Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest określenie optymalnych warunków elektroporacji w celu transfekcji pierwotnych linii komórkowych z użyciem zarodkowych fibroblastów mysich (mfs). Przykładowo, komórki MF oraz wybrany kwas nukleinowy nanosi się do płytki do elektroporacji z 96 dołkami podłączonej do systemu komórkowego gene Pulser MX, co umożliwia przetestowanie wielu warunków elektroporacji w jednym cyklu. W eksperymentach optymalizacyjnych komórki są hodowane po elektroporacji, a następnie analizowane pod kątem wydajności transfekcji.

Wykorzystując mikroskopię epifluorescencyjną oraz cytometrię przepływową, można następnie wybrać najwydajniejsze warunki elektroporacji do przyszłych transfekcji. Cześć, nazywam się Adam McCoy i jestem starszym naukowcem w dziale ekspresji genów w BioRad Laboratories. Dzisiaj przedstawimy procedurę łatwego identyfikowania optymalnych warunków elektroporacji do transfekcji pierwotnych linii komórkowych.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania ekspresji genów w tych komórkach. Dzisiaj będę używać trzech różnych numerów pasaży MEF, czyli embrionalnych fibroblastów mysich. Wykorzystuję hodowle o różnych numerach pasaży z dwóch powodów.

Po pierwsze, pokażę, jak istotny jest stan zdrowia komórek. W przypadku pierwotnych linii komórkowych nawet kilka dodatkowych dni w hodowli może wpłynąć na wydajność transfekcji. Po drugie, chcę wykazać, że proces identyfikacji optymalnych warunków pozostaje taki sam, mimo że wydajność transfekcji spada w przypadku starszych komórek. Państwa eksperyment prawdopodobnie nie będzie obejmował komórek w różnym wieku.

Tę samą procedurę można zastosować we własnym schemacie doświadczalnym. Jeśli chcą Państwo porównać ekspresję genów w komórkach kontrolnych i traktowanych, można najpierw ustalić optymalne warunki, a następnie przeprowadzić doświadczenie, korzystając z wyznaczonych parametrów. Można również przeprowadzić optymalizację i właściwe doświadczenie jednocześnie.

Jak zaprezentuję dzisiaj, użyję plazmidu kodującego GFP, aby ocenić wydajność transfekcji za pomocą cytometrii przepływowej. Procedura elektroporacji byłaby jednak taka sama, nawet gdyby realizować inny cel, np. wprowadzanie irna i analizę ekspresji genów za pomocą real-time PCR. Zatem zacznijmy.

embryonic fibroblasts mysie (MEFs) wykorzystane w tym protokole są komórkami adherentnymi. Dlatego pierwszym krokiem w pracy z tymi komórkami jest odklejenie ich od dna kolby zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli tkankowej z użyciem trypsynizacji. Po odklejeniu się komórek od ścianek kolby, zneutralizuj trypsynę pożywką zawierającą surowicę i zbierz komórki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.

Po zebraniu odwiruj próbkę, aż komórki utworzą osad. Należy je przemyć, resuspendując w znanej objętości PBS. Po całkowitym resuspendowaniu policz komórki, pamiętając, że do eksperymentów z elektroporacji wymagane będzie stężenie 1 miliona komórek na mililitr.

Oblicz odpowiednią liczbę komórek na podstawie zliczenia komórek i przenieś je do czystej probówki. Wirowarką odwirowuj próbki, aby uzyskać osad komórkowy. Następnie ostrożnie usuń nadsącz.

Resuspenduj komórki w buforze do elektroporacji do stężenia 1 miliona komórek na mililitr i dodaj 20 mikrogramów na mililitr plazmidu. Płytki są podzielone na 96 studzienek z kolumnami oznaczonymi od 1 do 12 i rzędami od A do H; każdy zestaw czterech studzienek, czyli zestaw studzienek, dzieli parę elektrod, dzięki czemu komórki w tych studzienkach poddawane są temu samemu impulsowi. Na przykład komórki w studzienkach 1A, 1B, 1C i 1D są połączone elektrycznie w jednym zestawie studzienek i wszystkie otrzymają ten sam impuls.

Kolejny zestaw czterech studni — 2A, 2B, 2C i 2D — otrzyma drugi impuls po uruchomieniu protokołu. Mimo że parametry mogą być takie same, płytka do elektroporacji z 96 studniami jest skonfigurowana tak, aby górna i dolna połowa płytki były rozdzielone. W związku z tym studnie 1E, 1F, 1G i 1H w dolnej części płytki otrzymały jeden impuls. Jest on jednak odrębny od impulsu otrzymanego przez studnie 1A, 1B, 1C i 1D w górnej części.

W tym doświadczeniu wykorzystana zostanie tylko połowa płytki. Pierwsze trzy dołki każdego zestawu zawierają komórki w różnym wieku. Komórki w górnym rzędzie A zostały pasażowane pięciokrotnie.

Komórki w rzędzie B przeszły dziewięć pasaży, a komórki w rzędzie C przeszły 13 pasaży. Rząd D zawiera jedynie bufor do elektroporacji przed przeprowadzeniem elektroporacji. Warto sprawdzić protokół, aby upewnić się, że ustawienia są poprawne.

Niniejszy protokół zakłada podanie sześciu impulsów o charakterystyce wykładniczego zaniku, po których następuje sześć impulsów prostokątnych. Napięcie impulsów o wykładniczym zaniku wzrasta od 200 V do 450 V, przy czym we wszystkich zastosowano jedynie 350 µF. Wynika to z niskiej rezystancji stosowanego buforu do elektroporacji lub impulsu genowego.

Impulsy prostokątne różnią się zarówno pod względem napięcia, jak i czasu trwania impulsu. Ustawienie pojemności urządzenia musi być dostosowane do przewodności mieszaniny do elektroporacji. W przypadku zastosowania buforu o wyższej rezystancji do elektroporacji, takiego jak DMEM, można zastosować ten sam zakres napięcia, ale z większą pojemnością, na przykład 950 µF dla impulsów o wykładniczym spadku.

Jeśli optymalna pojemność buforu, którego używasz, nie jest znana, należy również zmieniać wartość pojemności w testowanych warunkach elektroporacji. Kolejnym krokiem jest naniesienie 150 µL mieszaniny komórek i plazmidu do każdej studzienki wykorzystywanej w tym eksperymencie. Czwarta studzienka z każdego zestawu studzienek jest wypełniana buforem do elektroporacji.

Po załadowaniu płytki umieść ją w komorze na płytki MXL i zamknij pokrywę. Następnie naciśnij przycisk impulsu, aby przeprowadzić elektroporację komórek. Urządzenie dostarcza impulsy elektryczne sekwencyjnie do każdej studzienki, zgodnie z warunkami określonymi w wybranym protokole.

Elektroporacja wszystkich komórek trwa kilka sekund. Po zakończeniu impulsu należy wyjąć płytkę z komory urządzenia. Komórki z każdej studzienki należy przenieść do naczynia hodowlanego zawierającego uprzednio ogrzaną pożywkę hodowlaną.

Komórki te są hodowane w medium DMEM uzupełnionym o 10% FBS. Próbki kontrolne, które nie zostały poddane elektroporacji, pobiera się z pozostałej mieszaniny komórek i plazmidów, a następnie przenosi do naczyń hodowlanych zawierających uprzednio ogrzane medium o tym samym składzie, co w przypadku komórek elektroporowanych. Na koniec delikatnie zamieszać ruchem wirowym.

Następnie opukaj płytkę, aby rozprowadzić komórki, przed umieszczeniem jej w inkubatorze na 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, aby przeanalizować wydajność transfekcji i zidentyfikować, które warunki elektroporacji są najlepsze dla danego eksperymentu. Po zidentyfikowaniu optymalnych warunków elektroporacji, do przyszłych eksperymentów można wybrać jedną z dwóch metod elektroporacji. Badacz może kontynuować elektroporację komórek na płytkach 96-dołkowych lub elektroporować komórki w kuwetach, przetwarzając jedną próbkę na raz.

Kuwety mogą pomieścić tylko jedną próbkę jednocześnie i wymagają czterokrotności objętości potrzebnej dla jednej studzienki płytek 96-dołkowych, jednak pojedyncze kuwety są tańsze i łatwiejsze w użyciu, gdy potrzebna jest analiza niewielkiej liczby próbek. System Gene Pulse lub MX Cell został zaprojektowany w taki sposób, aby można było zastosować te same ustawienia elektroporacji zarówno w płytkach, jak i w kuwetach. Zamiast komory do płytek należy użyć modułu MXL Shock Pod do kuwet.

Odłącz komorę na płytkę z tyłu urządzenia i podłącz moduł impulsowy (shock pod). Ponieważ moduł impulsowy dostarcza jedynie impuls zaprogramowany dla studzienek A, B, C, D 1, konieczny może być wybór innego programu. Aby wybrać wcześniej zapisany program, naciśnij przycisk home.

Następnie wybierz opcję trzy: protokoły użytkownika. Jeśli znajdujesz się już w odpowiednim folderze użytkownika, naciśnij enter, aby wybrać protokoły użytkownika, a następnie przewiń w dół. Aby zaznaczyć właściwy program, naciśnij enter, aby go wybrać.

Przyrząd jest teraz gotowy. Po wybraniu programu należy przygotować kuwety. Mieszaninę plazmidu i MEF przygotowuje się w ten sam sposób, co pokazano wcześniej.

Napełnić każdą kasetę 0,4 cm taką samą objętością, jaka była użyta dla całego zestawu studzienek w płytkach 96-dołkowych. Ponieważ zestaw składa się z czterech studzienek, a na każdą studzienkę zużyto 150 µl buforu lub mieszaniny komórkowej, do każdej kasety należy wprowadzić 600 µl mieszaniny komórkowej z plazmidem.

Następnie umieść probówkę w komorze urządzenia do elektroporacji i naciśnij przycisk impulsu, aby dostarczyć wstrząs elektryczny do komórek. Po elektroporacji postępuj zgodnie z metodą na płytkach: wymieszaj komórki, a następnie przenieś alikwoty na płytki hodowlane wypełnione uprzednio ogrzaną pożywką, przygotowując zestaw kontrolny. Do studzienek, które nie zostały poddane elektroporacji, dodaj odpowiednią objętość. Zakręć płytką i lekko postukaj.

Następnie pozostawić komórki do regeneracji na 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla przed analizą wydajności transfekcji po przeprowadzeniu procedury i okresie rekonwalescencji komórek. Wydajność transfekcji analizować jakościowo za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej oraz ilościowo za pomocą cytometrii przepłyewej. Komórki, które zostały pomyślnie elektroporowane i aktualnie wykazują ekspresję genu GFP, wydają się zielone pod mikroskopem epifluorescencyjnym; tutaj przedstawiono typowy, pozytywny wynik. Obserwacja komórek w kontraście fazowym pozwala na wizualizację zarówno komórek transfekowanych, jak i nietransfekowanych.

Przedstawiono tutaj komórki, które zostały poddane elektroporacji impulsem o najniższym napięciu wynoszącym 200 V. Komórki są w dużej mierze konfluentne ze względu na wysoką gęstość zasiewu. Ten sam obszar widzenia w świetle fluorescencji epifluorescencyjnej pokazuje, że liczba komórek wykazujących ekspresję markera GFP jest niewielka w porównaniu do odsetka komórek widocznych na poprzednim obrazie przy napięciu 250 V.

Całkowita liczba żywych komórek widocznych w kontraście fazowym nieznacznie spada w świetle epi-fluorescencyjnym. Można zauważyć, że liczba komórek wykazujących ekspresję GFP wzrosła przy najwyższym przyłożonym napięciu wynoszącym 375 voltów. Widocznych jest mniej żywych komórek, jednak duży odsetek pozostałych komórek wykazuje ekspresję GFP.

Wybór optymalnych warunków zależy od projektu eksperymentalnego. W niektórych badaniach optymalna może być największa liczba przetransfekowanych komórek. W innych badaniach najlepszy może być najwyższy procent transfekcji.

Interesuje nas odsetek komórek wykazujących pozytywną ekspresję GFP w każdym z warunków oraz sposób, w jaki odsetki te zmieniają się wraz z wiekiem komórek. Cytometria przepływowa może dostarczyć ilościowych informacji na temat wyników transfekcji dla każdego z różnych warunków elektroporacji. Przedstawiono tutaj odsetek komórek GFP-dodatnich w danym pasażu.

Pięć komórek. W każdej z 12 warunków elektroporacji maksymalny procent transfekcji wyniósł około 80% przy najwyższym napięciu w przypadku zaniku wykładniczego. Warunek impulsu sześć i 70 przy najsilniejszym badanym impulsie prostokątnym w warunku 12, w którym komórki zostały pasażowane dziewięć razy przed elektroporacją.

Ogólny wzór procentowej wydajności transfekcji jest niemal identyczny, jednak z bardzo niewielkim spadkiem przedstawionych wartości. Poniżej znajdują się wartości procentowe komórek GFP w komórkach z 13. pasażu, które wykazują wyraźny spadek procentu transfekcji w stosunku do komórek młodszych. Najwyższe wartości procentowe transfekcji stanowiły około połowy tego, co osiągnięto w przypadku komórek młodszych, co demonstruje znaczenie wykorzystania zdrowych komórek jak najkrócej po ich izolacji.

Właśnie pokazałem Państwu, jak wykorzystać system elektroporacji MXL do wyznaczenia optymalnych warunków elektroporacji dla MAP lub innych pierwotnych linii komórkowych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o użyciu zdrowych komórek tak szybko, jak to możliwe po ich izolacji, oraz o zastosowaniu warunków elektroporacji dopasowanych do buforu do elektroporacji. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.