Rozszyfrowywanie ścieżek aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej pisklącia z wykorzystaniem elektroporacji in ovo
May 2nd, 2010
Ten film pokazuje, jak wizualizować ścieżki aksonalne genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym pisklęcia, wykorzystując in ovo elektroporację genów reporterowych pod kontrolą określonych elementów wzmacniających.
Cześć, jestem Ham i pracuję w laboratorium Dr.Review Klar na wydziale neurobiologii medycznej na Uniwersytecie Hebrajskim w Jerozolimie. Cześć, nazywam się Sophie Esman i również pochodzę z laboratorium Larsa. Dzisiaj pokażemy Wam procedurę Innovo, elektroporację i przygotowanie otwartej książki rdzenia kręgowego.
Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania trajektorii aksonalnych genetycznie zdefiniowanej populacji neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym. Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś zapłodnione jaja kurze z białego leghornu z temperatury pokojowej do wilgotnego inkubatora, najlepiej z tacami bujanymi w temperaturze od 37 do 38 stopni Celsjusza.
Ważne jest, aby monitorować temperaturę i wilgotność w inkubatorze w celu uzyskania żywotnych i zsynchronizowanych zarodków. Zarodki piskląt są elektroporowane, gdy osiągną etap hamburgera i Hamiltona lub HH od 18 do 20, który jest optymalnym etapem dla ekspresji specyficznej dla uzależnienia od wzmacniacza. Na tym etapie głowa leży pod kątem prostym do tułowia.
Również w stadium HH od 18 do 20 powinien być również widoczny szeroki zestaw dodatkowych naczyń krwionośnych zarodka, takich jak przednie, tylne prawe i lewe naczynia linii życiowej. Zarodki piskląt osiągają stopień HH od 19 do 20 po 66 godzinach inkubacji i w tym czasie wyjmują jaja z inkubatora Po wyjęciu jaj ułóż je poziomo i odczekaj od pięciu do 10 minut. Zarodek znajduje się teraz w górnym biegunie komórki jajowej.
Przed elektrolityzacją zarodki przygotowują roztwór Hanka zawierający 100 jednostek na mililitr penicyliny i 0,1 miligrama na mililitr streptomycyny. Przygotuj pożądaną mieszaninę DNA w ilości od dwóch do pięciu mikrogramów na mikrolitr i dodaj kilka ziaren szybkiego zielonego barwnika, aby ułatwić wizualizację wstrzykniętego DNA. Przygotuj pipetę do ust, sterylną igłę do strzykawki, małe nożyczki i taśmę.
Przygotuj mikrokapilary, pociągając szklane kapilary o średnicy 0,5 milimetra za pomocą ściągacza do pipet. Umieść elektrody wolframowe w mikromanipulatorach i podłącz elektrody do generatora impulsów. Ustaw napięcie w generatorze impulsów na minus 30 woltów, długość każdego impulsu na 50 milisekund, a liczbę impulsów na trzy.
Przystąp do elektroporacji przed wystawieniem i obchodzeniem się z zarodkami. Włóż strzykawkę do wąskiego bieguna jajka i usuń od pięciu do sześciu mililitrów albuminy z każdego jajka. Albumina jest usuwana, aby uniknąć jej rozlania.
Podczas cięcia w następnym kroku użyj małych nożyczek do cięcia. Otwórz owalne okienko w górnej części jaja po odsłonięciu zarodka pisklęcia, zwilż je 0,5 do jednego mililitra roztworu motków i penicyliny streptomycyny. Następnie użyj ust, aby załadować szklaną mikrokapilę.
W przypadku mieszaniny barwników DNA mikrokapilara o odpowiedniej średnicy powinna łatwo załadować się DNA. W pozycji obuocznej zarodek do wstrzyknięcia DNA do cewy nerwowej. Umieść zarodek ogonem do siebie.
Na tym etapie rozwoju rdzeń kręgowy jest wyraźnie widoczny i dlatego nie są wymagane żadne techniki kontrastowe. Rdzeń kręgowy jest uszczelniony zarówno na głowie, jak i na końcu ogona. Jednak w przypadku mikrokapilarni przebijającej więcej otworów w cewie nerwowej i penetrujących ją pod płytkim kątem, mikrokapilara, która jest wystarczająco cienka i o odpowiedniej średnicy, powinna wniknąć w rurkę bez jej uszkodzenia.
Wstrzyknij DNA za pomocą ust perpet. Mikrokapilara o odpowiedniej średnicy powinna uwalniać DNA przy regularnym wydechu. Zielony barwnik powinien rozprzestrzeniać się od czubka ogona do pęcherzyków rozwijającego się mózgu.
Wstrzykiwać, aż cewa nerwowa zostanie wypełniona DNA, elektroporacja jest wymagana, aby wstrzyknięte DNA dostało się do komórek w pierwszej kolejności. Umieść elektrody równolegle do cewy nerwowej i jak najbliżej niej, nie dotykając samej rurki. Upewnij się, że elektrody są pokryte cieczą, aby umożliwić przewodność elektryczną podczas impulsu.
Zwykle wystarczy roztwór Hanka dodany natychmiast po wystawieniu zarodka. Ale jeśli nie jedna kropla roztworu Hanka tuż przed impulsem z elektrodami ustawionymi i zanurzonymi w impulsie cieczy do działania elektrycznego, ostrożnie usuń elektrody i uszczelnij okno i jajko taśmą. Ważne jest, aby całkowicie zapieczętować jajo, aby zapobiec wysuszeniu zarodka podczas następnego okresu inkubacji.
Umieścić jajo z powrotem w inkubatorze i inkubować, aż zarodek pisklęcia osiągnie rozwojowy poziom embrionalny. Dzień szósty lub szósty, kiedy nadchodzi czas na obrazowanie, gdy elektropostowany zarodek osiągnął rozwojowy zarodek. Dzień szósty, E sześć trzy dni po elektroporacji, usuń go z jaja i umieść na pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS za pomocą cienkich nożyczek.
Odetnij błony i rozciągnij zarodek po jego brzusznej stronie za pomocą szpilek wbitych w silikon, aby utrzymać go na miejscu. Za pomocą ostrej mikrokapilary wolframowej. Wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż płyty dachowej od tylnej części mózgu w dół do ogona.
Wykonaj dwa dodatkowe podłużne nacięcia po obu stronach rdzenia kręgowego, odłączając zwoje korzenia grzbietowego lub DRG od rdzenia kręgowego. Odłącz płytkę podłogową od tkanki, zaczynając od ogona do tylnej części mózgu, pozostawiając rdzeń kręgowy nienaruszony. Na koniec użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć rdzeń kręgowy w przekroju poprzecznym w tylnej części mózgu i oddzielić rdzeń kręgowy od ciała.
Teraz, gdy rdzeń kręgowy został wyizolowany, rozprowadź go na nowej pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS, używając szpilek do przytrzymywania go od tylnej części mózgu do ogona, tworząc płaski preparat do mocowania. Utrwalić rdzeń kręgowy w 4% paraldehydzie w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej barwienia immunologicznego zgodnie z procedurą immunohistochemiczną, szczegółowym i dołączonym pisemnym protokołem montażu rdzenia kręgowego w pozycji otwartej. Przygotowanie książki do obrazowania.
Rozprowadź smar lub silikon w kształcie prostokąta na szkiełku i wlej PBS w prostokąt. Za pomocą pęsety umieść rdzeń kręgowy, rozciągnij środek prostokąta i wyciągnij płyn wokół niego. Z makaronem na zwierzę umieść jedną lub dwie krople podłoża montażowego na rdzeniu kręgowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
Docisnąć szkiełko nakrywkowe. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Trzymaj szkiełka w ciemności w czterech stopniach Celsjusza.
Sprawdź rdzeń kręgowy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Oto kilka reprezentatywnych wyników odrzucenia aksonów neuronów międzyrdzeniowych piskląt w eksperymentach kontrolnych, w których RFP jest wyrażane we wszystkich neuronach wykorzystujących wszechobecny element wzmacniający z CMV, większość neuronów i ich aksonów jest oznakowana. Niemożliwe jest rozszyfrowanie trajektorii aksonalnej subpopulacji neuronalnych.
Jednak przy zastosowaniu określonych elementów wzmacniających ujawnia się zdefiniowany szlak aksonalny określonej subpopulacji DI dwóch neuronów w tym przykładzie. Właśnie pokazaliśmy, jak elektrochirurgicznie operować cewę nerwową policzka za pomocą specyficznego wzmacniacza neuronalnego w punkcie E trzecim i jak przygotować rdzeń kręgowy w kształcie otwartej książki w punkcie E szóstym. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności i cierpliwości.
Więc to jest to. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach. Powodzenia.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To wideo demonstruje procedurę wizualizacji ścieżek aksonowych genetycznie zdefiniowanych neuronów w rdzeniu kręgowym zarodka kurczaka przy użyciu elektroporacji in ovo. Metoda ta pozwala badaczom skutecznie badać trajektorie aksonowe.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwojowa
- Elektrofizjologia
Tło
- Rozumienie ścieżek aksonowych jest kluczowe dla badań neuronaukowych.
- Elektroporacja in ovo jest techniką stosowaną do wprowadzania genów reporterowych.
- Zarodek kręgowca kurczaka służy jako model do badania rozwoju neuronów.
- Genetycznie zdefiniowane populacje neuronów mogą dostarczyć wglądu w konkretne obwody neuronowe.
Cel badania
- Wizualizacja ścieżek aksonowych w rdzeniu kręgowym zarodka.
- Wykorzystanie elektroporacji in ovo do badań ekspresji genów.
- Zgłębienie rozumienia rozwoju i łączności neuronów.
Stosowane metody
- Przeniesienie zapłodnionych jaj kurzych do inkubatora skondycjonowanego powietrza.
- Utrzymanie inkubacji w temperaturze 37 do 38 stopni Celsjusza.
- Przeprowadzenie elektroporacji in ovo w celu wprowadzenia genów reporterowych.
- Przygotowanie preparatów otwartej książki rdzenia kręgowego do wizualizacji.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja ścieżek aksonowych w rdzeniu kręgowym.
- Demonstracja skuteczności elektroporacji in ovo.
- Wgląd w trajektorie genetycznie zdefiniowanych populacji neuronów.
- Ustanowienie niezawodnej metody badania rozwoju neuronów.
Wnioski
- Metoda ta dostarcza cennego narzędzia do badań neuronaukowych.
- Elektroporacja in ovo jest skuteczna w dostarczaniu genów w modelach zarodkowych.
- Rozumienie ścieżek aksonowych może informować badania nad tworzeniem obwodów neuronowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
