Name: Protokół produkcji tetrameru KLRG1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj protokół produkcji tetrameru KLRG1 w celu analizy ligandów receptora immunologicznego. Metoda obejmuje ekspresję białka w bakteriach, indukcję IPTG oraz puryfikację chromatograficzną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Naidenko za pomoc w optymalizacji warunków refoldingu. Praca ta była wspierana przez grant badawczy NIH AI58181 przyznany Laurentowi Brossayowi. Cindy Banh otrzymuje wsparcie z NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi i Cindy Banh wniosły równy wkład w tę pracę.

Przygotowanie ciałek inkluzyjnych
<ol>
 <li>Zaszczep 4 kolby o pojemności 500 ml z pożywką TB, zawierającą każda 50 μg/ml karbenicyliny i chloramfenikolu, nocną kulturą bakterii eksponujących konstrukt plazmidowy KLRG1. Gdy OD osiągnie 0,6 Å przy 600 nm, indukuj ekspresję poprzez dodanie 0,4 M IPTG i inkubuj kulturę przez kolejne 4 godziny przy wytrząsaniu w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Resuspenduj zebrane komórki w buforze do resuspensji pH=8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W/V) sacharozy, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Uwaga: osady można zamrozić na tym etapie.</li>
 <li>Połącz nie więcej niż 60 ml resuspensji bakteryjnych w zlewce polipropylenowej. W razie potrzeby uzupełnij objętość do 60 ml buforem TE pH 8,0 i mieszaj mieszaninę z połową maksymalnej prędkości.</li>
 <li>Do mieszanej zawiesiny dodawaj kroplami: lizozym (stężenie końcowe=1 mg/ml), MgCl2 (stężenie końcowe=5 mM), 2 mg DNAse I w 50% glicerolu zawierającym 75 mM NaCl, Triton-X100 (stężenie końcowe=1%), DTT (stężenie końcowe=10 mM).</li>
 <li>Sonicuj roztwór na lodzie przez 1,5 min i odwirowuj lizaty przy 5 000 RPM przez 10 min w temperaturze 4°C.
 <ol class="lalpha">
 <li>Zlej nadsącz.</li>
 <li>Dodaj 15 ml buforu do płukania pH=8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).</li>
 <li>Na lodzie sonicuj roztwór przez 1,5 min, aż osad zostanie całkowicie zresuspendowany.</li>
 <li>Odwirowuj próbki przy 5 000 RPM przez 10 min w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Powtórz płukanie 5 razy.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Powtórz krok 5b, używając buforu do płukania bez Triton X-100, odwirowuj i zresuspenduj w 4 ml buforu TE.</li>
 <li>Odważ mokrą masę zawiesiny ciałek inkluzyjnych i przechowuj w buforze TE w stężeniu od 30 do 100 mg/ml.</li>
</ol>
Refolding białka KLRG1
<ol>
 <li>Przygotować 1 L buforu do refoldingu o pH=8,0 (0,4 M Arginina-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 tabletki inhibitora proteaz bez EDTA, 5 mM GSH oraz 0,5 mM GSSG) i schłodzić do 4°C podczas mieszania.</li>
 <li>Przygotować ciała inkluzyjne do wstrzyknięcia do mieszaniny fałdowania: optymalne jest wykonanie od 5 do 10 wstrzyknięć, z których każde ma stężenie 0,25–0,5 μM, tak aby końcowe stężenie białka wyniosło 2–3 μM.
 <ol class="lalpha">
 <li>Rozpuścić zawiesinę 50 mg ciał inkluzyjnych w 7 M GnHCl z dodatkiem 10 mM β-merkaptoetanolu.</li>
 <li>Inkubować mieszaninę ciał inkluzyjnych/GnHCl w temperaturze 37°C przez 30–40 min, mieszając w wortexie co 5 min w celu zapewnienia całkowitego rozpuszczenia (zawiesina stanie się klarowna po pełnym rozpuszczeniu).</li>
 <li>Wirować z maksymalną prędkością przez 30 min w mikrocentryfudze w temperaturze 4°C i przenieść nadsącz do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Należy unikać przenoszenia drobnego, czarnawego osadu.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Dopełnić objętość buforem do wstrzykiwania (3 M GnHCl, 10 mM NaAcetate, pH 4,2, 10 mM EDTA).</li>
 <li>Wstrzykiwać 1 ml rozcieńczonych ciał inkluzyjnych co godzinę. Podczas wstrzykiwania mieszać z dużą prędkością, dodając 1 ml rozcieńczonych ciał inkluzyjnych kroplami w odstępach 2 sekund między kolejnymi kroplami. Po zakończeniu wstrzykiwania mieszać z małą prędkością.</li>
 <li>Kontynuować mieszanie z małą prędkością w temperaturze 4°C przez noc.</li>
</ol>
Stężenie w reakcjach refoldingu
<ol>
 <li>Zgodnie z protokołem firmy Millipore, zagęszczyć 1 L uprzednio przefiltrowanego (filtrowanego przez membranę 0.22 μm) roztworu z reakcji refoldingu do objętości ~10 ml, używając komory mieszanej Amicon Stirred Cell oraz membrany ultrafiltracyjnej YM10 NMWL 10K (Millipore).</li>
 <li>Zagęszczyć do objętości ≤2 ml, używając Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).</li>
</ol>
Oczyszczanie tetrameru KLRG1
<ol>
 <li>Przygotować układ AKTA FPLC w temperaturze 4°C zgodnie z instrukcjami GE Healthcare.</li>
 <li>Oczyścić formę monomeru KLRG1 za pomocą chromatografii wykluczania z wykorzystaniem kolumny wysokorozdzielczej Sephacryl S-200 16/60 (GE Healthcare) w buforze 20 mM HEPES i 150 mM NaCl. (Patrz Rycina 1).</li>
 <li>Skoncentrować do objętości 1 ml przy użyciu Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).</li>
 <li>Wykorzystać enzym BirA zgodnie z protokołem Avidity s w celu biotinylacji monomeru KLRG1.</li>
 <li>Wolną biotynę usunąć za pomocą chromatografii wykluczania, analogicznie jak w punkcie 2.</li>
 <li>Cząsteczkę KLRG1 tetrameryzować poprzez zmieszanie monomeru KLRG1 z 4-krotnym nadmiarem molowym streptawidyny sprzężonej z PE (BD Biosciences).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Wykres chromatograficzny; piki rozdziału związków; chemia analityczna; oznaczone czasy retencji." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"></a> Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki pozytywne z chromatografii wykluczania żelowego AKTA FPLC dla refoldowanego KLRG1. Wykres przedstawia rozdział form monomeru (83,52 ml), dimeru (56,36 ml) oraz multimeru (36,26 ml) refoldowanego KLRG1. Pik przy 94,25 ml odpowiada wymianie buforu.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

W niniejszym protokole pokazano, jak przeprowadzić oczyszczanie, biotynylację i tetrameryzację białka KLRG1. Tetramer KLRG1 może być wykorzystany do znakowania ligandów KLRG1 za pomocą cytometrii przepłyewej. Chociaż warunki refoldingu będą musiały zostać sprawdzone empirycznie dla każdego białka, inne lektyny typu C mogą zostać poddane tetrameryzacji przy użyciu podobnego protokołu. Wykorzystując ztetrameryzowane białka jako sondy, potencjalnie można zidentyfikować ligandy dla sierocych receptorów lektynowych typu C.

<table><tbody><tr><td>Enzym BirA i bufor</td><td>Zestaw do biotynylacji</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z kompletnym inhibitorem proteaz Mini, bez EDTA</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>lub równoważnik</td></tr><tr><td>Komora mieszana Amicon</td><td>Sprzęt</td><td>EMD Millipore</td><td>Model #8400</td><td>lub równoważnik</td></tr><tr><td>Membrana ultrafiltracyjna YM10 NMWL 10K</td><td>Przybornik do filtracji</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator 15 ml YM10</td><td>Przybornik do filtracji</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Sprzęt</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wysokorozdzielcza Sephacryl S-200 16/60</td><td>Sprzęt</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Strepawidyna PE</td><td>Odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>lub równoważnik</td></tr></tbody></table>

protokół produkcji tetrameru klrg1

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Receptor podobny do lektyny komórek zabójczych G1 (KLRG1) jest inhibitorycznym receptorem glikoproteinowym, białkiem transbłonowym typu II, należącym do superrodziny lektyn typu C. KLRG1 występuje zarówno w formie monomeru, jak i homodimeru połączonego mostkami dwusiarczkowymi. Ten wysoce konserwatywny receptor znajduje się na najbardziej dojrzałych i niedawno aktywowanych komórkach NK, a także na podzbiorze efektorowych/pamięciowych limfocytów T.
Wykorzystując tetramer KLRG1 oraz inne metody, zidentyfikowano kadheryny E, N i R jako ligandy KLRG1. Te zależne od Ca2+ cząsteczki adhezyjne międzykomórkowe składają się z domeny zewnątrzkomórkowej zawierającej pięć powtórzeń kadherynowych odpowiedzialnych za interakcje międzykomórkowe, domeny transbłonowej oraz domeny cytoplazmatycznej połączonej z cytoszkieletem aktynowym.
Wytworzenie tetrameru KLRG1 było niezbędne do zidentyfikowania ligandów KLRG1. Tetramer KLRG1 stanowi również unikalne narzędzie pozwalające wyjaśnić rolę, jaką kadheryny i KLRG1 odgrywają w regulacji odpowiedzi odpornościowej oraz integralności tkanek.

Niniejszy protokół opisuje produkcję tetrameru KLRG1, który jest potężnym narzędziem do analizy ligandów KLRG1.

Protokół produkcji tetrameru KLRG1

Receptor lektynowy typu G1 dla komórek zabójczych (KLRG1) jest inhibitorycznym receptorem glikoproteinowym z błony komórkowej typu II, należącym do superrodziny lektyn typu C. ...

Cześć, jestem Stephanie Resi z laboratorium Lauren Parce w Departamencie Mikrobiologii Molekularnej i Immunologii na Uniwersytecie Brown. Dzisiaj przedstawimy procedurę generowania tetramerów KLRG1. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania koherentnych oddziaływań KLRG1.Zacznijmy. Najpierw zaszczep cztery kolby o pojemności 500 ml z buforem TB zawierającym odpowiednie antybiotyki bakteriami wykazującymi konstrukt plazmidu K LRG one i hoduj w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Gdy OD osiągnie 0,6 przy 600 nm, indukuj ekspresję poprzez promotor T7 poprzez dodanie 0,4 M IPTG i inkubuj kulturę przez kolejne cztery godziny, wytrząsając w temperaturze 37 °C. Po czterogodzinnej inkubacji przenieś bakterie do probówek do wirowania i odwiruj kultury przez 20 minut przy 3000 RPM w temperaturze 4 °C.W razie potrzeby osady można w tym momencie zamrozić w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Resuspenduj zebrane komórki w 30 ml buforu do resuspensji. Następnie połącz resuspensje bakteryjne do objętości 60 ml w zlewce z polipropylenu.W razie potrzeby uzupełnić objętość całkowitą do 60 milliliters za pomocą dodatkowego buforu TE o pH 8 i mieszać mieszaninę z połową prędkości na mieszalniku magnetycznym z podgrzewaniem, podczas gdy połączona zawiesina Resus jest mieszana, dodając do niej następujące roztwory: kroplami do mieszaniny lizozym, chlorek magnezu, DNase I, TRITON X 100, a na koniec DTT.Przenieść roztwór do probówek do ultrawirówki, korzystając z sonikatora z przetwornikiem ultradźwiękowym przy amplitudzie 30%. Sonicować roztwór w lodzie przez 1,5 minuty, a następnie wirować lizat z prędkością 5 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odlać nadsącz i dodać 15 mililitrów buforu płuczącego. Powtórzyć sonikację w ten sam sposób, aż osad zostanie całkowicie resuspendowany, i ponownie przeprowadzić wirowanie; powtórzyć etapy płukania, sonikacji i wirowania pięciokrotnie.Na koniec resuspenduj osad, używając buforu do płukania, który nie zawiera Triton X 100. Ponownie odwiruj próbkę, a następnie resuspenduj w czterech mililitrach buforu TE. Otrzymany materiał to ciała inkluzyjne.Oznacz ilość ciałek inkluzyjnych metodą masy mokrej. Zawiesinę ciałek inkluzyjnych można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w roztworach buforowych o stężeniu od 30 do 100 mg/ml. Po przygotowaniu ciałek inkluzyjnych można przystąpić do refoldingu.Procedurę refolding rozpoczęto od przygotowania świeżej, jednolitrowej butelki buforu do refoldingu, którą następnie mieszano przy niskich obrotach w temperaturze 4 °C w celu schłodzenia. Następnie należy przygotować siedem porcji ciał inkluzyjnych do wstrzyknięcia do buforu do refoldingu. W pierwszej kolejności należy rozpuścić zapas zawiesiny ciał inkluzyjnych w probówce do mikrocentryfugi, osiągając końcową objętość 1,4 ml w 7 M chlorku guanidyny oraz 10 mM β-merkaptoetanolu, w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 do 40 minut.Wierzchołkuj co pięć minut. Przez przejrzystość zawiesiny poznasz moment zakończenia procesu topnienia.Odwiruj roztopioną mieszaninę z maksymalną prędkością przez 30 minut w mikrocentryfudze w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Następnie, uważając, aby nie pobrać niewielkiego, czarnawego osadu, przenieś nadsącz do probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów.Uzupełnij objętość do 7 mL buforem do wstrzykiwania. Najpierw zwiększ prędkość mieszania mieszaniny do fałdowania do wysokiej. Następnie dodaj 1 mL rozcieńczonych ciał inkluzyjnych.Dodawać po kropli, zachowując dokładnie dwusekundowy odstęp między każdą kroplą. Wstrzykiwać po 1 ml rozcieńczonych ciał inkluzyjnych, zachowując godzinną przerwę między kolejnymi iniekcjami. Przywrócić niską prędkość mieszania.Kontynuuj mieszanie przy niskich obrotach w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Białka będą wówczas gotowe do zagęszczenia i oczyszczania. Aby rozpocząć zagęszczanie refoldowanych tetramerów KLRG one.Najpierw przeprowadź wstępną filtrację mieszaniny reakcyjnej za pomocą filtra o porach 22 µm. Następnie zagęść mieszaninę z jednej litry do około 10 mL, używając komory z mieszadłem Millipore Amon oraz membrany do ultrafiltracji o nominalnym progu odcięcia masy cząsteczkowej 10 kDa, zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, używając membrany do ultrafiltracji Millipore o progu odcięcia masy cząsteczkowej 10 kDa, zagęść próbkę dalej do objętości mniejszej lub równej 2 mL.Skonfiguruj system chromatograficzny zgodnie z instrukcjami producenta. W naszej pracy wykorzystujemy system szybkiej chromatografii cieczowej białek GE healthcare ACTA w temperaturze 4°C z użyciem kolumny o wysokiej rozdzielczości. Oczyszczamy formę monomeryczną białka K lrg w buforze 20 mM HEPES i 150 mM NaCl za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego.Wstrzykiwana objętość powinna stanowić mniej niż 2% całkowitej objętości żelu w kolumnie. Następnie, używając membrany do ultrafiltracji Millipore z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 10 kilodalton, należy dalej zagęścić monomer KLG 1 do objętości końcowej jednego mililitra zgodnie z instrukcjami producenta. Wolną biotynę należy usunąć poprzez oczyszczanie w sposób opisany wcześniej, wykorzystując chromatografię wykluczania cząsteczkowego w celu otrzymania tetrameru.Wymieszać monomery KL LRG one z czterokrotnie nadmiarową ilością molową tetramerów streptawidyny sprzężonej z FICO rine, które są teraz dostępne do znakowania ligandów receptorowych. Wykres ten przedstawia pozytywny wynik rozdziału refoldowanych białek K lrg one przy użyciu chromatografii wykluczania z lewej do prawej strony. Piki ilustrują formy multimeru, dimeru i monomeru białka K LRG one.Szczyt po prawej stronie reprezentuje wymianę buforu. Choć warunki refoldingu muszą być testowane empirycznie dla każdego białka, inne receptory lektynowe typu C powinny ulegać tetrameryzacji przy użyciu podobnego protokołu, co umożliwi potencjalną identyfikację innych ligandów. Właśnie pokazaliśmy, jak wygenerować tetramer KLRG podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby pamiętać o sprawdzeniu poziomów indukcji oraz o ścisłym przestrzeganiu warunków refoldingu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

a-protocol-for-the-production-of-klrg1-tetramer

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Kindliny mają fundamentalne znaczenie dla adhezji komórek poprzez integryny, ale badania nad nimi były utrudnione z powodu trudności napotkanych podczas ich rekombinacyjnej ekspresji u gospodarzy bakteryjnych. Opisujemy tutaj metody ich efektywnej produkcji w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem.

Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Białko związane z CRISPR, Cpf1, może być prowadzone przez specjalnie zaprojektowane RNA CRISPR (crRNA) do rozszczepiania dwuniciowego DNA w pożądanych miejscach, generując lepkie końce. Na podstawie tej cechy ustalono standard składania DNA (C-Brick), a protokół szczegółowo opisujący jego użycie opisano tutaj.

Protokoły standardowego montażu DNA C-Brick przy użyciu Cpf1

Tutaj prezentujemy klonowanie gRNA (STAgR), metodę łatwego multipleksowania wektorów gRNA dla podejść CRISPR/Cas9. STAgR sprawia, że multipleksowanie gRNA jest proste, wydajne i konfigurowalne.

Konfigurowalny protokół klonowania gRNA ze składaniem ciągów (STAgR)

Ten protokół opisuje, jak ustanowić system reporterowy, który może być używany do identyfikacji i ilościowego określania interakcji receptor-ligand.

System BW Reporter do badania oddziaływań receptor-ligand

Prezentowany tutaj jest protokół do wykonywania transferu energii rezonansu Förstera dla pojedynczej cząsteczki w celu zbadania rozdzielczości HJ. Dwukolorowe wzbudzenie przemienne służy do wyznaczania stałych dysocjacji. Jednokolorowy smFRET poklatkowy jest następnie stosowany w testach rozszczepienia w czasie rzeczywistym w celu uzyskania rozkładu czasu przebywania przed rozdzielczością HJ.

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.

Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Badanie to ustanowiło metodę wykorzystującą rozszerzenie kodu genetycznego do skutecznej inkorporacji laktylizyny (Klac) w określonych miejscach ludzkiej enolazy-1 (hENO1) i superfolderu GFP (sfGFP) w komórkach Escherichia coli i ssaków.

Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków

Poznaj protokół produkcji tetrameru KLRG1 w celu analizy ligandów receptora immunologicznego. Metoda obejmuje ekspresję białka w bakteriach, indukcję IPTG oraz puryfikację chromatograficzną.

Protokół produkcji tetrameru KLRG1

Przeglądaj więcej filmów