Name: Pojedyncze nagrania Sensillum u owadów Drosophila melanogaster i Anopheles gambiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Poznaj technikę pojedynczych nagrań sensillum do pomiaru aktywności neuronów węchowych u Drosophila melanogaster i Anopheles gambiae. Metoda ta pozwala badać elektrofizjologiczne odpowiedzi na bodźce zapachowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Rozcieńczenia zapachów
<ol>
<li>Większość substancji zapachowych rozpuszcza się w oleju parafinowym. Jednak w przypadku niektórych zapachów jako alternatywne rozpuszczalniki można zastosować DMSO lub etanol. W szklanych fiolkach należy przygotować odpowiednie rozcieńczenia (np. 1:10 obj.:obj.; v:v) z czystych substancji zapachowych. Większość rozcieńczeń zapachów jest stabilna w temperaturze pokojowej, jednak w przypadku związków wysoce lotnych zaleca się przygotowywanie roztworów roboczych raz w tygodniu. Każdy sensylium reaguje na inne zapachy w różnym zakresie stężeń. W przypadku Drosophila przydatna tabela z odpowiednimi stężeniami dla konkretnych sensyliów znajduje się w 6, 7. 
W eksperymencie wideo jako kontrolę rozpuszczalnika stosujemy olej parafinowy, a jako substancje zapachowe odpowiednio dla Drosophila octan metylu (10-6 v:v w oleju parafinowym) oraz dla Anopheles 1-okten-3-ol (10-7 v:v w oleju parafinowym).</li>
<li>Za pomocą nożyczek należy pociąć papier chromatograficzny na paski o wymiarach 3 mm x 5 cm, aby mieściły się one w pipetach Pasteura.</li>
<li>Należy nanieść pipetą 30 μL wybranego zapachu na pasek papieru filtracyjnego i włożyć go do szklanej pipety. Odciąć ok. 3 cm rurki doprowadzającej powietrze i włożyć ją w otwarty koniec pipety, zamykając go złączką. Złączka służy do uszczelnienia pipety, która zostanie następnie podłączona do rurki doprowadzającej powietrze z pompy w momencie podawania zapachu podczas eksperymentu.</li>
</ol>
2. System podawania zapachów
<ol>
<li>Za pomocą małego wiertła odetnij fragment plastikowej pipety serologicznej o pojemności 10 mL (np. na poziomie oznaczenia 4 mL) i wykonaj dwa otwory (np. na poziomach -1,5 mL i -0,5 mL), które posłużą do zamocowania pipet zawierających zapachy. Włóż końcówkę pipety 200 μL do złączki rurkowej, a następnie wprowadź złączkę do tępego końca pipety 10 mL. Pipeta ta będzie pełnić funkcję elementu systemu dozowania substancji zapachowych.</li>
<li>Zamocuj pipetę na statywie magnetycznym za pomocą uchwytu do pipet i ustaw ją w pobliżu mikroskopu.</li>
</ol>
3. Zaostrzanie elektrod
<ol>
<li>Aby zaostrzyć elektrody, należy przygotować 0,5 M roztwór wodorotlenku potasu (KOH) i przefiltrować go w celu usunięcia drobnych cząstek (np. używając filtra 45 μm). Należy wziąć strzykawkę 20 mL i za pomocą igły wykonać mały otwór (o średnicy ok. 2 mm) w ściance blisko końcówki (ok. 1 cm od końcówki), do którego zostanie włożony przewód elektryczny (Rycina 1A).</li>
<li>Strzykawkę należy napełnić 0,5 M KOH i zamocować ją na statywie pod mikroskopem tak, aby końcówka znajdowała się w polu widzenia (Rycina 1B, C). Do małego otworu w ściance strzykawki należy włożyć przewód elektryczny (Rycina 1B), upewniając się, że przewód nie znajduje się bezpośrednio przed wylotem strzykawki. Przewód ten należy podłączyć do katody zasilacza prądu stałego (np. Wild Heerbrugg MTR32, patrz metody) lub do jednego z biegunów zasilacza prądu przemiennego (np. Wild Heerbrugg-LEP 990018). Trzpień uchwytu elektrody należy zamocować na manualnym mikromanipulatorze po prawej stronie mikroskopu, a u podstawy trzpienia uchwytu elektrody należy przymocować kabel elektryczny za pomocą klipsa krokodylkowe. Kabel należy podłączyć do anody zasilacza prądu stałego lub do drugiego bieguna zasilacza prądu przemiennego (Rycina 1A).</li>
<li>Do uchwytu elektrody należy włożyć drucik wolframowy (o długości ok. 5 cm) i przymocować go do trzpienia uchwytu na manipulatorze. Zasilacz należy ustawić na 6 V, a następnie wielokrotnie wkładać końcówkę drutu do strzykawki w celu jego ostrzenia, uważnie monitorując końcówkę pod mikroskopem w trakcie procesu (Rycina 1C). Aby uzyskać idealną elektrodę do rejestracji, należy zanurzyć 90% jej długości w roztworze na maksymalnie 1 min, a następnie powoli ją wyciągnąć. Następnie należy włożyć tylko ok. 50% elektrody, aby dodatkowo ją zwęzić przez 30 s, i powtarzać tę czynność do momentu zaostrzenia końcówki drutu (ok. 10 razy). Końcówka elektrody powinna być wystarczająco cienka, aby wniknąć do sensillum, ale nie tak cienka, aby wyginała się podczas dotykania go w trakcie rejestracji (kroki 6 i 7). Choć obserwacja końcówki elektrody pod mikroskopem stereoskopowym podczas ostrzenia jest dobrym wskaźnikiem jej grubości, to dopiero oglądanie jej pod mikroskopem rejestrującym przy dużym powiększeniu pozwoli jednoznacznie ocenić, czy dana elektroda nadaje się do rejestracji.</li>
</ol>
4. Przygotowanie owada: antena Drosophila
<ol>
<li>Zbuduj aspirator do muszek. Odetnij kawałek przewodu powietrznego o długości pozwalającej na wygodne zawieszenie go na szyi (około 90 - 120 cm). Odetnij końcówkę tipa do pipety 200 μL i włóż ją w jeden koniec rurki. Na drugim końcu umieść kawałek siatki o wymiarach ~1,5 cm x 1,5 cm w taki sposób, aby tworzyła fizyczną barierę, ale nie blokowała przepływu powietrza z rurki. Odetnij końcówkę tipa do pipety 1 mL i umieść szerszy koniec na górze otworu rurki, blokując siatkę pomiędzy nimi. Ta część będzie służyć do wychwytywania i manipulowania dorosłymi muszkami octowymi (Rysunek 2).</li>
<li>Weź szkiełko przedmiotowe i umieść kawałek wosku dentystycznego mniej więcej na środku długiego boku. Na wosku ustaw lekko nachylone do góry (~30°) szkiełko nakrywki, upewniając się, że wosk nie znajduje się bezpośrednio pod najwyższą częścią, co uniemożliwiłoby wizualizację muszki octowej pod mikroskopem. Wyciągnij elektrodę szklaną za pomocą pionowego wyciągacza. Jej końcówka powinna być wystarczająco cienka i elastyczna, aby zmieścić się pomiędzy drugim a trzecim segmentem czułka i stabilizować czułek podczas rejestracji. Umieść elektrodę szklaną na kolejnym kawałku wosku i ustaw ją obok szkiełka nakrywki, w takiej odległości, aby po opuszczeniu końcówki dotarła ona do narożnika szkiełka nakrywki (Rysunek 3A).</li>
<li>Korzystając z butelki lub fiolki z dorosłymi muszkami pożądanego genotypu, wychwyć dorosłą muszkę octową za pomocą aspiratora. Choć zazwyczaj używa się samic ze względu na ich większy rozmiar, można użyć również samców. Na szczycie tipa 1 mL umieść tip do pipety 200 μL, aby zapobiec ucieczce muszki. Wdmuchnij powietrze do rurki, tak aby muszka została pchnięta w stronę końca tipa 200 μL. Przytnij szeroki koniec tipa pipety żyletką kilka milimetrów od samej muszki, a następnie wstaw trochę wosku, aby zapobiec cofnięciu się muszki. Pod mikroskopem wykonaj ponowne cięcie w pobliżu głowy muszki octowej, dbając o to, by nie uszkodzić zwierzęcia. Za pomocą małego tipa do pipety dociśnij wosk, aby wypchnąć głowę muszki tak, by około połowy oczu wystawała z tipa (Rysunek 3B). Upewnij się, że nogi nie wystają, ponieważ mogłyby się poruszać i zakłócać rejestrację.</li>
<li>Zamocuj muszkę na kawałku wosku głową do góry i umieść ją na szkiełku przed szkiełkiem nakrywki. Delikatnie dociśnij głowę do narożnika szkła, aby czułki rozprostowały się i spoczęły na szkle. Opuść końcówkę kapilary szklanej pomiędzy drugi a trzeci segment czułka (Rysunek 3B).</li>
<li>Różne części czułka zapewnią dostęp do różnych typów sensyli. W zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych, czułek będzie musiał być zorientowany w różny sposób, aby umożliwić dostęp do różnych typów sensyli. Aby rejestrować sygnały z dużych sensyli basikonicznych, jak w naszym przykładzie, arista jest dociskana do szkła (Rysunek 3B).</li>
</ol>
5. Przygotowanie owadów: palpy szczękowe Anopheles
<ol>
<li>Za pomocą aspiratora elektrycznego (Rycina 2E) należy zebrać od 40 do 60 komarów w wieku 3-5 dni (mieszana grupa samców i samic) do małej plastikowej klatki (Rycina 2F). Komary powinny być hodowane w normalnych warunkach, tj. w inkubatorze do owadów lub w insektarium w temperaturze 25-28°C i przy wilgotności 70-80%. Małą plastikową klatkę z owadami należy umieścić w lodzie na ok. 15 min, aż zostaną one znieczulone zimnem. Po ustaniu ruchów zwierząt, należy przenosić na raz tylko 4-6 osobników na przedpole mikroskopu, pozostawiając resztę zwierząt w lodzie podczas procedur. Choć zazwyczaj stosuje się samice ze względu na ich wrażliwość na CO2, można wykorzystać również samce. Należy wyselekcjonować samice lub samce komarów, oceniając strukturę ich czułków (pierzaste u samic, nitkowate u samców), a następnie usunąć im skrzydła i odnóża za pomocą precyzyjnej pęsety w celu ich unieruchomienia. Należy trzymać je w małym plastikowym kubku z wilgotnym papierem na dnie, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
<li>Na szkiełku podstawowym, w centrum i z boku, należy nakleić dwa kawałki dwustronnej taśmy (~1 cm długości) równolegle do siebie (w odstępie ~1 cm) (Rycina 3C). Używając precyzyjnej pęsety, należy umieścić jednego komara na centralnej taśmie pod mikroskopem stereoskopowym, obrócić go bokiem i przykleić ciało oraz jedno oko do taśmy. Należy ustawić położenie wypustek szczękowych tak, aby obie wypustki rozciągały się równolegle na taśmie (Rycina 3D). Wypustki szczękowe należy unieruchomić, kładąc cienkie nici (np. ludzkie włosy) zarówno u nasady, jak i na końcach wypustek (Rycina 3D). Taśma boczna służy jako miejsce przechowywania cienkich nici, natomiast taśmę centralną należy wymieniać po każdym pomiarze (Rycina 3C).</li>
</ol>
6. Rejestracja Drosophila melanogaster
<ol>
<li>Umieść preparat pod mikroskopem (Rycina 4A) przy niskim powiększeniu i ustaw antenę mniej więcej na środku pola widzenia (FOV) (Rycina 4B). Ostrożnie opuść elektrody tak, aby elektroda odniesienia znajdowała się w pobliżu oka muchy, a elektroda rejestrująca w pobliżu anteny (Rycina 4C). Zwiększ powiększenie i ponownie ustaw antenę na środku pola widzenia (Rycina 4D).</li>
<li>Umieść urządzenie do podawania zapachów blisko głowy muchy, skierowane w stronę anteny.</li>
<li>Przy niskim powiększeniu (Rycina 4C) wprowadź elektrodę odniesienia do oka muchy. Opuść elektrodę rejestrującą nad antenę, nie dotykając jej powierzchni.</li>
<li>Przełączając na wysokie powiększenie, steruj elektrodą rejestrującą za pomocą mikromanipulatora i wprowadź ją do wybranego sensillum (Rycina 4D). Każdy punkt wzdłuż długości sensillum nadaje się do rejestracji. Po wprowadzeniu do sensillum elektrodę można przesunąć głębiej (czasami aż do końca), aby uzyskać lepszy stosunek sygnału do szumu. Gdy elektroda znajduje się w sensillum, można wykryć spontaniczną aktywność komórek.</li>
</ol>
7. Rejestracja Anopheles gambiae
<ol>
<li>Umieść szkiełko pod mikroskopem przy niskim powiększeniu (10x), ustawiając palpy szczękowe mniej więcej na środku pola widzenia, a głowę u góry (Rysunek 4E). Obracaj stolikiem, aż jeden z palpów znajdzie się pod kątem prostym względem elektrody rejestrującej.</li>
<li>Dostosuj wysokość elektrod tak, aby elektroda referencyjna znajdowała się tuż nad okiem komara, a elektroda rejestrująca w pobliżu palpów szczękowych.</li>
<li>Umieść urządzenie do podawania zapachu jak najbliżej palpów.</li>
<li>Wprowadź elektrodę referencyjną do oka przy niskim powiększeniu (10x), a następnie, przełączając na większe powiększenie (100x), wprowadź elektrodę rejestrującą do sensillum typu peg na palpie (Rysunek 4F). Po wprowadzeniu elektrody do sensillum można wykryć spontaniczną aktywność komórek.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
W zależności od sensilla i jakości rejestracji można wyróżnić różną liczbę neuronów węchowych w obrębie jednego śladu. Na przykład w dużych sensillach bazikonicznych Drosophila melanogaster podczas rejestracji powinny pojawić się od 2 do 4 komórek różniących się amplitudą potencjałów czynnościowych 9, 10.
W naszym eksperymencie wideo sensillum ab2 Drosophila wykazuje dwie komórki: komórkę A (Rycina 5, niebieskie piki) oraz komórkę B (Rycina 5, zielone piki). Żadna z komórek nie jest aktywowana podczas aplikacji oleju parafinowego (Rycina 5A), natomiast tylko komórka A reaguje na rozcieńczenie octanu metylu 10-6 (Rycina 5B).
W obrębie palpa szczękowego Anopheles gambiae, żłobkowany sensillum kolczasty składa się z trzech komórek, lecz jedynie dwie z nich są łatwo rozróżnialne (Rycina 5C, odpowiednio kolce niebieski i zielony). W eksperymencie wideo pokazujemy, jak komórka B reaguje na rozcieńczenie 1-octen-3-olu w stosunku 10-7 (Rycina 5D).
<img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig1.jpg" alt="Układ mikroskopowy ze strzykawką i uchwytem do elektrod do elektrofizjologii; szczegół drutu wolframowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Urządzenie do ostrzenia elektrod (A) Ogólny widok aparatury do ostrzenia elektrod. (B) Strzykawka zawierająca 0,5 M KOH (po lewej) używana do ostrzenia elektrody (po prawej). (C) Zbliżenie końcówki elektrody obok otworu strzykawki.
<img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig2.jpg" alt="Układ dla bezkręgowców wodnych z rurkami i plastikowymi klatkami, przedstawiający proces montażu i komponenty." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Sposób przygotowania aspiratora do muszek i aspiratora do komarów (A) Materiały wyjściowe: plastikowe rurki do linii powietrznej, dwa przycięte końce pipet i siatka. (B) Gotowy aspirator do muszek. (C) Szczegół końcówki służącej do odławiania muszek octowych. (D) Szczegół drugiego końca aspiratora do muszek. (E) Elektryczny aspirator do zbierania komarów składający się z korpusu głównego i odpinanej plastikowej klatki. (F) Odpinana plastikowa klatka dla komarów.
<img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig3.jpg" alt="Schemat zestawu do elektrofizjologii owadów z elektrodami, woskiem dentystycznym i szkiełkiem przedmiotowym do rejestracji neuronalnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Przygotowanie muszki owocówki (Drosophila melanogaster) i komara malarycznego (Anopheles gambiae) do rejestracji (A) Zdjęcie muszki owocówki zamontowanej na szkiełku przed umieszczeniem go pod mikroskopem. (B) Zbliżenie głowy muszki owocówki z anteną unieruchomioną za pomocą kapilary szklanej. (C) Zdjęcie komara zamontowanego na szkiełku. (D) Zbliżenie głowy komara z ssawką i palpami przyklejonymi do taśmy.
<img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig4.jpg" alt="Układ elektrofizjologiczny z systemem podawania zapachów do analizy odpowiedzi węchowej u owadów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Rejestracja sygnałów z muszki octowej (Drosophila melanogaster) oraz komara malarycznego (Anopheles gambiae) (A) Widok układu elektrofizjologicznego. (B) Zbliżenie preparatu muchy zamocowanego na mikroskopie. Zwróć uwagę na położenie elektrody rejestrującej (lewo), systemu podawania zapachów (środkowa pipeta) oraz elektrody rejestrującej (prawo). (C) Obraz muchy widzianej przez obiektyw 10x. (D) Obraz czułka muchy widziany przez obiektyw 100x; duże sensylla bazikoniczne (strzałki), przeplatane z włoskami niesensorycznymi (groty strzałek). (E) Widok 10x komara zamocowanego do rejestracji. (F) Widok przy dużym powiększeniu palpa komara i sensyllum typu peg (strzałka).
<img src="/files/ftp_upload/1725/1725fig5.jpg" alt="Dane elektrofizjologiczne po stymulacji chemicznej; wykresy A-D pokazują odpowiedzi na olej parafinowy, octan metylu i 1-octen-3-ol." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5. Przykłady rejestracji z Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae 
(A) Sensilla ab2 Drosophila melanogaster zawiera dwa neurony sensoryczne; komórkę A (niebieskie impulsy) i komórkę B (zielone impulsy). (B) Komórki A i B podczas aplikacji 10-6 octanu metylu. (C) Sensilla peg Anopheles gambiae zawiera dwa neurony sensoryczne; komórkę A (niebieskie impulsy) i komórkę B (zielone impulsy). (D) Aplikacja 10-7 1-octen-3-olu do sensilli peg.

<ol><li>Boeckh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elektrophysiologische+Untersuchungen+an+einzelnen+Geruchsrezeptoren+auf+der+Antenne+des+TotengrAbers+%28Necrophorus+Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elektrophysiologische Untersuchungen an einzelnen Geruchsrezeptoren auf der Antenne des TotengrAbers (Necrophorus Coleoptera).</a> Z. Vergl. Physiol. 46, 212-248 (1962).</li>
<li>Schneider, D., Hecker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Elektrophysiologic+der+Antenne+des+Seidenspinners+Bombyx+mori+bei+Reizung+mit+angereicherten+Extrakten+des+Sexuallockstoffes%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Naturforschg%22%5BJournal%5D)">Zur Elektrophysiologic der Antenne des Seidenspinners Bombyx mori bei Reizung mit angereicherten Extrakten des Sexuallockstoffes.</a> Z. Naturforschg. 11b, 121-124 (1956).</li>
<li>Touhara, K., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+odorants+and+pheromones+with+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sensing odorants and pheromones with chemosensory receptors.</a> Annu Rev Physiol. 71, 307-332 (2009).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+olfactory+receptors+are+heteromeric+ligand-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels.</a> Nature. 452, 1002-1006 (2008).</li>
<li>Wicher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+odorant+receptors+are+both+ligand-gated+and+cyclic-nucleotide-activated+cation+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels.</a> Nature. 452, 1007-1011 (2008).</li>
<li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117, 965-979 (2004).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li>
<li>Boeckh, J., Kaissling, K. E., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Insect olfactory receptors.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 30, 263-280 (1965).</li>
<li>de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odor coding in the Drosophila antenna.</a> Neuron. 30, 537-552 (2001).</li>
<li>Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+in+the+maxillary+palp+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae.</a> Curr Biol. 17, 1533-1544 (2007).</li>
<li>Hallem, E. A., Fox, A. N., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction%3A+mosquito+receptor+for+human-sweat+odorant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Olfaction: mosquito receptor for human-sweat odorant.</a> Nature. 427, 212-213 (2004).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. M. olecular <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anatomical%2C+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Curr. Biol. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Fishilevich, E., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+functional+subdivision+of+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic and functional subdivision of the Drosophila antennal lobe.</a> Curr Biol. 15, 1548-1553 (2005).</li>
</ol>

Sygnały zapachowe są wykorzystywane przez organizmy do identyfikacji źródeł pożywienia, potencjalnych partnerów oraz drapieżników. Olfaktoryczne neurony sensoryczne (OSN) stanowią pierwsze centrum przekaźnikowe między bodźcami zewnętrznymi a wyższymi ośrodkami mózgu, w których informacje są dalej przetwarzane. U Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae neurony OSN są łatwo dostępne, a ich aktywność elektryczna może być monitorowana podczas stymulacji podmuchami zapachu.
<p class="jove_content...

<table><tbody><tr><td>Olej parafinowy</td><td>Zapachy</td><td>Fluka</td><td>76235</td><td></td></tr><tr><td>Zapachy o wysokiej czystości (&amp;gt;98%)</td><td>Zapachy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Octan metylu&lt;br/&gt;#296996&lt;br/&gt;1-okten-3-ol&lt;br/&gt;#74950&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Paski papieru filtracyjnego</td><td>Zapachy</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-1</td><td>Papier chromatograficzny</td></tr><tr><td>Złącza</td><td>Zapachy</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06365-40</td><td>1/16x1/8&quot;</td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td>Zapachy</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0556</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy przewód linii powietrznej</td><td>Podawanie zapachu</td><td>Python Products</td><td>500PAL</td><td></td></tr><tr><td>1 pipeta serologiczna</td><td>Podawanie zapachu</td><td>Corning</td><td>4101</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Przewód plastikowy</td><td>Podawanie zapachu</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06418-0</td><td>0.050&quot;x0.090&quot;OD</td></tr><tr><td>Jednorazowe szklane pipety Pasteura z borokrzemianu</td><td>Podawanie zapachu</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>5-3/4 cala</td></tr><tr><td>Programowalny kontroler bodźców</td><td>Podawanie zapachu</td><td>Syntech</td><td>CS-55</td><td></td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>TMC</td><td>63533</td><td>36&amp;#8221;szer.x30&amp;#8221;gł.x29&amp;#8221;wys.</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>TMC</td><td>MI8133303</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Nikon Instruments</td><td>E600FN ECLIPSE</td><td>Mikroskop do rejestracji</td></tr><tr><td>Obiektywy 10x i 100x</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Nikon Instruments</td><td>10x Plan Fluor 100x L Plan</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Nikon Instruments</td><td>EZ645</td><td>Mikroskop do ostrzenia elektrod i przygotowania owadów</td></tr><tr><td>Statywy magnetyczne</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Newport Corp.</td><td>MODEL 150</td><td></td></tr><tr><td>IDAC</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Syntech</td><td>IDAC-4</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td></td></tr><tr><td>1 makromanipulator</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td>Manipulator z joystickiem&lt;br/&gt;Używany do pozycjonowania elektrody odniesienia</td></tr><tr><td>1 mikromanipulator</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>EXFO</td><td>PCS-6000</td><td>Używany do pozycjonowania elektrody rejestrującej</td></tr><tr><td>Krokodylkowy zacisk</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Pomona</td><td>AL-B-12-0</td><td></td></tr><tr><td>Kabel elektryczny</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Pomona</td><td>B-36-0</td><td>Zestaw kabla testowego</td></tr><tr><td>2 uchwyty elektrod</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Syntech</td><td>N/A</td><td>Uchwyty elektrod (zestaw 2 szt.) do elektrod z drutu wolframowego</td></tr><tr><td>Sonda AC</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Syntech</td><td>N/A</td><td>Uniwersalna sonda jednopunktowa (10xAC)</td></tr><tr><td>Elektrody wolframowe</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Microprobes</td><td>M210</td><td>proste pręty wolframowe, 0.005x3</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>BD Biosciences</td><td>301625</td><td>20 mL</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Sprzęt elektrofizjologiczny</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>np. MTR32</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy wyciągacz (puller)</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>Narishige International</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>Patterson</td><td>091-1503</td><td></td></tr><tr><td>Przedmiotowe szkło mikroskopowe</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550A</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td>18X18 #1.5</td></tr><tr><td>Siatka polipropylenowa</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMP-0500-B</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda szklana</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>27-32-0-075</td><td>Kapilara borokrzemianowa 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna (3M)</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>3M</td><td>MMM6652P3436</td><td>Taśma dwustronna (3M)</td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>Fine Science Tools</td><td>021x0053</td><td>Pinceta Dumont #5 z lustrzanym wykończeniem</td></tr><tr><td>Mały plastikowy kubek</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>VWR international</td><td>89009-662</td><td>7 x 5.7 (23/4 x 21/4)</td></tr><tr><td>Elektryczny aspirator</td><td>Przygotowanie owadów</td><td>Gempler&amp;rsquo;s</td><td>RHM200</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów drosophila melanogaster oraz anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Zmysł powonienia jest niezbędny owadom do znajdowania pożywienia, partnerów do rozrodu, drapieżników oraz miejsc składania jaj3. Olfaktoryczne neurony sensoryczne (OSNs) owadów są zamknięte w włoskach sensorycznych zwanych sensillami, które pokrywają powierzchnię organów węchowych. Powierzchnia każdej sensilli pokryta jest drobnymi porami, przez które przenikają substancje zapachowe i rozpuszczają się w płynie zwanym limfą sensilli, która obmywa dendryty sensoryczne OSNs znajdujące się w danej sensilli. Dendryty OSN wykazują ekspresję białek receptorów zapachowych (OR), które u owadów pełnią funkcję kanałów jonowych sterowanych zapachem4, 5. Oddziaływanie substancji zapachowych z receptorami OR prowadzi do zwiększenia lub zmniejszenia podstawowej częstotliwości wyładowań OSN. Ta aktywność neuronalna w formie potencjałów czynnościowych stanowi pierwszą reprezentację jakości, intensywności i charakterystyki czasowej substancji zapachowej6, 7.
Ze względu na łatwy dostęp do tych włosków sensorycznych, możliwe jest przeprowadzenie rejestracji pozakomórkowej z pojedynczych OSN poprzez wprowadzenie elektrody rejestrującej do limfy sensillum, podczas gdy elektrodę referencyjną umieszcza się w limfie oka lub w ciele owada. U Drosophila sensilla zawierają od jednego do czterech OSN, jednak każde OSN wykazuje zazwyczaj charakterystyczną amplitudę potencjału czynnościowego. Techniki sortowania impulsów (spike sorting) umożliwiają przypisanie odpowiedzi impulsowych do poszczególnych OSN. Ta technika rejestracji z pojedynczego sensillum (SSR) monitoruje różnicę potencjałów między limfą sensillum a elektrodą referencyjną jako impulsy elektryczne generowane przez aktywność receptorową w OSN1, 2, 8. Zmiany w liczbie impulsów w odpowiedzi na substancję zapachową stanowią komórkową podstawę kodowania zapachów u owadów. W niniejszej pracy opisujemy metodę przygotowania obecnie stosowaną w naszym laboratorium do przeprowadzania SSR u Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae i przedstawiamy reprezentatywne zapisy indukowane substancjami zapachowymi w sposób specyficzny dla danego sensillum.

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Zmysł węchu jest niezbędny owadom do znajdowania pożywienia, partnerów do rozrodu, drapieżników oraz miejsc składania jaj3. Olfaktoryczne neurony sensoryczne (OSN) owadów są zamknięte ...

W niniejszym filmie pokazano, jak przeprowadzić pojedyncze rejestracje synaptyczne u Drosophila melanogaster; przygotowane odpowiednio odoranty są nanioszone pipetą na paski papieru, a następnie umieszczane w pipetach Pasteura. Żywe owady są montowane w celu unieruchomienia organów węchowych. Owada umieszcza się pod mikroskopem, a następnie do oka owada wprowadza się elektrodę referencyjną.Następnie elektrodę rejestrującą wprowadza się do opuszki węchowej. Za pomocą pipety kieruje się strumień zapachu w stronę opuszki i rejestruje aktywność neuronalną. Cześć, jestem Leslie Vasal z laboratorium Vasal na Uniwersytecie Rockefeller, a ja jestem Mariza Pellegrino, również z laboratorium Vasal.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę rejestracji aktywności neuronów sensorycznych węchowych muszki octowej Drosophila melanogaster oraz komara malarycznego Anopheles gambiae. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać działanie zmysłu węchu u owadów oraz sposób, w jaki neurony reagują na substancje lotne. Zapraszamy do oglądania.Procedurę rozpoczynamy od zaostrzenia elektrod, które zostaną wykorzystane do rejestracji. Za pomocą wiertarki należy wykonać niewielki otwór o średnicy około dwó

single-sensillum-recordings-insects-drosophila-melanogaster-anopheles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestrowanie pojedynczych wrażeń w owadów Drosophila melanogaster i Anopheles gambiae

Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

W tym filmie żywa mucha Drosophila jest zamontowana w tubie do badań elektrofizjologicznych. Elektrody są umieszczone u podstawy czułki, aby rejestrować specyficzne odpowiedzi neuronalne na feromony za pomocą neuronów receptorów węchowych muchy.

Zapisy elektrofizjologiczne z Drosophila sensilla w odpowiedzi na lotne substancje zapachowe

Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla

Korzystając z dwóch metod do oszacowania ekspresji genów w głównych wyrostkach smakowych Aedes aegypti, zidentyfikowaliśmy zestaw genów przypuszczalnie leżących u podstaw reakcji neuronalnych na gorzkie i odpychające związki, zgodnie z badaniem elektrofizjologicznym.

Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę

Pluskwy polegają na neuronach receptorów węchowych umieszczonych w ich czułkach węchowych do wykrywania substancji semiochemicznych w środowisku. Wykorzystując rejestrację pojedynczego czujnika, demonstrujemy metodę oceny reakcji pluskiew na substancje semiochemiczne i badamy związany z tym proces kodowania.

Wykorzystanie pojedynczego zapisu sensillum do wykrywania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół dla pojedynczych nagrań sensillum z sensilla basiconica na palpach aparatów gębowych owadów.

Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Rzadko stosowana metoda zapisu elektrofizjologicznego, zapis podstawowy, pozwala na analizę cech kodowania smaku, które nie mogą być zbadane konwencjonalnymi metodami zapisu. Zapis bazowy pozwala również na analizę reakcji smakowych na bodźce hydrofobowe, których nie można zbadać tradycyjnymi metodami elektrofizjologicznymi.

Zapis podstawowy: technika analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila

Poznaj technikę pojedynczych nagrań sensillum do pomiaru aktywności neuronów węchowych u Drosophila melanogaster i Anopheles gambiae. Metoda ta pozwala badać elektrofizjologiczne odpowiedzi na bodźce zapachowe.

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Przeglądaj więcej filmów