Name: Rozszyfrowywanie ścieżek aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej pisklącia z wykorzystaniem elektroporacji in ovo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-02T20:17:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in ovo do wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych neuronów w rdzeniu kręgowym pisklęcia. Technika ta umożliwia badanie trajektorii neuronalnych w neurobiologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty przyznane AK przez Izraelską Fundację Naukową (Israel Science Foundation), Izraelskie Ministerstwo Zdrowia oraz DFG (Niemiecką Fundację Badawczą).

I. Elektroporacja
Obsługa jaj
<ol>
 <li>Umieść jaja w nawilżanym inkubatorze ustawionym na 37-38°C, najlepiej w inkubatorze z tacek kołyszących.</li>
 <li>Elektroporację zarodków przeprowadza się po około 66 godzinach inkubacji, gdy osiągną one stadium 18-20 według Hamburgera i Hamiltona (HH). Na tym etapie głowa znajduje się pod kątem prostym względem tułowia (stan ten nazywa się zgięciem szyjnym), a widoczny powinien być rozległy układ pozazarodkowych naczyń krwionośnych, takich jak przednie, tylne, prawe i lewe żyły witelinowe. Jest to optymalne stadium dla specyficznej ekspresji zależnej od enhansera 1,3,4. Ważne jest monitorowanie temperatury i wilgotności inkubatora, aby uzyskać żywotne i zsynchronizowane zarodki.</li>
 <li>Po 66 godzinach inkubacji wyjmij jaja z inkubatora. Ułóż jaja poziomo. Odczekaj 5-10 minut. Zarodek znajduje się teraz w górnym biegunie jaja.</li>
</ol>
Przygotowania
<ol>
 <li>Przygotować roztwór Hanksa z penicyliną/streptomycyną (P/S) (rozcieńczenie 1:100).</li>
 <li>Wytciągnąć kapilary szklane (średnica 0,5 mm) do formy mikrokapilar.</li>
 <li>Umieścić elektrody (wolframowe) w mikromanipulatorze i podłączyć elektrody do generatora impulsów (ECM 830).</li>
 <li>Ustawić generator impulsów zgodnie z następującymi parametrami: napięcie 30v, liczba impulsów - 3, czas trwania impulsu 50 ms.</li>
 <li>Przygotować pipetę ustną, igłę strzykawki oraz taśmę.</li>
 <li>Przygotować odpowiednią mieszaninę DNA (2-5μg/μl) i dodać barwnik Fast Green.</li>
</ol>
Wycinanie okienka i elektroporacja
<ol>
 <li>Za pomocą strzykawki usunąć 5-6 ml albuminy z każdego jaja.</li>
 <li>Małymi nożyczkami wyciąć owalne okienko w górnej części jaja.</li>
 <li>Nawilżyć embrion 0,5-1 ml roztworu Hank's + P/S.</li>
 <li>Za pomocą pipety ustnej napełnić szklaną mikrokapilarę mieszaniną DNA.</li>
 <li>Ułożyć embrion tak, aby jego ogon był skierowany w stronę operatora. Na tym etapie rdzeń kręgowy embrionu jest wyraźnie widoczny, w związku z czym techniki kontrastowe nie są wymagane. Rdzeń kręgowy jest zamknięty na obu końcach (głowie i ogonie), jednak przy zastosowaniu wystarczająco cienkiej mikrokapilary możliwe jest wykonanie małego otworu i wprowadzenie się do rurki neuralnej pod niewielkim kątem. Mikrokapilara o odpowiedniej średnicy powinna dać się łatwo napełnić DNA, przeniknąć przez rurkę bez jej uszkodzenia i uwolnić DNA podczas regularnego wydechu.</li>
 <li>Wstrzyknąć DNA za pomocą pipety ustnej. Zielony barwnik powinien rozprzestrzenić się od koniuszka ogona aż po pęcherzyki rozwijającego się mózgu.</li>
 <li>Umieścić elektrody równolegle do rurki neuralnej, jak najbliżej, unikając jednak dotykania samej rurki, a następnie podać impuls. W momencie podania impulsu elektrody muszą być przykryte cieczą, aby zapewnić przewodnictwo elektryczne. Zazwyczaj ilość roztworu Hank's dodana na początku jest wystarczająca. Jeśli nie, należy dodać jedną kroplę roztworu Hank's bezpośrednio przed impulsem.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć elektrody i zakleić okienko taśmą. Ważne jest całkowite uszczelnienie jaja, aby zapobiec wysychaniu embrionu podczas następnego okresu inkubacji.</li>
 <li>Umieścić jajo z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
II. Przygotowanie rdzenia kręgowego metodą open-book
Oddzielenie rdzenia kręgowego od zarodka
<ol>
 <li>Wyjąć elektroporowany embrion w stadium E6 z jaja i umieścić go w pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS. </li>
 <li>Odciąć błony i rozprostować embrion na stronie brzusznej, używając szpilek do jego unieruchomienia.</li>
 <li>Za pomocą ostrej mikrokapilary wolframowej wykonać nacięcie wzdłużne wzdłuż płytki dachowej, od rąbka mózgu w stronę ogona. </li>
 <li>Wykonać dwa dodatkowe nacięcia wzdłużne po obu stronach rdzenia kręgowego, oddzielając zwoje rdzeniowe tylnych korzeni (DRGs) od rdzenia kręgowego. </li>
 <li>Oddzielić płytkę podłogową od tkanki, zaczynając od ogona w kierunku rąbka mózgu, pozostawiając rdzeń kręgowy nienaruszony.</li>
 <li>Przeciąć rdzeń kręgowy w przekroju poprzecznym na wysokości rąbka mózgu za pomocą precyzyjnych nożyczek i oddzielić go od ciała.</li>
</ol>
Fiksacja
<ol>
 <li>Rozłożyć wyizolowany rdzeń kręgowy w nowej szalce Petriego powleczonej silikonem i zawierającej PBS, używając pinezek do unieruchomienia go od rombencephalonu do ogona, aby przygotować preparat w układzie płaskim.</li>
 <li>Odlać PBS z szalki i zastąpić go 4% paraformaldehydem w buforze fosforanowym (PBS).</li>
 <li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
</ol>
Immunohistochemia
<ol>
 <li>Przenieść utrwalony rdzeń kręgowy do fiolki zawierającej przeciwciało pierwszorzędowe w PBS.</li>
 <li>Inkubować przez noc w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu.</li>
 <li>Przemyć przeciwciało 5 razy w PBS, każde płukanie przez 1 godzinę przy łagodnym mieszaniu.</li>
 <li>Dodać przeciwciało drugorzędowe i inkubować przez noc w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu.</li>
 <li>Przemyć przeciwciało 5 razy w PBS, każde płukanie przez 1 godzinę przy łagodnym mieszaniu.</li>
</ol>
Montaż otwartej książki do obrazowania
<ol>
 <li>Nanieść smar lub silikon w kształcie prostokąta na szkiełko przedmiotowe, a następnie wkroplić do środka PBS.</li>
 <li>Za pomocą pęsety umieścić rozciągnięty rdzeń kręgowy w centrum prostokąta i odessać nadmiar cieczy z jego otoczenia pipetą Pasteura.</li>
 <li>Nanieść 1-2 krople medium montażowego na rdzeń kręgowy i przykryć szkiełkiem nakrywką. Docisnąć, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Przechowywać szkiełka w ciemności w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Poddać rdzeń kręgowy analizie z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>

<ol><li>Zisman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+membrane+capture+of+F-spondin+generates+combinatorial+guidance+cues+from+a+single+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule.</a> J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).</li>
<li>Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths%2C+elongation%2C+and+projections+of+ascending+chick+embryonic+spinal+commissural+neurons+after+crossing+the+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate.</a> Brain Res. 1223, 25-33 (2008).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22+Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4 (1), 21(2009).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).</li>
<li>Reeber, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Robo+expression+in+vivo+perturbs+commissural+axon+pathfinding+in+the+chick+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord.</a> J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).</li>
</ol>

Elektroporacja plazmidowego DNA do zarodka kurczaka rozwija się jako potężna technika do ektopowej ekspresji in vivo. Połączenie specyficznych enhancerów i elektroporacji u kurczęt stanowi szybkie i wydajne narzędzie do rozszyfrowania szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanej grupy neuronów1,3,5. Wykorzystanie systemów amplifikacji Cre/LoxP oraz Gal4/UAS może zwiększyć poziom i czas trwania ekspresji. Wyłaniający się obraz wskazuje na złożoną dywergencję sygnałów aksonalnych pochodzących z subpopulacji int...

rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Wykorzystanie elementów wzmacniających do sterowania ekspresją genów reporterowych w neuronach jest powszechnie stosowanym paradygmatem śledzenia projekcji aksonalnych. W przypadku śledzenia projekcji aksonalnych interneuronów rdzeniowych u kręgowców, geny reporterowe celowane w linię zarodkową dają obustronnie symetryczne znakowanie. W związku z tym trudno jest odróżnić aksony projektujące się ipsilateralnie i kontralateralnie. Jednostronna elektroporacja do rurki neuralnej kurczaka stanowi przydatny sposób ograniczenia ekspresji genu reporterowego do jednej strony ośrodkowego układu nerwowego, co pozwala na śledzenie projekcji aksonalnych po obu stronach.1 ,2-5W tym filmie zaprezentowano najpierw sposób przygotowania jaj przed iniekcją. W stadium HH 18-20 DNA jest wstrzykiwane na poziomie sakralnym rurki neuralnej, następnie równolegle do zarodka umieszcza się elektrody wolframowe i za pomocą generatora impulsów podaje krótkie impulsy elektryczne. Jajo zostaje zabezpieczone taśmą i umieszczone z powrotem w inkubatorze w celu dalszego rozwoju. Trzy dni później (E6) rdzeń kręgowy zostaje pobrany z zarodka w formie preparatu typu open book, utrwalony i poddany procedurze barwienia przeciwciałami całego preparatu (whole mount). Zabarwiony rdzeń kręgowy zostaje umieszczony na szkiełku i zobrazowany przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Wykorzystanie elementów wzmacniających do sterowania ekspresją genów reporterowych w neuronach jest powszechnie stosowanym paradygmatem śledzenia projekcji aksonalnych. Do śledzenia ...

Witam, nazywam się Ham i pochodzę z laboratorium dr Review Klar z wydziału neurobiologii medycznej na Uniwersytecie Hebrajskim w Jerozolimie. Witam, jestem Sophie Esman, również z laboratorium dr Lars. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę elektroporacji in vivo oraz przygotowanie preparatu rdzenia kręgowego metodą „otwartej książki”.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania trajektorii aksonów genetycznie zdefiniowanej populacji neuronów w zarodkowym rdzeniu kręgowym. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby rozpocząć procedurę, przenieś zapłodnione jaja białych kur kurnikowych (leghorn) z temperatury pokojowej do nawilżonego inkubatora, najlepiej z talami kołyszącymi, w temperaturze od 37 do 38 °C.Ważne jest monitorowanie temperatury i wilgotności w inkubatorze, aby uzyskać żywotne i zsynchronizowane embriony. Embriony kurcząt poddaje się elektroporacji, gdy osiągną stadium hamburger i Hamilton (HH) 18 do 20, które jest optymalnym etapem dla specyficznej ekspresji zależnej od enhancera. Na tym etapie głowa znajduje się pod kątem prostym względem tułowia.Również w stadiach HH 18 do 20 powinien być widoczny rozległy zestaw pozazarodkowych naczyń krwionośnych, takich jak przednie i tylne naczynia linii żywotnej po stronie prawej i lewej. Zarodki kurczego osiągają stadia HH 19 do 20 po 66 godzinach inkubacji; w tym czasie należy wyjąć jaja z inkubatora. Po wyjęciu jaj ułożyć je poziomo i odczekać od pięciu do 10 minut. Zarodek znajduje się obecnie w górnym biegunie jaja.Przed elektroporacją należy przygotować roztwór Hank'a z dodatkiem 100 units per milliliter penicyliny i 0,1 milligrams per milliliter streptomycyny. Należy przygotować odpowiednią mieszaninę DNA o stężeniu od dwóch do pięciu micrograms per microliter i dodać kilka ziaren barwnika fast green w celu łatwiejszej wizualizacji wstrzykniętego DNA. Należy również przygotować pipetę ustną, sterylną igłę do strzykawki, małe nożyczki oraz taśmę.Przygotować mikrokapilary poprzez wyciągnięcie kapilar szklanych o średnicy 0,5 milimetra za pomocą wyciągarki do pipet. Umieścić elektrody wolframowe w mikromanipulatorach i podłączyć je do generatora impulsów. Ustawić napięcie generatora impulsów na -30 voltów, długość każdego impulsu na 50 milliseconds oraz liczbę impulsów na trzy.Przed odsłonięciem i manipulacją zarodkami należy przystąpić do elektroporacji. Wprowadzić strzykawkę w wąski biegun jaja i usunąć od pięciu do sześciu mililitrów albuminy z każdego jaja. Albuminę usuwa się, aby zapobiec jej wylewaniu się.Podczas wycinania w następnym kroku należy użyć małych nożyczek. Po odsłonięciu zarodka kurczaka wycina się owalne okienko w górnej części jaja, a następnie nawilża je 0,5 do 1 ml roztworu hanksa z penicyliną i streptomycyną. Następnie, za pomocą pipety ustnej, należy napełnić szklaną mikrokapilarę.Używając mieszaniny barwnika do DNA, należy łatwo napełnić mikrokapilarę o odpowiedniej średnicy DNA. Pod mikroskopem stereoskopowym należy ustawić embrion w celu wstrzyknięcia DNA do rurki nerwowej. Umieść embrion tak, aby jego ogon był skierowany w Twoją stronę.Na tym etapie rozwoju rdzeń kręgowy jest wyraźnie widoczny, w związku z czym techniki kontrastowania nie są wymagane. Rdzeń kręgowy jest zamknięty zarówno po stronie głownej, jak i ogonowej. Podczas nakłuwania mikrokapilarą należy wykonać otwory w rurze nerwowej, penetrując ją pod niewielkim kątem; mikrokapilara o odpowiednio małej średnicy powinna przebić rurę bez powodowania jej uszkodzenia.Wstrzyknij DNA za pomocą pipety ustnej. Mikrokapilara o odpowiedniej średnicy powinna uwolnić DNA podczas miarowego wydechu. Zielony barwnik powinien rozprzestrzenić się od końcówki ogona aż po pęcherzyki rozwijającego się mózgu.Wstrzykuj, aż rurka neuralna zostanie wypełniona; aby wstrzyknięte DNA mogło wniknąć do komórek, wymagana jest elektroporacja DNA. Najpierw umieść elektrody równolegle do rurki neuralnej i tak blisko niej, jak to możliwe, nie dotykając samej rurki. Upewnij się, że elektrody są zanurzone w cieczy, aby zapewnić przewodnictwo elektryczne podczas impulsu.Zazwyczaj roztwór Hanksa dodany bezpośrednio po odsłonięciu zarodka jest wystarczający. Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy dodać jedną kroplę roztworu Hanksa tuż przed impulsem, z pozycjonowanymi i zanurzonymi w cieczy elektrodami, a następnie podać impuls w celu przeprowadzenia elektroporacji. Następnie należy ostrożnie usunąć elektrody i zabezpieczyć okno oraz jajko taśmą. Ważne jest całkowite uszczelnienie jajka, aby zapobiec wysuszeniu zarodka podczas następnego okresu inkubacji.Umieść jajko z powrotem w inkubatorze i inkubuj, aż embrion kurczaka osiągnie odpowiedni stopień rozwoju. W szóstym dniu (E6), gdy nadejdzie czas obrazowania i embrion poddany elektroporacji osiągnie szósty dzień rozwoju (E6), trzy dni po elektroporacji, usuń go z jajka za pomocą precyzyjnych nożyczek i umieść w powleczonej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS.Odciąć błony i rozciągnąć embrion stroną brzuszną, używając szpilek wbitych w silikon w celu jego unieruchomienia. Za pomocą ostrej mikrokapilary wolframowej wykonać nacięcie podłużne wzdłuż płytki dachowej od tylnego mózgu aż do ogona.Wykonaj dwa dodatkowe nacięcia wzdłużne po obu stronach rdzenia kręgowego, oddzielając zwoje korzeni grzbietowych (DRG) od rdzenia kręgowego. Oddziel płytkę dna od tkanki, zaczynając od ogona w kierunku tylnego mózgu, pozostawiając rdzeń kręgowy nienaruszony. Na koniec, za pomocą precyzyjnych nożyczek, przetnij rdzeń kręgowy w przekroju poprzecznym na wysokości tylnego mózgu i oddziel rdzeń kręgowy od ciała.Po wyizolowaniu rdzenia kręgowego, należy rozłożyć go w nowej pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS, używając pinezek do przymocowania go od tylnego mózgowia do ogona, w celu przygotowania preparatu typu flat mount. Utrawić rdzeń kręgowy w 4%paraldehydzie w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzić barwienie immunocytochemiczne zgodnie z procedurą immunohistochemii opisaną w towarzyszącym protokole pisemnym, aby zamocować otwarty rdzeń kręgowy. Przygotować preparat do obrazowania.Nanieść smar lub silikon w kształcie prostokąta na szkiełko podstawowe i ukraplać PBS wewnątrz prostokąta. Za pomocą pęsety umieścić rdzeń kręgowy, rozciągając go w środkowej części prostokąta, a następnie odessać nadmiar cieczy z jego otoczenia. Za pomocą pipety nanieść jedną lub dwie krople medium montażowego na rdzeń kręgowy i przykryć szkiełkiem nakrywką.Przyciśnij szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Przechowuj preparaty w ciemności w temperaturze 4 °C.Zbadaj rdzeń kręgowy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Oto reprezentatywne wyniki odrzutów aksonalnych interneuronów rdzenia kręgowego kurczaka w eksperymentach kontrolnych, w których RFP jest ekspresowane we wszystkich neuronach z wykorzystaniem powszechnego elementu wzmacniającego CMV; większość neuronów i ich aksony są znakowane. Rozszyfrowanie przebiegu aksonów subpopulacji neuronów jest w tym przypadku niemożliwe.Jednakże po zastosowaniu specyficznych elementów wzmacniających ujawniony zostaje zdefiniowany szlak aksonalny konkretnej subpopulacji neuronów DI 2 w tym przykładzie. Właśnie zaprezentowaliśmy zatem sposób elektrotomycznej operacji rurki neuralnej piszczela z zastosowaniem specyficznego wzmacniacza neuronalnego w stadium E3 oraz sposób przygotowania rdzenia kręgowego w formie otwartej księgi w stadium E6. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności i cierpliwości.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach. Powodzenia.

deciphering-axonal-pathways-genetically-defined-groups-neurons-chick

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rozszyfrowywanie szlaków aksonowych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w rurce nerwowej kurcząt za pomocą elektroporacji in ovo

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Ten film pokazuje podstawowe kroki do przeprowadzenia analizy całego transkryptomu na wypreparowanych próbkach rdzenia kręgowego piskląt po transfekcji z elektroporacją in ovo.

Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.

Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Poznaj metodę elektroporacji in ovo do wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych neuronów w rdzeniu kręgowym pisklęcia. Technika ta umożliwia badanie trajektorii neuronalnych w neurobiologii rozwojowej.

Rozszyfrowywanie ścieżek aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej pisklącia z wykorzystaniem elektroporacji in ovo (Wideo) | JoVE Journal

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Przeglądaj więcej filmów