Hodowla pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Cześć, nazywam się Mark Parker. Witamy w Laboratorium Eaton Peabody w Massachusetts Eye and Ear Infirmary w Bostonie w stanie Massachusetts. Dzisiaj przedstawimy protokół izolacji i pierwotnej hodowli narządu morskiego kti.

Protokół ten ma fundamentalne znaczenie w naszej pracy, ponieważ pozwala na analizę in vitro narządu niezbędnego do przesłuchania. Aby podkreślić użyteczność tego podejścia, zademonstrujemy również jedno z wielu zastosowań narządów w naszym laboratorium, elektroporację genów egzogennych do hodowanych eksplantatów. Chodźmy do pracy.

Zarys tej procedury jest następujący, nowonarodzone myszy zostaną pozbawione głów, a ich kości skroniowe zostaną usunięte za pomocą sekcji. Następnie ślimak zostanie odizolowany od kości skroniowej za pomocą sekcji. Błędnik kostny ślimaka zostanie następnie otwarty za pomocą kleszczy, a więzadło spiralne zostanie usunięte z wewnętrznej modyfikacji ślimaka.

Na koniec więzadło spiralne zostanie oddzielone od narządu corde za pomocą kleszczy, można zobaczyć półprzezroczyste róże komórek rzęsatych biegnące wzdłuż narządu kti. Część błony RISE, która została pęknięta podczas usuwania więzadła spiralnego, jest widoczna wzdłuż boku modułu. Przykładem użyteczności tej procedury jest hodowla eksplantatów narządów przez 24 godziny, a następnie elektroporacja egzogennego fluorescencyjnego genu reporterowego.

Początkowe etapy tej procedury obejmują przygotowanie płytek hodowlanych. Umieść wysterylizowane szklane szkiełko nakrywkowe, które było przechowywane w 70% etanolu, w dwóch dołkach wstępnie wysterylizowanego naczynia do hodowli czteropierścieniowej. Użycie tylko dwóch z czterech studzienek ograniczy czas, w którym kultury pozostają poza pojemnikiem inkubatora.

Szkiełka nakrywkowe z roztworem składającym się jeden do jednego z poli-litrowej ornityny i lamininy. Uzupełniony 20% płodową surowicą bydlęcą, umieścił szalkę hodowlaną w większym 10-centymetrowym naczyniu, aby ułatwić jej przenoszenie, a następnie inkubował przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec sterylizuj na gorąco, czyli narzędzia do cięcia w inkubatorze o temperaturze 150 stopni Celsjusza przez noc.

Wysterylizuj okap preparacyjny z przepływem dodatnim, włączając światło UV na 20 minut przed rozpoczęciem sekcji. Wysterylizuj przestrzeń roboczą w okapie preparacyjnym, spryskując wszystkie powierzchnie 70% etanolem. Umieść głowę ściętego szczeniaka myszy na szalce Petriego zawierającej 70% etanolu, a następnie usuń naskórek za pomocą ostrza skalpela.

Otwórz czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą ostrza skalpela, a następnie przetnij mózg na pół. Zachowaj rozpieszczone przodomózgowie do dalszej sekcji. Usuń przodomózgowie, móżdżek i pień mózgu za pomocą sekcji.

Zwróć uwagę na położenie kości skroniowej w kształcie parametalu po dolnej bocznej stronie czaszki. Przenieś kości TAL do trzymilimetrowego naczynia zawierającego sterylny roztwór soli w kulkach motków. Pozostałą sekcję należy przeprowadzić pod mikroskopem preparacyjnym.

Usuń otaczającą tkankę z kości skroniowej. Zlokalizuj ślimak w kształcie muszli i usuń go z układu przedsionkowego za pomocą kleszczy. Na tym etapie rozwoju błędnik kostny nie jest całkowicie zwapniały i łatwo go wypreparować.

Usuń błędnik kostny ślimaka, ostrożnie oddzielając, zaczynając od podstawnego końca i przesuwając się wierzchołkowo. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń więzadło spiralne i przyczepiony nabłonek czuciowy z mody, zabezpieczając je w obszarze haczyka podstawy za pomocą kleszczy i rozwijając. Poruszając się aplikacyjnie, zaczynając od podstawy, usuń więzadło spiralne z nabłonka czuciowego za pomocą cienkich kleszczyków o numerze 55.

W niektórych naszych eksperymentach pożądane jest usunięcie spiralnego rąbka z nabłonka czuciowego. W tej procedurze mikroizolatu narząd cordi jest izolowany od rąbka spiralnego za pomocą dwóch strzykawek insulinowych o pojemności pół cc jako kleszczyków. Najpierw obszar haczyka kordu narządu jest usuwany za pomocą strzykawek insulinowych.

Następnie rąbek spiralny jest oddzielany od rzędu wewnętrznych komórek rzęsatych, zaczynając od wierzchołka i biegnąc zasadniczo przez cały narząd Cortego z dołączonym spiralnym rąbkiem. Mikroizolowany nabłonek czuciowy lub mikroizolowany rąbek spiralny można hodować w następujący sposób, usunąć roztwór powlekający z dołków hodowlanych i zastąpić go 130 mikrolitrami pożywki hodowlanej zawierającej 10% transfer surowicy, wypreparowany narząd kordu do szkiełka nakrywkowego z powlekanego szkła w kulturze. Cóż, odkryliśmy, że następujące techniki pomagają zapewnić, że narząd korti nie unosi się w pożywce hodowlanej, ale pozostaje przymocowany do szkiełka nakrywkowego.

Pierwsza warstwa, szklana pokrywa ślizga się zgodnie z opisem. Po drugie, usuń pożywkę, aby przymocować eksplan do powlekanego naczynia. Zapewni to kontakt między naczynią hodowlaną a planem X.

Po trzecie, ustaw explan tak, aby rzęski komórek rzęsatych były skierowane do góry. Ta orientacja ułatwi przestrzeganie planu z kulturą fermentacyjną. Na koniec dodaj 130 mikrolitrów pożywki do hodowli surowicy za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, ostrożnie kapiąc dwie krople na powierzchnię akordu narządowego, a następnie powoli dodając pozostałą objętość z boku studzienki, ostrożnie przenieś eksplan do inkubatora, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla.

Kultury te można utrzymywać przez siedem do 10 dni. Istnieje wiele zastosowań dla izolowanego narządu rdzenia T. Niektóre przykłady obejmują analizę ekspresji genów za pomocą hybrydyzacji R-T-P-C-R lub NC two, hodowlę narządów korowych ze spiralnymi komórkami zwojowymi lub egzogennymi komórkami macierzystymi lub analizę in vitro śmierci komórek rzęsatych. Aby zademonstrować użyteczność tej procedury, pokażemy Państwu jedną technikę powszechnie stosowaną w naszym laboratorium do ekspresji genów egzogennych w kulturach explan.

Na potrzeby tej demonstracji wyizolowanym narządem corti będzie parada elektroniczna z wektorem ekspresji, który konstytutywnie wyraża gen czerwonego reportera DS. Po elektroporacji kultury będą inkubowane z odczynnikiem do transfekcji z kilkoma genami sześcioma przez 24 godziny w celu usprawnienia procedury transfekcji. Korzystając z tego systemu, transfekowane komórki będą wykazywać cytoplazmatyczną czerwoną fluorescencję w ciągu 24 godzin.

Najpierw przygotuj stosunek trzy do dwóch odczynnika do transfekcji genu szóstego FU do docelowego DNA w trzymililitrowej probówce z polistyrenu o okrągłym dnie. W okapie z przepływem laminarnym usuń pożywkę hodowlaną z narządu ogrodniczego. Dodaj 130 mikrolitrów wody przez jedną minutę, a następnie usuń za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Następnie dodaj 30 mikrolitrów czerwonego plazmidu reporterowego DS, który jest przechowywany w roztworze podstawowym dwóch miligramów plazmidowego DNA na mililitr wody. Do elektroporacji używamy genu BioRad Pulser Excel do generowania impulsu elektrycznego. Elektrody zostały dostosowane przez nasz warsztat mechaniczny do naszych celów, elektrody składają się z gołego drutu, który jest wygięty pod kątem 90 stopni i został zaciśnięty w kształt łopatki.

Przesuń elektrody elektro za pomocą mikromanipulatora tak, aby anoda i katoda znajdowały się po obu stronach kultury. Wygeneruj 10 ciągów impulsów składających się z 27 woltów i 30 milisekund czasu trwania, aby elektrooczyszczać gen reporterowy do kultury eksplanowej narządu. Następnie odczekaj pięć minut.

Następnie dodaj 130 mikrolitrów roztworu DNA genu szóstego FU do explanu, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia dodaj dwa mililitry surowicy do hodowli, pożywkę do każdej płytki. Kultury explan można utrzymywać przez sześć lub więcej dni po 24 godzinach.

Transfekowane komórki można oglądać za pomocą filtra SI trzy w mikroskopie fluorescencyjnym epi. Właśnie pokazaliśmy Ci metodę izolacji i pierwotnej hodowli narządu Corte. Metoda ta działa u myszy w wieku od 16 dnia embrionalnego do dnia pourodzeniowego, w którym to momencie ślimak staje się wystarczająco zwapniały, co sprawia, że sekcja jest uciążliwa.

Ponadto zademonstrowaliśmy metodę ekspresji genów egzogennych w hodowanym narządzie corde. Jest to przykład jednego z rodzajów eksperymentu, który można przeprowadzić na hodowanym eksplanie. Bez wątpienia istnieje wiele zastosowań tej techniki.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.