li>
 <li>Odczekaj dodatkowy czas i powtórz czynność, jeśli to konieczne.</li>
 <li>Gdy wszystkie komórki zostaną oddzielone, dodaj pożywkę zawierającą serum, aby zneutralizować trypsynę.</li>
 <li>Przenieś komórki do probówki wirówkowej i odwirowaj je (rcf = 30 x g).</li>
 <li>Usuń supernatant i resuspenderuj komórki w znanej objętości PBS.</li>
 <li>Policz komórki.</li>
 <li>Przenieś do nowej probówki odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać wymaganą liczbę komórek do eksperymentów (wymagane będzie 150 μL komórek na studzienkę przy gęstości 1 x 106 komórek/mL).</li>
 <li>Odwiruj komórki.</li>
 <li>Usuń supernatant i resuspenderuj komórki w odpowiedniej objętości buforu do elektroporacji Gene Pulser, aby uzyskać gęstość komórek 1 x 106 komórek/mL.</li>
 <li>Dodaj 20 μg plazmidu na 1 mL zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj.</li>
</ol>
2) Przygotowanie naczynia do elektroporacji i przeprowadzanie elektroporacji
Przygotowanie płytki i elektroporacja
<ol>
<li>Podłącz komorę na płytki do modułu zasilania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell.</li>
 <li>Pipetuj 150 μL mieszaniny komórek lub buforu do studni 96-dołkowej płytki do elektroporacji.</li>
 <li>Włóż płytkę do komory i przeprowadź impulsy elektryczne.</li>
 <li>Wyjmij płytkę z komory.</li>
 <li>Dokładnie wymieszaj zawartość studni, pipetując ciecz w górę i w dół w każdej z nich.</li>
 <li>Przenieś komórki z każdej studni do uprzednio ogrzanego buforu w płytkach 12-dołkowych.</li>
 <li>Wystukaj płytkę, aby równomiernie rozdzielić komórki, a następnie umieść ją w inkubatorze.</li>
 <li>Pozostaw komórki do regeneracji na 24 godziny.</li>
</ol>
Przygotowanie kuwety i elektroporacja
<ol start="9">
 <li>Odłącz komorę do płytek z modułu zasilania systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell i podłącz komorę do kuwet ShockPod™.</li>
 <li>Pipetuj 60 μL zawiesiny komórkowej do kuwety do elektroporacji z przerwą 0,4 cm.</li>
 <li>Umieść kuwetę w komorze ShockPod i podaj impuls elektryczny.</li>
 <li>Wyjmij kuwetę z komory.</li>
 <li>Wymieszaj zawartość kuwety, pipetując ciecz w górę i w dół.</li>
 <li>Przenieś komórki z każdej studzienki do uprzednio ogrzanego buforu w płytkach 12-dołkowych.</li>
 <li>Opukaj płytkę, aby rozmieścić komórki, i umieść ją w inkubatorze.</li>
 <li>Pozostaw komórki do regeneracji na 24 godziny.</li>
 </ol>
3) Reprezentatywne wyniki
Po transfekcji komórek i ich regeneracji, przeanalizuj wydajność transfekcji jakościowo, wykorzystując mikroskopię epifluorescencyjną, oraz ilościowo, za pomocą cytometrii przepływowej.
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="Hodowla komórkowa pod mikroskopem; mikroskopia fluorescencyjna, obrazowanie komórek, badania biomedyczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Komórki, które zostały pomyślnie poddane elektroporacji i wykazują obecnie ekspresję genu GFP, są widoczne w mikroskopii epifluorescencyjnej.
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej, komórki fibroblastyczne na podłożu, wykorzystywany w badaniach biologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Obserwacja komórek w kontraście fazowym pozwala na wizualizację zarówno komórek transfekowanych, jak i nietransfekowanych. Są to komórki poddane elektroporacji z najniższym napięciem impulsu wynoszącym 20 V. Komórki są w dużej mierze konfluencyjne ze względu na wysoką gęstość komórkową.
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający rozmieszczenie komórek; analiza ekspresji i lokalizacji białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Ten sam obszar widzenia w epifluorescencji pokazuje, że część komórek wykazuje ekspresję markera GFP, stanowią one jednak jedynie niewielki odsetek komórek widocznych na poprzednim obrazie.
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej; morfologia powierzchni; badania biologiczne; badanie wzrostu komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Przy 250 V całkowita liczba żywych komórek widocznych w kontraście fazowym nieznacznie spada.
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; rozkład komórek w hodowli tkankowej, analiza optyczna wzrostu komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. W świetle epifluorescencyjnym można zauważyć, że liczba komórek wykazujących ekspresję GFP wzrosła.
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowych, gęsty rozkład komórek, analiza badań biologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> Rycina 6. Przy najwyższym przyłożonym napięciu, wynoszącym 375 V, widocznych jest mniej żywych komórek.
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="Hodowla komórkowa pod mikroskopem fluorescencyjnym; obraz mikroskopowy; badanie zachowania i morfologii komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> Rycina 7. Jednak duży odsetek pozostałych komórek wykazuje ekspresję GFP. To, który warunek jest optymalny, zależy od projektu eksperymentalnego. W niektórych doświadczeniach optymalna może być największa liczba komórek transfekowanych, w innych zaś najwyższy procent transfekcji.
Interesuje nas odsetek komórek GFP-dodatnich w każdym z warunków oraz sposób, w jaki wartości te zmieniają się wraz z wiekiem komórek. Cytometria przepływowa pozwala na uzyskanie ilościowych informacji na temat wyników transfekcji dla każdego z różnych warunków elektroporacji.
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający procent GFP w 12 warunkach, analiza danych do porównania eksperymentalnego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 8"> Rysunek 8. Poniżej przedstawiono odsetek komórek wykazujących ekspresję GFP w komórkach z pasażu 5 dla każdego z 12 warunków elektroporacji. Maksymalny odsetek transfekcji wyniósł około 80% przy zastosowaniu impulsu o najwyższym napięciu z wykładniczym spadkiem (warunek 6) oraz 70% przy najsilniejszym z przetestowanych impulsów prostokątnych (warunek 12).
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="Analiza ekspresji GFP, wykres słupkowy; warunki eksperymentalne vs. procent komórek GFP-dodatnich." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 9"> Rysunek 9. W przypadku komórek poddanych 9 pasażom przed elektroporacją ogólny wzorzec procentowej wydajności transfekcji jest niemal identyczny, jednak z bardzo niewielkim spadkiem wartości tych procentów.
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający procent komórek GFP-dodatnich w 12 warunkach w analizie ekspresji genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 10"> Rysunek 10. Przedstawiono tutaj procentową zawartość komórek GFP w komórkach z pasażu 13, w których widoczny jest znaczny spadek procentu transfekcji w porównaniu z młodszymi komórkami. Najwyższe wartości procentowe transfekcji stanowiły około połowy wyników osiągniętych w przypadku młodszych komórek, co wykazuje znaczenie wykorzystania zdrowych komórek tak szybko, jak to możliwe po ich izolacji.

 <table border="1">
 <tbody >
 <tr >
 <td colspan="3">Warunki elektroporacji stosowane do transfekcji komórek MEF przy użyciu Gene Pulser MXcell</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Warunek (1-6) 
 impulsy o wykładniczym spadku, 
 wszystkie z 350 uF, 10ohm </td>
 <td >Napięcie (V)</td>
 <td > </td>
 </tr >
 <tr >
 <td >1</td>
 <td >20</td>
 <td > </td>
 </tr >
 <tr >
 <td >2</td>
 <td >250</td>
 <td > </td>
 </tr >
 <tr >
 <td >3</td>
 <td >300</td>
 <td > </td>
 </tr >
 <tr >
 <td >4</td>
 <td >326</td>
 <td > </td>
 </tr >
 <tr >
 <td >5</td>
 <td >350</td>
 <td > </td>
 </tr >
 <tr >
 <td >6</td>
 <td >376</td>
 <td > </td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Warunek (7-12) 
 impulsy prostokątne, 
 wszystkie z 20 uF, 10 ohm i 1 impulsem</td>
 <td >Napięcie (V)</td>
 <td >Czas trwania impulsu (ms)</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >7</td>
 <td >200</td>
 <td >10 </td>
 </tr >
 <tr >
 <td >8</td>
 <td >250</td>
 <td >10</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >9</td>
 <td >300</td>
 <td >10</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >10</td>
 <td >20</td>
 <td >20</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >1</td>
 <td >250</td>
 <td >20</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >12</td>
 <td >30</td>
 <td >20</td>
 </tr >
 </tbody >
 </table>

Autorzy są zatrudnieni przez Bio-Rad Laboratories, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule

Niniejszy artykuł wideo demonstruje, jak wykorzystać system elektroporacji MXcell do łatwego wyznaczenia optymalnych warunków elektroporacji dla MEF lub innych pierwotnych linii komórkowych. Format płytki 96-dołkowej pozwala na jednoczesne przeprowadzenie wielu powtórzeń warunków eksperymentalnych lub optymalizacyjnych, co może wyeliminować konieczność wykonywania wielu oddzielnych doświadczeń. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o tym, aby używać zdrowych komórek jak najkrócej po ich izolacji oraz stosować warunki elektroporacji dopasowane do użytego buforu do elektroporacji.

<table><tbody><tr><td>Bufor do elektroporacji Gene Pulser&amp;#174;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2676</td><td></td></tr><tr><td>System do elektroporacji Gene Pulser MXcell&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Komora na kuwety Gene Pulser MXcell&amp;#8482; ShockPod&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2673</td><td></td></tr><tr><td>System do elektroporacji Gene Pulser MXcell&amp;#8482; z komorą na kuwety ShockPod&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2674</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie systemu elektroporacji gene pulser mxcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Coraz bardziej oczywistym staje się fakt, że elektroporacja jest najskuteczniejszą metodą wprowadzania plazmidowego DNA lub siRNA do komórek pierwotnych. System elektroporacji Gene Pulser MXcell oraz bufor do elektroporacji Gene Pulser (Bio-Rad) zostały opracowane specjalnie w celu łatwej transfekcji kwasów nukleinowych do komórek ssaków oraz komórek trudnych do transfekcji, takich jak komórki pierwotne i macierzyste. Zaprezentujemy sposób przeprowadzenia prostego eksperymentu w celu szybkiego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji. Pokażemy, jak poddać kilka próbek różnym parametrom elektroporacji, tak aby eksperyment mógł być realizowany równocześnie z optymalizacją. Przedstawimy również, w jaki sposób optymalne warunki określone przy użyciu 96-dołkowych płytek do elektroporacji można zastosować w standardowych kuwetach do elektroporacji, co ułatwia przejście z płytek na kuwety przy zachowaniu tej samej wydajności elektroporacji. W filmie omówimy również kluczowe czynniki, które mogą wpłynąć na sukces lub niepowodzenie eksperymentów z elektroporacją.

Niniejsza procedura przedstawia sposób wykorzystania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell w celu szybkiego i łatwego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji dla embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) lub innych komórek pierwotnych. W towarzyszącym filmie omówiono również kwestie związane z rozwiązywaniem problemów.

Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Coraz bardziej oczywiste staje się, że elektroporacja jest najskuteczniejszą metodą wprowadzania plazmidowego DNA lub siRNA do komórek pierwotnych. Urządzenie Gene Pulser ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest określenie optymalnych warunków elektroporacji w celu transfekcji pierwotnych linii komórkowych z użyciem zarodkowych fibroblastów mysich (mfs). Przykładowo, komórki MF oraz wybrany kwas nukleinowy nanosi się do płytki do elektroporacji z 96 dołkami podłączonej do systemu komórkowego gene Pulser MX, co umożliwia przetestowanie wielu warunków elektroporacji w jednym cyklu. W eksperymentach optymalizacyjnych komórki są hodowane po elektroporacji, a następnie analizowane pod kątem wydajności transfekcji.Wykorzystując mikroskopię epifluorescencyjną oraz cytometrię przepływową, można następnie wybrać najwydajniejsze warunki elektroporacji do przyszłych transfekcji. Cześć, nazywam się Adam McCoy i jestem starszym naukowcem w dziale ekspresji genów w BioRad Laboratories. Dzisiaj przedstawimy procedurę łatwego identyfikowania optymalnych warunków elektroporacji do transfekcji pierwotnych linii komórkowych.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania ekspresji genów w tych komórkach. Dzisiaj będę używać trzech różnych numerów pasaży MEF, czyli embrionalnych fibroblastów mysich. Wykorzystuję hodowle o różnych numerach pasaży z dwóch powodów.Po pierwsze, pokażę, jak istotny jest stan zdrowia komórek. W przypadku pierwotnych linii komórkowych nawet kilka dodatkowych dni w hodowli może wpłynąć na wydajność transfekcji. Po drugie, chcę wykazać, że proces identyfikacji optymalnych warunków pozostaje taki sam, mimo że wydajność transfekcji spada w przypadku starszych komórek. Państwa eksperyment prawdopodobnie nie będzie obejmował komórek w różnym wieku.Tę samą procedurę można zastosować we własnym schemacie doświadczalnym. Jeśli chcą Państwo porównać ekspresję genów w komórkach kontrolnych i traktowanych, można najpierw ustalić optymalne warunki, a następnie przeprowadzić doświadczenie, korzystając z wyznaczonych parametrów. Można również przeprowadzić optymalizację i właściwe doświadczenie jednocześnie.Jak zaprezentuję dzisiaj, użyję plazmidu kodującego GFP, aby ocenić wydajność transfekcji za pomocą cytometrii przepływowej. Procedura elektroporacji byłaby jednak taka sama, nawet gdyby realizować inny cel, np. wprowadzanie irna i analizę ekspresji genów za pomocą real-time PCR. Zatem zacznijmy. embryonic fibroblasts mysie (MEFs) wykorzystane w tym protokole są komórkami adherentnymi. Dlatego pierwszym krokiem w pracy z tymi komórkami jest odklejenie ich od dna kolby zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli tkankowej z użyciem trypsynizacji. Po odklejeniu się komórek od ścianek kolby, zneutralizuj trypsynę pożywką zawierającą surowicę i zbierz komórki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.Po zebraniu odwiruj próbkę, aż komórki utworzą osad. Należy je przemyć, resuspendując w znanej objętości PBS. Po całkowitym resuspendowaniu policz komórki, pamiętając, że do eksperymentów z elektroporacji wymagane będzie stężenie 1 miliona komórek na mililitr.Oblicz odpowiednią liczbę komórek na podstawie zliczenia komórek i przenieś je do czystej probówki. Wirowarką odwirowuj próbki, aby uzyskać osad komórkowy. Następnie ostrożnie usuń nadsącz.Resuspenduj komórki w buforze do elektroporacji do stężenia 1 miliona komórek na mililitr i dodaj 20 mikrogramów na mililitr plazmidu. Płytki są podzielone na 96 studzienek z kolumnami oznaczonymi od 1 do 12 i rzędami od A do H; każdy zestaw czterech studzienek, czyli zestaw studzienek, dzieli parę elektrod, dzięki czemu komórki w tych studzienkach poddawane są temu samemu impulsowi. Na przykład komórki w studzienkach 1A, 1B, 1C i 1D są połączone elektrycznie w jednym zestawie studzienek i wszystkie otrzymają ten sam impuls.Kolejny zestaw czterech studni — 2A, 2B, 2C i 2D — otrzyma drugi impuls po uruchomieniu protokołu. Mimo że parametry mogą być takie same, płytka do elektroporacji z 96 studniami jest skonfigurowana tak, aby górna i dolna połowa płytki były rozdzielone. W związku z tym studnie 1E, 1F, 1G i 1H w dolnej części płytki otrzymały jeden impuls. Jest on jednak odrębny od impulsu otrzymanego przez studnie 1A, 1B, 1C i 1D w górnej części.W tym doświadczeniu wykorzystana zostanie tylko połowa płytki. Pierwsze trzy dołki każdego zestawu zawierają komórki w różnym wieku. Komórki w górnym rzędzie A zostały pasażowane pięciokrotnie.Komórki w rzędzie B przeszły dziewięć pasaży, a komórki w rzędzie C przeszły 13 pasaży. Rząd D zawiera jedynie bufor do elektroporacji przed przeprowadzeniem elektroporacji. Warto sprawdzić protokół, aby upewnić się, że ustawienia są poprawne.Niniejszy protokół zakłada podanie sześciu impulsów o charakterystyce wykładniczego zaniku, po których następuje sześć impulsów prostokątnych. Napięcie impulsów o wykładniczym zaniku wzrasta od 200 V do 450 V, przy czym we wszystkich zastosowano jedynie 350 µF. Wynika to z niskiej rezystancji stosowanego buforu do elektroporacji lub impulsu genowego.Impulsy prostokątne różnią się zarówno pod względem napięcia, jak i czasu trwania impulsu. Ustawienie pojemności urządzenia musi być dostosowane do przewodności mieszaniny do elektroporacji. W przypadku zastosowania buforu o wyższej rezystancji do elektroporacji, takiego jak DMEM, można zastosować ten sam zakres napięcia, ale z większą pojemnością, na przykład 950 µF dla impulsów o wykładniczym spadku.Jeśli optymalna pojemność buforu, którego używasz, nie jest znana, należy również zmieniać wartość pojemności w testowanych warunkach elektroporacji. Kolejnym krokiem jest naniesienie 150 µL mieszaniny komórek i plazmidu do każdej studzienki wykorzystywanej w tym eksperymencie. Czwarta studzienka z każdego zestawu studzienek jest wypełniana buforem do elektroporacji.Po załadowaniu płytki umieść ją w komorze na płytki MXL i zamknij pokrywę. Następnie naciśnij przycisk impulsu, aby przeprowadzić elektroporację komórek. Urządzenie dostarcza impulsy elektryczne sekwencyjnie do każdej studzienki, zgodnie z warunkami określonymi w wybranym protokole.Elektroporacja wszystkich komórek trwa kilka sekund. Po zakończeniu impulsu należy wyjąć płytkę z komory urządzenia. Komórki z każdej studzienki należy przenieść do naczynia hodowlanego zawierającego uprzednio ogrzaną pożywkę hodowlaną.Komórki te są hodowane w medium DMEM uzupełnionym o 10% FBS. Próbki kontrolne, które nie zostały poddane elektroporacji, pobiera się z pozostałej mieszaniny komórek i plazmidów, a następnie przenosi do naczyń hodowlanych zawierających uprzednio ogrzane medium o tym samym składzie, co w przypadku komórek elektroporowanych. Na koniec delikatnie zamieszać ruchem wirowym.Następnie opukaj płytkę, aby rozprowadzić komórki, przed umieszczeniem jej w inkubatorze na 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, aby przeanalizować wydajność transfekcji i zidentyfikować, które warunki elektroporacji są najlepsze dla danego eksperymentu. Po zidentyfikowaniu optymalnych warunków elektroporacji, do przyszłych eksperymentów można wybrać jedną z dwóch metod elektroporacji. Badacz może kontynuować elektroporację komórek na płytkach 96-dołkowych lub elektroporować komórki w kuwetach, przetwarzając jedną próbkę na raz.Kuwety mogą pomieścić tylko jedną próbkę jednocześnie i wymagają czterokrotności objętości potrzebnej dla jednej studzienki płytek 96-dołkowych, jednak pojedyncze kuwety są tańsze i łatwiejsze w użyciu, gdy potrzebna jest analiza niewielkiej liczby próbek. System Gene Pulse lub MX Cell został zaprojektowany w taki sposób, aby można było zastosować te same ustawienia elektroporacji zarówno w płytkach, jak i w kuwetach. Zamiast komory do płytek należy użyć modułu MXL Shock Pod do kuwet.Odłącz komorę na płytkę z tyłu urządzenia i podłącz moduł impulsowy (shock pod). Ponieważ moduł impulsowy dostarcza jedynie impuls zaprogramowany dla studzienek A, B, C, D 1, konieczny może być wybór innego programu. Aby wybrać wcześniej zapisany program, naciśnij przycisk home.Następnie wybierz opcję trzy: protokoły użytkownika. Jeśli znajdujesz się już w odpowiednim folderze użytkownika, naciśnij enter, aby wybrać protokoły użytkownika, a następnie przewiń w dół. Aby zaznaczyć właściwy program, naciśnij enter, aby go wybrać.Przyrząd jest teraz gotowy. Po wybraniu programu należy przygotować kuwety. Mieszaninę plazmidu i MEF przygotowuje się w ten sam sposób, co pokazano wcześniej.Napełnić każdą kasetę 0,4 cm taką samą objętością, jaka była użyta dla całego zestawu studzienek w płytkach 96-dołkowych. Ponieważ zestaw składa się z czterech studzienek, a na każdą studzienkę zużyto 150 µl buforu lub mieszaniny komórkowej, do każdej kasety należy wprowadzić 600 µl mieszaniny komórkowej z plazmidem.Następnie umieść probówkę w komorze urządzenia do elektroporacji i naciśnij przycisk impulsu, aby dostarczyć wstrząs elektryczny do komórek. Po elektroporacji postępuj zgodnie z metodą na płytkach: wymieszaj komórki, a następnie przenieś alikwoty na płytki hodowlane wypełnione uprzednio ogrzaną pożywką, przygotowując zestaw kontrolny. Do studzienek, które nie zostały poddane elektroporacji, dodaj odpowiednią objętość. Zakręć płytką i lekko postukaj.Następnie pozostawić komórki do regeneracji na 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla przed analizą wydajności transfekcji po przeprowadzeniu procedury i okresie rekonwalescencji komórek. Wydajność transfekcji analizować jakościowo za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej oraz ilościowo za pomocą cytometrii przepłyewej. Komórki, które zostały pomyślnie elektroporowane i aktualnie wykazują ekspresję genu GFP, wydają się zielone pod mikroskopem epifluorescencyjnym; tutaj przedstawiono typowy, pozytywny wynik. Obserwacja komórek w kontraście fazowym pozwala na wizualizację zarówno komórek transfekowanych, jak i nietransfekowanych.Przedstawiono tutaj komórki, które zostały poddane elektroporacji impulsem o najniższym napięciu wynoszącym 200 V. Komórki są w dużej mierze konfluentne ze względu na wysoką gęstość zasiewu. Ten sam obszar widzenia w świetle fluorescencji epifluorescencyjnej pokazuje, że liczba komórek wykazujących ekspresję markera GFP jest niewielka w porównaniu do odsetka komórek widocznych na poprzednim obrazie przy napięciu 250 V.Całkowita liczba żywych komórek widocznych w kontraście fazowym nieznacznie spada w świetle epi-fluorescencyjnym. Można zauważyć, że liczba komórek wykazujących ekspresję GFP wzrosła przy najwyższym przyłożonym napięciu wynoszącym 375 voltów. Widocznych jest mniej żywych komórek, jednak duży odsetek pozostałych komórek wykazuje ekspresję GFP.Wybór optymalnych warunków zależy od projektu eksperymentalnego. W niektórych badaniach optymalna może być największa liczba przetransfekowanych komórek. W innych badaniach najlepszy może być najwyższy procent transfekcji.Interesuje nas odsetek komórek wykazujących pozytywną ekspresję GFP w każdym z warunków oraz sposób, w jaki odsetki te zmieniają się wraz z wiekiem komórek. Cytometria przepływowa może dostarczyć ilościowych informacji na temat wyników transfekcji dla każdego z różnych warunków elektroporacji. Przedstawiono tutaj odsetek komórek GFP-dodatnich w danym pasażu.Pięć komórek. W każdej z 12 warunków elektroporacji maksymalny procent transfekcji wyniósł około 80% przy najwyższym napięciu w przypadku zaniku wykładniczego. Warunek impulsu sześć i 70 przy najsilniejszym badanym impulsie prostokątnym w warunku 12, w którym komórki zostały pasażowane dziewięć razy przed elektroporacją.Ogólny wzór procentowej wydajności transfekcji jest niemal identyczny, jednak z bardzo niewielkim spadkiem przedstawionych wartości. Poniżej znajdują się wartości procentowe komórek GFP w komórkach z 13. pasażu, które wykazują wyraźny spadek procentu transfekcji w stosunku do komórek młodszych. Najwyższe wartości procentowe transfekcji stanowiły około połowy tego, co osiągnięto w przypadku komórek młodszych, co demonstruje znaczenie wykorzystania zdrowych komórek jak najkrócej po ich izolacji.Właśnie pokazałem Państwu, jak wykorzystać system elektroporacji MXL do wyznaczenia optymalnych warunków elektroporacji dla MAP lub innych pierwotnych linii komórkowych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o użyciu zdrowych komórek tak szybko, jak to możliwe po ich izolacji, oraz o zastosowaniu warunków elektroporacji dopasowanych do buforu do elektroporacji. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

using-gene-pulser-mxcell-electroporation-system-to-transfect-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Korzystanie z systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell w celu transfekcji komórek pierwotnych z wysoką wydajnością

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Transfekcja genów poprzez elektroporację ulega poprawie około dwukrotnej, gdy orientacja pola elektrycznego ulega zmianie podczas aplikacji impulsu, podczas gdy żywotność komórek nie zostaje naruszona. Wzrost wydajności transfekcji genów jest spowodowany zwiększeniem powierzchni błony, która staje się kompetentna do wnikania DNA do wnętrza komórki.

Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsów elektrycznych poprawia transfer genów plazmidowych in vitro

Ten film demonstruje technikę elektroporacji, która wprowadza plazmidowe DNA kodujące białka fluorescencyjne do prekursorów pierwotnych komórek ziarnistych móżdżku myszy.

Dostarczanie genów in vitro za pośrednictwem elektroporacji: technika impulsów elektrycznych do wprowadzania fluorescencyjnych plazmidów kodujących białko reporterowe do hodowanych komórek

Elektroporacja nowej generacji to skuteczna metoda transfekcji ludzkich komórek Th17 z małymi RNA w celu zmiany ekspresji genów i zachowania komórek.

Transfekcja małego RNA w pierwotnych ludzkich komórkach Th17 za pomocą elektroporacji nowej generacji

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Opracowaliśmy protokół transfekcji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego za pomocą elektroporacji za pomocą genu kodującego czynnik pochodzenia pigmentu (PEDF) za pomocą systemu transpozonów Śpiącej Królewny (SB). Udaną transfekcję wykazano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj optymalizację elektroporacji pierwotnych linii komórkowych przy użyciu systemu Gene Pulser MXcell. Protokół umożliwia szybkie testowanie wielu warunków transfekcji mysich fibroblastów zarodkowych.

Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Przeglądaj więcej filmów