Pojedyncze nagrania Sensillum u owadów Drosophila melanogaster i Anopheles gambiae

Ten film pokazuje, jak wykonywać nagrania pojedynczych syn u Drosophila, melanogaster i okropnie gambier Przygotowane substancje zapachowe są pipetowane na paski papieru i wkładane do pipet pastwiskowych. Żywe owady są montowane w celu unieruchomienia narządów węchowych. Owada umieszcza się pod mikroskopem, a do oka owada wprowadza się elektrodę referencyjną.

Elektroda rejestrująca jest następnie wprowadzana do węchowego centum. Zapach jest wydmuchiwany z pipety do centum i rejestrowana jest aktywność neuronów. Cześć, nazywam się Leslie Vasal z Sal Laboratory na Uniwersytecie Rockefellera, nazywam się Mariza Pellegrino, również z laboratorium Vasal.

A ja jestem z, Dzisiaj pokażemy Wam procedurę nagrywania z węchowych neuronów czuciowych muchy octowej przełyku melanogaster oraz komara malarii i nais gambi. Używamy tej procedury w naszym laboratorium, aby zbadać, jak działa czujnik zapachu u owadów i jak neurony reagują na lotne substancje chemiczne. Więc zacznijmy.

Rozpocznij tę procedurę od naostrzenia elektrod, które mają być używane do nagrań. Za pomocą wiertła wykonaj mały otwór o średnicy około dwóch milimetrów na ściance 20-litrowej strzykawki, jeden centymetr od końcówki. Napełnij strzykawkę przefiltrowanym 0,5 molowym wodorotlenkiem potasu i zaciśnij ją poziomo na statywie pod mikroskopem preparacyjnym z końcówką w polu view, wepchnąć przewód elektryczny do otworu w strzykawce, upewniając się, że nie blokuje końcówki strzykawki i podłączyć ją do anody zasilacza.

Po prawej stronie mikroskopu przymocuj wałek uchwytu elektrody do ręcznego mikromanipulatora. Następnie za pomocą zacisku krokodylkowego przymocuj elektryczny u podstawy wału uchwytu elektrody. Podłącz do katody zasilacza.

Włóż pięciocentymetrowy kawałek drutu wolframowego do uchwytu elektrody i przykręć go do wału. Na manipulatorze. Ustaw zasilacz na sześć razy.

Podczas oglądania pod mikroskopem preparacyjnym należy wprowadzić elektrodę do końcówki strzykawki tak, aby 90% długości elektrod znajdowało się w roztworze. Po minucie powoli wyjmij elektrodę, a następnie włóż ją ponownie. Tym razem tylko 50% elektrody powinno mieć kontakt z roztworem.

Po 30 sekundach ponownie wyjmij elektrodę. Powtórz ten proces 10 razy za każdym razem, gdy wprowadzasz igłę tak, aby 50% elektrody stykało się z wodorotlenkiem potasu. Po naostrzeniu elektroda jest gotowa do użycia w eksperymentach.

Przygotowanie systemu dostarczania środka nawaniającego należy rozpocząć od pocięcia bibuły chromatograficznej na paski o wymiarach trzy milimetry na pięć centymetrów na każdym pasku pipety 30 mikrolitrów żądanego środka zapachowego. Następnie umieść pasek w szklance obok pipety. Przymocuj do pipety kawałek rurki powietrznej o długości około trzech centymetrów.

Następnie za pomocą łącznika zamknij rurkę i odłóż przygotowane substancje zapachowe na bok. Następnie za pomocą żyletki przetnij 10-mililitrową plastikową pipetę serologiczną w miejscu czterech mililitrów od góry, wyrzuć spiczasty koniec. Następnie za pomocą małego wiertła utwórz dwa otwory, jeden na znaku minus 1,5 mililitra, a drugi na znaku minus 0,5 mililitra.

Następnie włóż końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów do łącznika kolczastego i wepchnij łącznik w odcięty koniec pipety o pojemności 10 mililitrów. Zacisnąć pipetę na stojaku magnetycznym i umieścić ją w pobliżu mikroskopu. Następnie podłączyć pipetę serologiczną do pompy powietrza za pomocą rurki powietrznej i umieścić pipety zawierające substancje zapachowe obok pipety serologicznej gotowej do użycia.

Następnie przykręć elektrody w uchwycie elektrody i sondę podłączoną do manipulatorów na zestawie mikroskopu. Umieść kawałek szkła nakrywkowego na wosku dentystycznym pod kątem 30 stopni, upewniając się, że wosk dentystyczny nie zakrywa górnej części szkła. Następnie umieść kawałek wosku dentystycznego w środkowej części mikroskopu.

Szkiełko teraz umieść dodatkowy mniejszy kawałek wosku na szkiełku, jak pokazano tutaj na nim. Umieść szklaną kapilarnę pociągniętą pionowym ściągaczem. Zbuduj aspirator lotu, wkładając wyciętą końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów do jednego końca 120-centymetrowego odcinka rurki powietrznej.

Przykryj drugi koniec rurki kawałkiem siatki o wymiarach 1,5 centymetra na 1,5 centymetra i zabezpiecz go na miejscu, przykrywając go nacięciem. Jedna mililitrowa końcówka do pipety. Teraz użyj aspiratora much, aby podnieść dorosłą muchę z butelki.

Złap muchę, zakrywając końcówkę aspiratora muchy końcówką o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie dmuchnij w rurkę, aby popchnąć muchę w kierunku końca końcówki o pojemności 200 mikrolitrów. Za pomocą żyletki do przycinania, szeroki koniec końcówki pipety znajduje się kilka milimetrów od muchy.

Szybko włóż wosk dentystyczny, aby złapać muchę pod mikroskopem preparacyjnym. Przytnij końcówkę pipety w pobliżu główki muchy, uważając, aby nie zranić jej małą końcówką do pipety. Wciśnij wosk, aż około połowa oczu muchy wysunie się z końcówki.

Upewnij się, że nogi nie wychodzą, ponieważ mogą przeszkadzać w nagraniach. Zamontuj muchę na kawałku wosku, jej głową skierowaną do góry. Następnie umieść wosk na szkiełku podstawowym przylegającym do szkła nakrywkowego, jak pokazano tutaj.

Lekko popchnij wosk, aby antena wysunęła się i spoczęła na szkle. Zamocuj antenę, umieszczając szklaną kapilarnę w rowku między drugim a trzecim segmentem anteny. Po umieszczeniu muchy na szkiełku przenieś ją do mikroskopu używanego z ustawieniami rejestracji i nawaniacza przy małym powiększeniu.

Ustaw antenę mniej więcej pośrodku pola view. Delikatnie opuść elektrodę odniesienia i umieść ją obok oka. Następnie opuść elektrodę rejestrującą i ustaw ją obok anteny.

Zwiększ powiększenie i ustaw antenę na środku pola widzenia. Umieść urządzenie dostarczające zapachy blisko głowy muchy, kierując się w stronę anteny. Przełącz się z powrotem na niskie powiększenie za pomocą mikromanipulatora.

Włóż elektrodę referencyjną do oka muchy. Opuść elektrodę nagrywającą nad antenę, nie dotykając jej powierzchni. Następnie przełącz się z powrotem na duże powiększenie za pomocą mikromanipulatora.

Włóż elektrodę rejestrującą do syna w dowolnym punkcie na całej jego długości, gdy elektroda zostanie prawidłowo umieszczona, można wykryć spontaniczną aktywność w komórkach czujnika. W razie potrzeby elektrodę można wsunąć głębiej lub nawet do końca przez czujnik, aby uzyskać lepszy stosunek sygnału do szumu. Aby zarejestrować reakcje na substancje zapachowe, podłącz pipetę pastwiskową do pompy powietrza za pomocą rurki powietrznej i zaciągnij się środkiem zapachowym, w tym przypadku octanem metylu, aktywując pompę powietrza na około jedną sekundę z prędkością około 220 mililitrów na minutę.

Za pomocą aspiratora elektrycznego zbierz od 40 do 63 do pięciu dni komarów w małej plastikowej klatce. Umieść klatkę na lodzie na około 15 minut, aby znieczulić komary. Gdy komary przestaną się poruszać, przenieś cztery do sześciu komarów do etapu mikroskopu preparacyjnego.

Zarówno mężczyzna, jak i kobieta. Do nagrywania można używać komarów. U mężczyzn.

Czułki wyglądają jak pióra Podczas gdy u samic wydają się być włókniste, jak za pomocą cienkich kleszczy, usuń skrzydła i nogi komarów, aby je unieruchomić. Po usunięciu skrzydeł umieść komary w nawilżonym plastikowym kubku, aby zapobiec ich wysuszeniu. Umieść dwa jednocentymetrowe kawałki taśmy dwustronnej równolegle do siebie i około jednego centymetra od siebie pośrodku i z boku szklanego szkiełka pod mikroskopem preparacyjnym, za pomocą kleszczy umieść jednego komara na boku.

Na środkowej taśmie. Jedno oko przyklei się do taśmy. Dostosuj położenie miazgi szczęki tak, aby obie wystawały równolegle na taśmie.

Przymocuj miazgę szczęki, umieszczając cienkie sznurki, takie jak ludzkie włosy, u podstawy i na końcu miazgi. Po umieszczeniu komara na zjeżdżalni przenieś go do ustawień nagrywania. W pozycji małego powiększenia miazga szczękowa znajduje się mniej więcej w środku pola widzenia, a głowa u góry obraca stolik, aż jedna z miazgi znajdzie się pod kątem prostym.

Za pomocą elektrody rejestrującej dopasuj do wysokości elektrod tak, aby elektroda referencyjna znajdowała się tuż nad okiem komara. A elektroda rejestrująca znajduje się w pobliżu miazgi szczękowej. Umieść urządzenie dostarczające zapach tak, aby znajdowało się jak najbliżej miazgi.

Włóż elektrodę referencyjną do oka. Przełącz się na obiektyw 100 x i włóż elektrodę rejestrującą do kołka na palp. Gdy elektroda znajdzie się w sentum, można wykryć spontaniczną aktywność komórek.

Podobnie jak w przypadku rejestrów Drosophila, reakcje odoranta indukowały poprzez zaciąganie się środkiem zapachowym w tym przypadku, jeden OCT trzy wszystkie poprzez podłączenie tylnej pipety zawierającej zapach do pompy powietrza, a następnie aktywację pompy powietrza. Teraz pokażemy kilka reprezentatywnych nagrań zarówno z węchowych neuronów czuciowych drosophila, jak i oph. W zależności od słońca i jakości nagrania, można rozróżnić różną liczbę neuronów węchowych w obrębie jednego śladu w dużej podstawie ikonicznej silla Drosophila melanogaster, na przykład między dwiema a czterema komórkami, ta różnica w amplitudzie skoku powinna pojawić się podczas nagrania.

Ten rysunek pokazuje nagrania wykonane z dwóch komórek Drosophila AB dwóch lum. Nagrania z komórki A są wyświetlane na niebiesko, a nagrania z komórki B są wyświetlane na zielono, podczas gdy żadna komórka nie jest aktywowana podczas stosowania oleju parafinowego. Jak pokazano na rysunku po lewej stronie, tylko odpowiedź komórki A na octan metylu w szczęki gambiera OPIS, rowkowane kołki i soum zawierają trzy komórki, ale tylko dwie są łatwe do odróżnienia. Tu.

Nagrania pokazane na zielono wskazują odpowiedź komórek B na nawaniacz, OCT trzy. Wszystko, co właśnie pokazaliśmy, jak rejestrować z węchowych neuronów czuciowych muchy octowej drosophila melanogaster i komara malarii i nowość gambi. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o stabilnym przygotowaniu issetu oraz drobnych zbiornikach i elektrodzie, aby z powodzeniem wykonywać nagrania.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.