Name: Naprawa niedopasowania obrazowego i odpowiedzi komórkowe na uszkodzenia DNA u Bacillus subtilis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji kompleksów naprawy DNA w żywych komórkach Bacillus subtilis przy użyciu fuzyjnych białek GFP. Protokół umożliwia obserwację dynamiki naprawy niedopasowań w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr Philinie S. Lee oraz dr Alanowi D. Grossmanowi za wstępne przeszkolenie L.A.S. w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej. Autorzy dziękują również dr Melanie Berkmen oraz dr Hajime Kobayashi za pomoc i wskazówki dotyczące obrazowania. Praca ta była finansowana ze środków startowych College of Literature, Science &amp; Arts oraz Departamentu Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej na Uniwersytecie Michigan.

Hodowla kultur komórkowych do mikroskopii
1. Na jeden lub dwa dni przed obrazowaniem przygotuj szczep B. subtilis zawierający białko fuzyjne translacyjne, które chcesz zwizualizować. Konieczne będzie przeprowadzenie próbnych rund kroków 1A i 1B, aby ustalić, które warunki hodowli zapewniają najlepsze obrazy Twojego szczepu. W większości przypadków komórki powinny być obrazowane w fazie wzrostu wykładniczego.
<ol class="ualpha">
<li>W przypadku niektórych szczepów B. subtilis (w szczególności szczepów, które rosną słabo ze względu na integrację fuzji translacyjnej między genem zainteresowania a GFP w jego locus endogennym), w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów konieczny jest wstępny wzrost przez dwa dni przed obrazowaniem. Pierwszego dnia należy wysiać metodą smugową badany szczep B. subtilis na agar LB z selektywnym antybiotykiem (lub antybiotykami) i inkubować przez noc w temperaturze 30°C. Drugiego dnia należy zaszczepić 100 μl 0,85% roztworu soli fizjologicznej pojedynczą kolonią i wykonać trzy 10-krotne rozcieńczenia seryjne na płytkach z agarem LB (z antybiotykami selektywnymi), wysiewając po 100 μL każdego rozcieńczenia, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 30°C. Trzeciego dnia należy wybrać płytkę z rozcieńczeniem wykazującym lekki wzrost zlewający się komórek. Lekki wzrost zlewający się na płytce zapewni środowisko wzrostowe zdrowym, rosnącym wykładniczo inokulum startowym, co może przynieść doskonałe wyniki obrazowania (patrz krok 4). Krok ten jest szczególnie przydatny w celu uzyskania najwyższej jakości obrazowania błon z użyciem barwnika FM4-64. </li>
<li>Inne szczepy B. subtilis można po prostu nanieść za pomocą sterylnego wymazaka na selektywne podłoże agar LB w celu uzyskania pojedynczych kolonii w dniu poprzedzającym obrazowanie i inkubować przez noc w temperaturze 30°C. Następnego dnia komórki z tej płytki będą wystarczające do wykorzystania jako inokulum do obrazowania (patrz krok 4). UWAGA: W przypadku B. subtilis hodowle nocne w medium płynnym nie są odpowiednie ze względu na połączenie procesów sporulacji i odpowiedzi quorum sensing, co spowoduje wydłużenie fazy lag wzrostu 1.</li>
</ol>
2. W dniu obrazowania, rano, należy wlać 10 mL pożywki S750 1-3 do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 125 mL. 
3. Resuspenduj komórki w ilości do 2 mL pożywki S750, pobierając je z płytki z agarem LB z pojedynczymi koloniami lub lekko zlewającymi się komórkami, aby otrzymać szczepionkę. 
4. Do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 mL pożywki S750 dodaj odpowiednią ilość inokulum komórkowego w pożywce S750, aby uzyskać kulturę o początkowej gęstości optycznej mierzonej przy 600 nm (OD600) wynoszącej ~0,08 do 0,1. Na tym etapie ważne jest zachowanie co najmniej 10-krotnego stosunku powietrza do pożywki. W związku z tym stosujemy od 10 do 12,5 mL zaszczepionej pożywki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 mL.
5. Inkubować każdą kulturę w temperaturze 30°C do momentu, aż gęstość optyczna OD600 osiągnie wartość ~0,5-0,8. Zaleca się stosowanie wytrząsanych łaźni wodnych z prędkością obrotową od 150 do 200 obr./min. Kultury poddawane działaniu czynników uszkadzających DNA lub indukujących niedopasowania powinny znajdować się we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego o wartości OD600 takiej, aby komórki osiągnęły docelową wartość OD600 po dodatkowym okresie wzrostu wymaganym do przeprowadzenia zabiegu (patrz Tabela 1) 
 Na przykład 2-aminopuryna wymaga jednej godziny traktowania, zatem kultura traktowana 2-aminopuryną powinna mieć OD600~0,3-0,4, tak aby jedna godzina traktowania/wzrostu doprowadziła do uzyskania OD600~0,5-0,8, kiedy to komórki będą gotowe do obrazowania. 
Przygotowanie próbek
1. Pipetuj 300 μl hodowli komórek do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
2. Jeśli planowane jest obrazowanie błon komórkowych, do każdej próbki należy dodać barwnik błonowy FM4-64 (Invitrogen) w rozcieńczeniu 1:1000 z roztworu stokowego o stężeniu 1 mg/mL. Aby uzyskać pożądany sygnał fluorescencyjny, konieczne może być przeprowadzenie miareczkowania FM4-64. Typowy zakres miareczkowania obejmuje rozcieńczenia 1:100, 1:1000 oraz 1:10 000.
3. Próbki należy pozostawić w temperaturze pokojowej do dziesięciu minut lub do czasu przygotowania preparatu z 1% agarozą w medium Spizizens 1X, zgodnie z opisem poniżej (patrz krok 1 sekcji „przygotowanie preparatu”).
4. Jeśli wymagane jest zagęszczenie komórek, zalecamy ich filtrowanie za pomocą filtra 0,2 μm z wykorzystaniem aparatu próżniowego. Przed wizualizacją komórki można delikatnie wypłukać z powierzchni filtra za pomocą PBS, innego odpowiedniego buforu lub pożywki.
Przygotowanie preparatu
1. Przygotuj 1% agarozę w 1X buforze Spizizens. Do 45 ml ddH2O dodaj 5 mL 10X roztworu stokowego buforu Spizizens oraz 0,5 g agarozy, a następnie rozpuść w mikrofalówce. Gorąca, stopiona agaroza jest trudna do pipetowania, natomiast agaroza zestalona nie wejdzie do końcówki pipety. Agarozę należy inkubować w łaźni wodnej do osiągnięcia temperatury ~55-65°C, aby można było ją pobrać pipetą bez ryzyka zestalenia się wewnątrz końcówki.
2. Pobierz 20 μl Spizizens z 1% roztopionej agarozy do końcówki pipety. Nanieś pojedynczą kroplę (około 1-2 μL) roztworu agarozy do każdej studzienki szkiełka (używamy szkiełek z 15 studzienkami, patrz Tabela 2), aby utworzyć płytkie podkładki agarowe. Agaroza stężeje natychmiast. Szkiełka muszą być przygotowane bezpośrednio przed naniesieniem komórek. Jeśli podkładki agarowe zostaną pozostawione w temperaturze pokojowej, mogą odwodnić się w ciągu kilku minut i stać się niezdatne do użytku. 
Podkładki agarowe powinny być wycentrowane i wypełniać każdą studzienkę, ale mieć minimalną wysokość, aby uniknąć przesunięcia szkiełka coverslip; jeśli krople są zbyt wysokie (przypominają pęcherzyki) lub jeśli próbka rozleje się poza granicę studzienki, należy po prostu oczyścić studzienkę za pomocą chusteczki Kimwipe i nanieść nową podkładkę agarową.
3. Nanieś całą 300 μl próbkę (patrz krok 6) na slajd, rozprowadzając ją na powierzchni każdego podkładu agarozowego. Taka ilość komórek powinna być wystarczająca, aby pokryć każde okienko na slajdzie.
4. Pozostawić preparat z załadowanymi komórkami w temperaturze pokojowej (23°C) przez około dziesięć minut. Krok ten pozwoli komórkom osiąść na podkładce agarozowej, unieruchomić się i przygotować do obrazowania. W zależności od specyficznych potrzeb temperaturę tę może być konieczne zmienić, na przykład podczas przeprowadzania eksperymentów wymagających zmiany temperatury4.
5. Odessaj nadmiar pożywki z każdego dołka, nie usuwając samych wkładów.
6. Nałóż szkiełko zakrywające na preparat, dociskając je mocno i równomiernie, lecz delikatnie, na całej powierzchni szkiełka. Upewnij się, że szkiełko zakrywające przylega do preparatu i nie jest od niego uniesione.
Wizualizacja komórek
1. Odpowiednie będą wiele różnych mikroskopów fluorescencyjnych. Kluczowe jest posiadanie obiektywu imersyjnego 100X. Laboratorium Simmonsa używa:
<ul>
 <li>Mikroskop Olympus BX61 wyposażony w obiektyw imersyjny 100X do TIRFM o aperturze numerycznej (NA) 1,45</li>
 <li>Chłodzona kamera CCD Hamamatsu ORCAR2</li>
 <li>Źródło światła łukowe metaliczne Lumen 200 (Prior)</li>
 <li>Do detekcji GFP (FITC) zastosowano filtr wzbudzenia 460-500 i emisji 510-560</li>
 <li>Do detekcji FM4-64 (TRITC) zastosowano filtr wzbudzenia 510-560 i emisji 572-648</li>
 <li>Obrazy zarejestrowano przy użyciu programu SlideBook 4.2 (Rysunek 1)</li>
</ul>
2. Ustaw ostrość na komórki, korzystając ze światła białego.
3. Wykonać obrazowanie, stosując odpowiednie filtry dla każdego fluoroforu.
Reprezentatywne wyniki
Przedstawiono reprezentatywne obrazy (Rysunek 1). Ogniska GFP powinny być wyraźnie zdefiniowane, natomiast barwienie FM4-64 powinno być jasne i klarowne 4-7. Obrazy GFP lub błon mogą zostać poddane pseudokolorowaniu dowolnym kolorem, aby umożliwić prezentację obrazu najwyższej jakości bez utraty jakichkolwiek danych.
<img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Mikroskopowy obraz komórki bakteryjnej przedstawiający białka znakowane GFP z 2AP/MMC, analiza fluorescencyjna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Reprezentatywne obrazy GFP białek fuzyjnych translacyjnych B. subtilis. Białka GFP przedstawiono na zielono, natomiast barwienie błony FM4-64 na czerwono. Biały pasek skali wskazuje 3 μm. (A) MutS-GFP [odpowiedni genotyp: mutS-gfp (spc), amyE::PspacmutL (cat)] w obecności 600 μg/mL 2-aminopuryny i 1 mM IPTG. Sygnał FM4-64 nie został przedstawiony, aby wyraźniej ukazać ogniska MutS-GFP. (B) MutL-GFP [odpowiedni genotyp: mutL::mutL-GFP (spc)] w obecności 2-aminopuryny. (C) DnaX-GFP [odpowiedni genotyp: dnaX::dnaX-GFP (spc)]. (D) RecA-GFP [odpowiedni genotyp: recA::recA-GFP (spc)] w obecności 20 ng/mL mitomycyny C. (E) TagC-GFP [odpowiedni genotyp: tagC::tagC-GFP (spc)] w obecności 1 μg/mL mitomycyny C. 

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>Metoda traktowania / stężenie lub ilość</td>
 <td>Funkcja</td>
 <td>Czas inkubacji</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mitomycyna C (MMC) [20–150 ng/ml]</td>
 <td>Agent alkilujący DNA</td>
 <td>1 godzina</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-aminopuryna (2-AP) [600 μg/mL]</td>
 <td>indukujący niedopasowania</td>
 <td>1 godzina</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydroksymocznik (HU)</td>
 <td>wyczerpuje dNTP</td>
 <td>3 godziny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>światło ultrafioletowe (UV) 20 J/m2</td>
 <td>Dimery tymina-tymina i fotoprodukty 6-4</td>
 <td>zależne od źródła, zazwyczaj 20 sekund</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>greje (promieniowanie jonizujące) od 5 do 100 Gy</td>
 <td>Pęknięcia dwuniciowe, pęknięcia jednoniciowe i miejsca uszkodzeń zasad</td>
 <td>zależy od źródła </td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 1. Podsumowanie zabiegów uszkadzających DNA i indukujących niedopasowania

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody >
 <tr>
 <td>Nazwa odczynnika</td>
 <td>Firma</td>
 <td>Numer katalogowy</td>
 <td>Uwagi (opcjonalnie)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slajd wielotestowy, 15-dołkowy</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>6041505E</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>12-544-B</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agaroza</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP160-500</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mitomycyna C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M0503-2MG</td>
 <td>mutagen, używać rękawiczek</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-aminopuryna</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A3509-250MG</td>
 <td>rękawiczki</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydroksymocznik</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H8627-25G</td>
 <td>rękawiczki</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FM4-64</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>T13320</td>
 <td>wrażliwy na światło</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2. Lista specyficznych odczynników i sprzętu:

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

Aby uzyskać obrazy najwyższej jakości dla każdego szczepu, konieczne jest przeprowadzenie prób i błędów w celu znalezienia odpowiednich warunków ekspozycji; ustaliliśmy, że czas 1 milisekundy jest odpowiedni dla obrazów w świetle białym, natomiast czasy ekspozycji od 100 do 2000 ms są odpowiednie dla obrazów GFP (FITC) i FM4-64 (TRITC). Czas ekspozycji będzie się różnić w zależności od użytego sprzętu obrazującego. Dla najprostszej analizy zalecamy stosowanie jednego szczepu na szkiełko mikroskopowe z 15 dołkami, poniewa...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Specyficzne receptury roztworów&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;:</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10x S7&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; sole&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 0,5 M MOPS&lt;br/&gt; 100 mM siarczan amonu&lt;br/&gt; 50 mM fosforan potasu jednodobazowy&lt;br/&gt; Przefiltrować przez sterylizator i zawinąć S7&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; pożywki owinięte folią przed przechowywaniem</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;100x Metale&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 0,2 M MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 70 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 5 mM MnCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 0,1 mM ZnCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 100 &amp;#x03BC;g/ml NaCl tiaminy&lt;br/&gt; 2 mM HCl&lt;br/&gt; 0,5 mM FeCl3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;*&lt;br/&gt; dH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to objętość końcowa&lt;br/&gt; FeCl₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; należy dodać na samym końcu, aby zapobiec wytrąceniu.&lt;br/&gt; Po sterylizacji przez filtr owinąć roztwór Metal 100x folią.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;S7&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; pożywki&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 1x S7&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; sole&lt;br/&gt; 1x Metal&lt;br/&gt; 1% glukozy&lt;br/&gt; 0,1% glutaminianu&lt;br/&gt; 40 &amp;#x03BC;g/ml tryptofanu&lt;br/&gt; 40 &amp;#x03BC;g/ml fenyloalaniny&lt;br/&gt; destylowana H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to objętość końcowa</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10x Spizizens (g/L)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 151,4 mM siarczanu amonu (20 g/L)&lt;br/&gt; 803,8 mM fosforan potasu jednododatkowy (140 g/L)&lt;br/&gt; 440,9 mM fosforan potasu dwuzasadowy (60 g/L)&lt;br/&gt; 34,0 mM cytrynian sodu (10 g/L)&lt;br/&gt; 16,6 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (2 g/L)&lt;br/&gt; dH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to objętość końcowa&lt;br/&gt; Sterylizować przez filtrowanie</td></tr></tbody></table>

obrazowanie naprawy niedopasowań oraz odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia dna w bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Zarówno prokarionty, jak i eukarionty reagują na uszkodzenia DNA poprzez złożony zestaw zmian fizjologicznych. Zmiany w ekspresji genów, redystrybucja istniejących białek oraz montaż nowych kompleksów białkowych mogą być stymulowane przez różnorodne uszkodzenia DNA i niedopasowane pary zasad DNA. Mikroskopia fluorescencyjna służy jako potężne narzędzie eksperymentalne do wizualizacji i kwantyfikacji tych oraz innych odpowiedzi na uszkodzenia DNA, a także do monitorowania stanu replikacji DNA w obrębie złożonej architektury podkomórkowej żywej komórki. Fuzje translacyjne między fluorescencyjnymi białkami reporterowymi a komponentami aparatu replikacji i naprawy DNA były wykorzystywane do określenia sygnałów, które kierują białkami naprawczymi DNA do ich swoistych miejsc uszkodzeń.in vivooraz aby zrozumieć, w jaki sposób białka te są zorganizowane wewnątrz komórek bakteryjnych. Ponadto fuzje transkrypcyjne i translacyjne połączone z promotorami indukowanymi uszkodzeniami DNA pozwoliły ujawnić, które komórki w populacji aktywowały odpowiedzi na stres genotoksyczny. W niniejszym przeglądzie przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania montażu kompleksów naprawy DNA i replikacji DNA w pojedynczych komórkach bakteryjnych. W szczególności praca ta skupia się na obrazowaniu białek naprawy niedopasowań, rekombinacji homologicznej, replikacji DNA oraz białka indukowanego systemem SOS wBacillus subtilisWszystkie opisane tutaj procedury można z łatwością zastosować do obrazowania kompleksów białkowych w różnych gatunkach bakterii.

Opisano szczegółowy protokół obrazowania w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksów naprawy DNA w komórkach Bacillus subtilis.

Obrazowanie naprawy niedopasowań oraz odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA w Bacillus subtilis

Zarówno prokarionty, jak i eukarionty reagują na uszkodzenia DNA poprzez złożony zestaw zmian fizjologicznych. Zmiany w ekspresji genów, redystrybucja ...

Szczepy Baus TLU zawierające fuzje translacyjne białek naprawy niedopasowań. Białka połączone z GFP są wysiewane na podłoża selekcyjne. Wyizolowane komórki służą jako świeży inokulum do hodowli w cieczy.Komórki hoduje się do osiągnięcia OD 600 na poziomie 0,3 do 0,4, po czym stosuje się pożądane zabiegi indukujące niedopasowanie i kontynuuje hodowlę, aż do osiągnięcia OD 600 w zakresie 0,5 do 0,8, po czym komórki są pobierane. Jeśli jest to wymagane, dodaje się barwnik do błon FM 4 64, a następnie nanosi komórki na szkiełka z przygotowanymi podkładkami agarozowymi i pozwala im osiaść po usunięciu nadmiaru pożywki poprzez aspirację.Nakłada się szkiełko cover slip, a następnie komórki są wizualizowane za pomocą mikroskopii. Dzień dobry, jestem dr Andrew Kow z laboratorium dr. Lyle'a Simmonsa w Katedrze Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej na Uniwersytecie Michigan w Ann Arbor. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykorzystywaną do wizualizacji fuzji translacyjnych białek naprawy niedopasowań DNA, a także innych białek naprawczych i rybosomalnych w bacillus solus.Niniejszą procedurę stosujemy do badania interakcji między białkami naprawy niedopasowań DNA a białkami rybosomalnymi w żywych komórkach Bacillus subtilis. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować szczepy B. subtilis zawierające białko fuzji translacyjnej, które w przypadku niektórych szczepów chcemy zwizualizować.Wystarczy rozpocząć hodowlę na jeden dzień przed obrazowaniem. Przykładami są szczepy, które dobrze rosną, gdy fuzja translacyjna GFP z genem zainteresowania zostaje wprowadzona do endogennego locus genu, np. MU LGFP. Rozpoczynając hodowlę na jeden dzień przed obrazowaniem, należy użyć sterylnego wymazówki w warunkach sterylnych, aby nanieść bakterie na płytki z selektywnym podłożem LB agro.Aby wyhodować pojedyncze kolonie, inkubuj je przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza; następnego dnia kolonie zostaną wykorzystane jako inokulum startowe. Niektóre szczepy B sublist wymagają dwudniowego wzrostu przed badaniem mikroskopowym w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów. Szczepy wymagające dwóch dni wzrostu to te, które rosną słabo z powodu fuzji translacyjnej, takie jak rec A GFP. Pierwszego dnia wyseij bakterie na selektywne podłoże LB AED i inkubuj przez noc.Drugiego dnia wykonaj rozcieńczenia seryjne. Najpierw wybierz pojedynczą kolonię, aby zaszczepić 100 µL 0,85% soli fizjologicznej, następnie wykonaj cztery dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne. Wysew 100 µL każdego rozcieńczenia w soli fizjologicznej, a także początkowej kolonii i samej soli fizjologicznej na agar LB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków selektywnych. Inkubuj płytki przez noc, zazwyczaj w temperaturze 30 °C. Po drugiej nocnej inkubacji wybierz płytkę z rozcieńczeniem, na której widoczny jest lekki, zlewający się wzrost komórek.Zapewniają one zdrowe, eksponencjalnie rosnące inoculum startowe, co może przynieść doskonałe wyniki obrazowania. Jest to szczególnie przydatne w przypadku najwyższej jakości obrazowania barwienia błon. W przypadku użycia FM 4 64, rano w dniu obrazowania, należy wlać 10 ml medium S seven 50 do sterylnej kolby o pojemności 125 ml.W ten sposób utrzymuje się co najmniej dziesięciokrotny stosunek powietrza do medium. Resuspenduj komórki w maksymalnie 2 ml medium S seven 50 z probówki z pojedynczymi koloniami lub komórkami o podobnej konfluencji, aby uzyskać inokulum. Dodaj odpowiednią ilość inokulum komórkowego w medium S seven 50 do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 ml medium S seven 50, tak aby kultura miała początkową wartość OD 600 wynoszącą około 0,08 do 0,1.Następnie należy hodować każdą kulturę w temperaturze odpowiedniej dla szczepu z podlisty B, który ma zostać poddany obrazowaniu. Zaleca się stosowanie shaking water baths z prędkością obrotową od 150 do 200 obr./min. Hodowlę należy kontynuować do momentu, aż kultury osiągną OD 600 na poziomie około 0,5 do 0,8.W przypadku kultur poddanych działaniu czynników uszkadzających DNA lub indukujących niedopasowania, należy zaplanować proces tak, aby koniec okresu inkubacji z czynnikiem modyfikującym DNA zbiegał się z momentem osiągnięcia docelowej wartości OD 600. Na przykład 2-aminopuryna, analog DNA, która po wbudowaniu w genom naśladuje niedopasowaną zasadę, wymaga jednej godziny inkubacji i prowadzi do tworzenia się ognisk białek naprawy niedopasowań, takich jak mutLGFP. Z kolei tworzenie ognisk RecA-GFP wymaga jednej godziny inkubacji z mitomycyną C lub innym odczynnikiem uszkadzającym DNA w celu indukcji pęknięć dwuniciowych DNA; zarówno 2-aminopurynę, jak i mitomycynę C należy dodać do hodowli.Gdy hodowle osiągną OD 600 na poziomie około 0,3 do 0,4, a po wymaganym czasie jednej godziny wzrostu z zastosowaniem którejkolwiek z metod, hodowle prawdopodobnie osiągną OD 600 od 0,5 do 0,8 i będą gotowe do obrazowania. Należy zacząć od pipetowania 300 µL hodowli komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Jeśli planowane jest obrazowanie błon komórkowych przy rozcieńczeniu 1:1000 barwnika błonowego FM 4 64 o stężeniu 1 mg/mL do każdej próbki, może być konieczne przeprowadzenie miareczkowania FM 4 64 w celu uzyskania pożądanego sygnału fluorescencji.Typowy zakres miareczkowania wynosi od 1:100 do 1:10 000. Pozostaw próbki na maksymalnie 10 minut lub na czas przygotowywania preparatu na szkiełku. Jeśli wymagane jest określenie stężenia komórek, przefiltruj je za pomocą filtra o rozmiarze 0,2 µm z wykorzystaniem aparatury próżniowej.Następnie, podczas inkubacji próbek komórek, delikatnie wypłucz komórki z filtra, używając odpowiedniego buforu lub medium z FM 4 64. Przygotuj 1% agros z roztworem 1x zens, dodając pięć mililitrów roztworu 10x zens do 45 mililitrów wody destylowanej oraz 0,5 grama agros, a następnie podgrzej w kuchence mikrofalowej do stopienia.Pozostaw agar w łaźni wodnej, aż jego temperatura wyrówna się do około 65 °C, a następnie pobierz 20 µL agaru. Należy pobrać 1% stopionego agaru do końcówki pipety. Agar zbyt gorący jest trudny do pipetowania, natomiast zbyt zimny krzepnie i nie wniknie do końcówki pipety.Następnie należy użyć szkiełka z 15 dołkami typu multitest i nanieść pipetą pojedynczą kroplę około 1–2 µL roztworu aros do każdego dołka, aby utworzyć płytkie podkładki aros; aros stężeje natychmiast.Preparaty na szkiełkach przygotowuje się bezpośrednio przed naniesieniem komórek, aby uniknąć ich odwodnienia, co uczyniłoby szkiełka niezdatnymi do użytku. Podkładki aros powinny być wycentrowane i wypełniać każdą studzienkę, ale mieć minimalną wysokość, aby nie przesunąć szkiełka nakrywnego. Jeśli krople są zbyt wysokie, przypominają pęcherzyki powietrza lub jeśli próbka rozleje się poza granicę studzienki, należy po prostu wytrzeć studzienkę chusteczką kim wipe i nałożyć nową podkładkę aros.Gdy preparat jest już gotowy, nanieś całą 300 µL próbkę, którą wcześniej odstawiono do probówki do mikrowirówki, na slajd, rozdzielając materiał na górnej powierzchni każdego pola aeros. Taka ilość komórek powinna być wystarczająca do pokrycia każdej studzienki na slajdzie. Pozostaw slajd z naniesionymi komórkami w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.Ten etap pozwoli komórkom osiąść na podkładce agros, unieruchomić się i w konsekwencji stać się gotowymi do obrazowania po zakończeniu 10 minutowej inkubacji. Odessaj nadmiar medium z każdej studzienki, nie usuwając samych podkładek. Nałóż szkiełko nakrywkę na preparat, dociskając ją mocno i równomiernie, lecz delikatnie na całej powierzchni szkiełka; upewnij się, że szkiełko nakrywka przylega do preparatu i nie jest nad nim uniesiona.Do obrazowania można użyć wielu różnych mikroskopów fluorescencyjnych. Niezbędne jest zastosowanie obiektywu imersyjnego 100 x. Laboratorium Simmonsa korzysta z mikroskopu Olympus BX 61 wyposażonego w obiektyw imersyjny 100 x o aperturze numerycznej 1,45, odpowiedni do całkowitego wewnętrznego odbicia, mikroskopii fluorescencyjnej lub TIRF.Mikroskop jest również wyposażony w chłodzoną kamerę CCD oraz metalohalogenowe źródło światła LU 200. Należy rozpocząć od ustawienia ostrości obrazu komórek przy użyciu białego światła. Dla każdej flory należy zastosować odpowiedni filtr.Cztery do detekcji GFP. Do detekcji FM 4 64 należy użyć filtra wzbudzenia 460 do 500 i emisji 510 do 560. Użyć filtra wzbudzenia 510 do 560 i emisji 572 do 648.Należy zarejestrować obraz, używając odpowiednich filtrów dla każdej warstwy. Wykorzystano do tego oprogramowanie Slidebook 4.2. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazowania białka naprawy niedopasowań DNA MU L, które zostało fuzyjnie połączone z białkiem GFP.Nieleczona kultura kontrolna MU LGFP wykazuje minimalną liczbę ognisk, przy czym większość komórek zawiera białko fuzyjne mut LGFP jedynie na poziomie cytoplazmatycznym. Jednak większość komórek hodowanych w obecności 2-aminopuryny, która po wbudowaniu w genom naśladuje niedopasowaną zasadę, posiada ogniska GFP, co wskazuje, że białko mutal GFP bierze udział w rozpoznawaniu i naprawie niedopasowanych zasad DNA.Podobne wyniki uzyskuje się w przypadku szczepu REC A GFP hodowanego w obecności mitomycyny C, leku indukującego uszkodzenia DNA. W tym przypadku większość komórek po zastosowaniu mitomycyny C wykazuje obecność ogniska rec A GFP, co wskazuje na odpowiedź rec A GFP na uszkodzenia DNA i rozpoczęcie procesu naprawy; bez zastosowania mitomycyny C nie obserwuje się pho IR. Przedstawiliśmy właśnie sposób wizualizacji białek naprawczych w żywych komórkach facius subtlest. Podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby nie spieszyć się i starannie ustawić ostrość obrazu komórek; osiągnięcie tego może wymagać pewnej wprawy. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie Naprawy Niedopasowania i Reakcje Komórkowe na Uszkodzenie DNA w Bacillus subtilis

Przedstawiamy procedurę, w której dwuwymiarowa analiza w żelu agarozowym może zostać wykorzystana do identyfikacji struktury produktów pośrednich replikacji powstających po napromieniowaniu UV.

Wizualizacja indukowanych promieniami UV produktów pośrednich replikacji w E. coli przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Poznaj metodę wizualizacji kompleksów naprawy DNA w żywych komórkach Bacillus subtilis przy użyciu fuzyjnych białek GFP. Protokół umożliwia obserwację dynamiki naprawy niedopasowań w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie naprawy niedopasowań oraz odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA w Bacillus subtilis

Przeglądaj więcej filmów