Naprawa niedopasowania obrazowego i odpowiedzi komórkowe na uszkodzenia DNA u Bacillus subtilis

Szczepy Baus TLU niosące fuzje translacyjne naprawy niedopasowania. Białka połączone z GFP są rozdrabniane na pożywkach selektywnych. Komórki uliczne są używane do świeżego inokulum do płynnej hodowli.

Komórki są hodowane do momentu, gdy OD 600 wynosi od 0,3 do 0,4, gdzie po niedopasowaniu stosuje się pożądane zabiegi, a komórki rosną dalej, aż do osiągnięcia OD 600 od 0,5 do 0,8 komórki są usuwane. W razie potrzeby dodaje się barwnik membranowy FM 4 64, a komórki nakłada się na szkiełka z przygotowanymi podkładkami aros i pozostawia do osiadania po usunięciu nadmiaru podłoża. Przez aspirację.

Nakładany jest szkiełko nakrywkowe, a komórki są wizualizowane za pomocą mikroskopii. Cześć, nazywam się dr Andrew Kow i pracuję w laboratorium dr Lyle'a Simmonsa na Wydziale Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej na Uniwersytecie Michigan w Ann Arbor. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę stosowaną do wizualizacji translacyjnych fuzji białek naprawczych niedopasowania DNA, a także innych białek naprawczych i rybosomalnych w Bacillus solus.

Używamy tej procedury do badania interakcji między białkami naprawy niedopasowania DNA a białkami rybosomalnymi w żywych komórkach Bacillus subtles. Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj szczepy z podlisty B zawierające translacyjne białko fuzyjne, które chcesz zwizualizować dla niektórych szczepów.

Wystarczy zacząć dzień przed obrazowaniem. Przykładem mogą być szczepy, które dobrze rosną, gdy fuzja translacyjna między GFP a genem będącym przedmiotem zainteresowania jest włączona do endogennego locus genu, takiego jak MU LGFP. Rozpoczynając na dzień przed obrazowaniem, użyj sterylnego patyczka w sterylnych warunkach, aby nanieść bakterie na selektywne podłoże LB agro na płytki.

Aby wyhodować pojedyncze kolonie, wysiaduj je przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza następnego dnia, kolonie zostaną wykorzystane do inokulum startowego. Niektóre szczepy z podlisty B wymagają dwóch dni wzrostu przed mikroskopią, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy. Specyficzne szczepy, które wymagają dwudniowego wzrostu, to te, które słabo rosną z powodu fuzji translacyjnej, takie jak rec A, GFP pierwszego dnia, nakładanie bakterii na selektywne LB AED i inkubacja przez noc.

Drugiego dnia wykonaj seryjne rozcieńczanie. Najpierw wybierz pojedynczą kolonię do zaszczepienia 100 mikrolitrów 0,85% soli fizjologicznej, a następnie wykonaj cztery dziesięciokrotne seryjne płytki rozcieńczające 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia soli fizjologicznej, a także początkową kolonię i sól fizjologiczną na napowietrzaczach LB zawierających selektywne antybiotyki inkubuj płytki przez noc, zwykle w temperaturze 30 stopni Celsjusza po drugiej nocnej inkubacji. Wybrać płytkę rozcieńczającą, na której występuje światło, zlewający się wzrost komórek.

Zapewniają one zdrowe, wykładniczo rosnące inokulum startowe, potencjalnie przynosząc doskonałe wyniki obrazowania. Jest to szczególnie przydatne w przypadku najwyższej jakości obrazowania barwienia błonowego. Z FM 4 64 rano w dniu obrazowania umieść 10 mililitrów pożywki S seven 50 w sterylnym flasie o pojemności 125 mililitrów.

Utrzymując w ten sposób co najmniej dziesięciokrotny stosunek powietrza do medium. Umieść komórki w maksymalnie dwóch mililitrach pożywki S seven 50 z lppl z pojedynczymi koloniami lub podobnymi komórkami konfluencji, aby uzyskać inokulum. Dodać wystarczającą ilość inokulum S seven 50 pożywki do kolby Erlina Meyera zawierającej 10 mililitrów pożywki S seven 50, tak aby kultura miała początkowy OD 600 około 0,08 do 0,1.

Następnie hoduj każdą kulturę w odpowiedniej temperaturze, aby zobrazować pociąg podlisty B. Preferowane są kąpiele wodne z wytrząsaniem przy obrotach na minutę od 150 do 200. Kontynuuj uprawę kultur, aż osiągną OD 600 około 0,5 do 0,8.

W przypadku kultur poddanych działaniu czynników uszkadzających DNA lub indukujących niedopasowanie należy zaplanować leczenie w taki sposób, aby koniec okresu inkubacji z użyciem czynnika zmieniającego DNA zbiegł się z czasem osiągnięcia docelowego OD 600. Na przykład dwie aminopuryny, analog oparty na DNA, który naśladuje niedopasowaną zasadę po włączeniu do genomu, wymaga jednogodzinnej inkubacji i prowadzi do tworzenia ogniskowania białek naprawy niedopasowania, takich jak mut LGFP. Jednak tworzenie ogniska REC A GFP wymaga jednogodzinnej inkubacji z mitomycyną C lub innym odczynnikiem do uszkodzenia DNA w celu indukcji podwójnej nici DNA, pęka DNA, dodaje się zarówno dwie aminopuryny, jak i mitomycynę C.

Gdy kultury osiągną OD 600 około 0,3 do 0,4 i po wymaganej jednej godzinie wzrostu z dowolnym zabiegiem, kultury najprawdopodobniej osiągną OD 600 od 0,5 do 0,8 i są gotowe do obrazowania. Zacznij od pipetowania 300 mikrolitrów hodowanych komórek do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Jeżeli pożądane jest obrazowanie błon komórkowych przy rozcieńczeniu od jednego do 1000 jednego miligrama na mililitr barwnika błonowego FM 4 64 do każdej próbki, może być wymagane miareczkowanie FM 4 64 w celu uzyskania pożądanego sygnału fluorescencji.

Typowy zakres miareczkowania wynosi od jednego do 100, od jednego do 1001 do 10 000. Pozostawić próbki na maksymalnie 10 minut lub podczas przygotowywania szkiełka. Jeśli wymagane jest zagęszczenie komórek, przefiltrować komórki za pomocą filtra 0,2 mikrometra z aparatem próżniowym.

Następnie delikatnie zmyj komórki z filtra odpowiednim buforem lub pożywką podczas inkubacji próbek komórek. Z FM 4 64. Przygotuj 1%agros za pomocą jednego x zens, dodając pięć mililitrów bulionu 10 x zen do 45 mililitrów wody destylowanej wraz z 0,5 grama agros i podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aby się rozpuścić.

Niech temperatura aros zrównoważy się w łaźni wodnej do około 65 stopni Celsjusza i narysuj 20 mikrolitrów gatunków. Kończy się 1% stopionym arosem do końcówki pipety. Aros, który jest zbyt gorący, jest trudny do pipetowania i zimny agros zestala się i nie dostanie się do końcówki pipety.

Następnie użyj multitestu 15. Dobrze wsunąć i odpipetować pojedynczą kroplę około jednego do dwóch mikrolitrów roztworu aros do każdego szkiełka. Cóż, aby uformować płytkie podkładki aros, aros natychmiast zestalą się.

Szkiełka są przygotowywane bezpośrednio przed nałożeniem komórek, aby uniknąć odwodnienia, które spowodowałoby, że szkiełka nie nadawałyby się do użytku. Podkładki aros powinny być wyśrodkowane i wypełniać każdą studzienkę, ale mieć minimalną wysokość, aby uniknąć przerwania szkiełka nakrywkowego. Jeśli kropelki są zbyt wysokie lub przypominają pęcherzyki lub jeśli próbka rozprzestrzenia się poza granicę studzienki, po prostu przetrzyj studzienkę do czysta chusteczką kim wipe i nałóż nową podkładkę aros.

Teraz, gdy szkiełko jest gotowe, nałóż całą próbkę o pojemności 300 mikrolitrów, która została wcześniej odłożona w probówce mikrowirówki, na szkiełko z próbką rozprowadzoną na górze każdej podkładki aerodynamicznej. Taka ilość komórek powinna być wystarczająca do pokrycia każdej studzienki na szkiełku. Pozostaw szkiełko załadowane komórkami w temperaturze pokojowej na około 10 minut.

Ten krok pozwoli komórkom osiąść na podkładce agros i stać się nieruchomymi, a tym samym gotowymi do obrazowania pod koniec 10-minutowej inkubacji. Odessać nadmiar pożywki z każdej studzienki bez wyjmowania samych elektrod. Przyłóż szkiełko nakrywkowe do szkiełka, mocno i równomiernie, ale delikatnie dociskając w poprzek obszaru szkiełka, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe przylega do szkiełka i że szkiełko nakrywkowe nie jest uniesione ponad szkiełko.

Przystąpij do obrazowania wielu różnych mikroskopów fluorescencyjnych, które będą działać dobrze. Bardzo ważne jest, aby mieć soczewkę zanurzeniową 100 razy. Laboratorium Simmonsa wykorzystuje mikroskop Olympus BX 61 wyposażony w soczewkę obiektywową o aperturze numerycznej 1,45 x 100 x z zanurzeniem w olejku, odpowiednią do całkowitego odbicia wewnętrznego, mikroskopii fluorescencyjnej lub murawy.

Mikroskop jest również wyposażony w kamerę chłodzoną CCD i łukowe metalowe źródło światła LU 200. Zacznij od ustawienia ostrości komórek za pomocą białego światła. Użyj odpowiedniego filtra dla każdej flory.

Cztery do wykrywania GFP. Użyj wzbudzenia filtra cztery od 60 do 500 i emisji pięć od 10 do pięciu 60 do wykrywania FM 4 64. Użyj wzbudzenia filtra pięć 10 do pięciu 60 i emisji 5 72 do 6 48.

Przechwyć obraz za pomocą odpowiednich filtrów dla każdego piętra. Cztery z oprogramowaniem Slide Book 4.2. Oto kilka reprezentatywnych wyników obrazowania białka naprawy niedopasowania DNA MU L, które zostało translacyjnie połączone z GFP.

Nieleczona kultura kontrolna MU LGFP wykazuje minimalne ogniska, przy czym większość komórek zawiera tylko poziomy cytoplazmatyczne białka fuzyjnego mut LGFP. Jednak większość komórek rosła w obecności dwóch aminopuryny, która naśladuje niedopasowaną zasadę po włączeniu do genomu. Mają ogniska GFP wskazujące, że mutalne białko GFP bierze udział w rozpoznawaniu i naprawie niedopasowanych zasad DNA.

Podobne wyniki uzyskuje się w przypadku szczepu REC A GFP wyhodowanego w obecności mitomycyny C indukującej uszkodzenie DNA. W tym przypadku większość komórek zawiera ognisko rec A GFP po leczeniu mitomycyną C, co wskazuje, że rec A GFP zareagował na uszkodzenie DNA, inicjując proces naprawy bez widocznego leczenia mitomycyną C pho IR. Właśnie pokazaliśmy, jak wizualizować białka naprawcze w żywych, najsubtelniejszych komórkach faciusa. Podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby pamiętać, aby nie spieszyć się i skupić komórki we właściwym skupieniu, co może wymagać trochę praktyki. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.