Izolacja labilnych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego in vivo sieciowania komórkowego i immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Do sieciowania, a następnie immunoprecypitacji. Komórki zabiegowe o gęstości od 80 do 90% inkubuje się z jednym milimolowym lodowatym zimnem. DSP tylko w PBS, wapniu, magnezie lub DMSO.

Sterowanie pojazdem. DSP jest homo bifunkcyjnym przepuszczalnym membranowym i redukowalnym środkiem sieciującym, który sieciuje się swobodnie i oznacza w odległości 12 angstremów od siebie. Następnie komórki sieciujące są poddawane lizie, a precypitacja immunologiczna jest wykonywana przy użyciu standardowych środków kontrolnych.

Kompleksy białkowe są następnie rozwiązywane poprzez redukcję strony SDS, redukując rozszczepiony DSP czynników, co pozwala na identyfikację poszczególnych białek za pomocą immuno blot. Cześć, nazywam się Stephanie Ick i pracuję w laboratorium dr Victora Fonde na Wydziale Biologii Komórki Uniwersytetu Emory. Nazywam się Pearl Ryder i również pochodzę z laboratorium Fonde.

Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę izolacji kompleksów białkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania, a następnie chromatografii powinowactwa immunologicznego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania przejściowych labilnych interakcji białek. Więc zacznijmy.

Zacznij od oznaczenia dolnej części płytek komórkowych, aby wskazać typ komórki i konkretny warunek eksperymentalny. Dodatni symbol oznacza tutaj, że DSP traktowany obejmuje ujemną kontrolę pojazdu tylko DMSO. Dodaj pożywkę do płytek, aby przygotować je do płytki wysiewu komórek.

Komórki HEK wysiewane w rozcieńczeniu od jednego do pięciu, aby umożliwić izolację 500 mikrogramów białka na reakcję w probówce wzorcowej. Pojedyncza probówka może wystarczyć do zidentyfikowania przypuszczalnych partnerów wiążących białko będące przedmiotem zainteresowania za pomocą immunoblot z analizy spektrometrii mas. Zwiększ liczbę standardowych reakcji co najmniej 10 razy.

Przygotuj również łodygi większości roztworów użytych w eksperymencie sieciowania. Należą do nich PBS uzupełniony 0,1 milimolowym chlorkiem wapnia i jeden milimolowy chlorek magnezu określany jako PBS wapń magnez. Dodanie jonów wapnia i magnezu ma kluczowe znaczenie dla przylegania komórek do płytki hodowlanej.

W trakcie eksperymentu przechowuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Inne zapasy obejmują roztwór do gaszenia środków sieciujących 50 X kompletny koktajl inhibitorów proteazy, który jest wirowany co 20 minut, aż do rozpuszczenia osadu. 20%Tritan X 100, który jest przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza i powinien być zużyty w ciągu jednego miesiąca i 10 x i jeden x roztwór buforowy.

Przygotuj i przechowuj wszystkie roztwory zgodnie z opisem w dołączonym pisemnym protokole. Na koniec przygotuj bufor do lizy składający się z jednego buforu X. A plus 0,5% TRITTON X 100 i immunomagnetyczny bufor strącania lub bufor IP składający się z jednego bufora X.

A plus 0,1% TRITTON X 101 do dwóch dni po posianiu, ogniwa osiągają płynność od 80 do 90%, co jest optymalne do sieciowania. W warunkach wysokiej płynności krwi komórki mają tendencję do gromadzenia się na sobie, co prowadzi do zmniejszenia dostępności przepuszczalnego środka sieciującego komórkę dla wszystkich komórek. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze, aż będą gotowe do sieciowania.

Przygotuj roztwór DSP Crosslinker bezpośrednio przed nałożeniem na komórki. DSP jest wysoce hydrofobowy i dlatego rozpuszcza się w DMSO do stężenia 100 milimolów przed rozcieńczeniem do buforu wapniowo-magnezowego PBS. Aby jeszcze bardziej zwiększyć rozcieńczenie DSP w buforze wapniowo-magnezowym PBS, ciepła i odpowiednia objętość, dodaj 10 mikrolitrów roztworu podstawowego DSP i DMSO.

Na każdy mililitr ciepłego wapnia i magnezu PBS dodawać kropla po kropli roztwór podstawowy D-S-P-D-M-S-O, powtarzając mieszanie, aż do rozpuszczenia całego DSP. Przygotuj również roztwór kontrolny pojazdu składający się z 10 mikrolitrów DMSO na każdy mililitr PBS wapnia i magnezu. Po rozcieńczeniu DSP należy przechowywać wszystkie roztwory wapniowo-magnezowe PBS w lodowatej łaźni wodnej nie dłużej niż 10 minut.

Następnie przygotuj lodowatą kąpiel wodną, w której utrzymają się wszystkie płytki użyte w eksperymencie. Przystąp do pobierania płytek hodowlanych zawierających komórki z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i natychmiast umieść je w lodowatej kąpieli wodnej. Umyj komórki dwukrotnie lodowatym wapniem i magnezem PBS, używając tych samych objętości przygotowanych wcześniej do inkubacji z środkiem sieciującym na sześć, płytkę dołkową, oblicz dwa mililitry na dołek i tak dalej.

Po drugim praniu. Dodać do komórek kontrolny nośnik, którym jest DMSO rozpuszczony w buforze lub roztwór buforowy sieciujący DSP, inkubować na lodzie przez dwie godziny i sprawdzać mniej więcej co 20 minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte roztworem. Jeśli niektóre komórki zostaną odsłonięte, przechyl i obróć naczynie, aby ponownie równomiernie je przykryć, to normalne, że wytrąca się niewielka ilość DSP.

Podczas dwugodzinnej inkubacji z komórkami przed zakończeniem dwugodzinnej inkubacji należy przygotować jeden roztwór hartujący XDSP, rozcieńczając łodygę w PBS wapń i magnez. Utrzymuj roztwór na lodzie do momentu jego użycia, aby zatrzymać reakcję sieciowania poprzez dezaktywację DSP, który nie zareagował. Po upływie dwóch godzin usuń z komórek roztwory sterujące i sieciujące pojazd.

Dodaj lodowaty roztwór hartowniczy DSP i inkubuj na lodzie przez 15 minut. W międzyczasie rozcieńczyć cały koktajl inhibitorów proteazy od jednego do 50 w buforze do lizy komórek. Po upływie 15 minut umyj komórki dwukrotnie wapniowo-magnezowym PBS.

Następnie dodaj do komórek bufor do lizy zawierający inhibitory proteazy i kołysz w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Po 30 minutach lizy komórek użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki z płytki. Pamiętaj, aby trzymać lizaty na lodzie, aby zminimalizować aktywność proteazy.

Wirować lizaty komórek przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w mini wirówce stołowej z maksymalną prędkością 15 000 Gs. Odpipetować supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad. Przeanalizuj poziomy białka za pomocą testu Bradforda i przystąp do immunoprecypitacji. Rozpocznij przygotowania do immunoprecypitacji natychmiast po rozpoczęciu dwugodzinnej reakcji sieciowania w zakręcanych mikroprobówkach wirówkowych.

Połącz 30 mikrolitrów immunomagnetycznych kulek anty IgG z 500 mikrolitrami bufora IP. Dodaj przeciwciało przeciwko obiektowi zainteresowania. Odpowiednią ilość przeciwciał należy określić dla każdego indywidualnego antygenu.

We wstępnych eksperymentach możliwe kontrole ujemne dla kulek obejmują brak przeciwciała, kulki i kulki przeciwciała kontrolnego izotypu, które wiążą przeciwciało IP z kulkami magnetycznymi. Inkubować w kołysku końcowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej Pod koniec inkubacji szybko zakręć rurkami i wsuń je do uchwytu magnetycznego. Koraliki skoncentrują się z boku magnesu.

Usunąć roztwór zawierający niezwiązane przeciwciała i natychmiast umyć kulki, aby zapobiec ich wyschnięciu. Po dwóch praniach dodaj 500 mikrolitrów jednego mikrograma na mililitr lizatu komórkowego DSP ujemnego lub DSP dodatniego do odpowiednich probówek. Na tym etapie można przygotować negatywną kontrolę konkurencji peptydów, dodając peptyd immunogenny o stężeniu określonym we wstępnych doświadczeniach do mieszaniny kulek lizatu.

Inną możliwą kontrolą ujemną przygotowaną na tym etapie jest reakcja bez buforu lub bez lizatu przygotowana przez dodanie 500 mikrolitrów buforu do lizy tylko do kulek. Delikatnie zawiesić kulki do reakcji eksperymentalnej i kontrolnej. Nie wiruj, ponieważ spowoduje to pękanie koralików, inkubację pod kątem czterech stopni z obrotem od końca do końca przez dwie godziny.

Po upływie dwóch godzin usuń lizat za pomocą uchwytu magnetycznego. Szybko odwiruj i umyj kulki w sumie sześć razy za pomocą jednego mililitra bufora IP. Inkubacja każdego prania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Aby uniknąć związanych kompleksów, dodaj jeden bufor próbki żelu x do probówki IP tuż nad granulką kulki. Aby zebrać kulki na dnie probówki, delikatnie postukaj w spód probówki, aby wszystkie kulki zostały ponownie zawieszone w buforze próbki żelu. Alternatywnie, do izolacji powinowactwa immunologicznego w 30 mikrolitrach buforu A uzupełnionego peptydem immunogennym do kulek.

Wymagane stężenie peptydu immunogennego określa się empirycznie. Po przetestowaniu zakresu od 10 do 200 mikromolowych, inkubuj kulki w czterech stopniach przez dwie godziny, postukaj w probówki co 30 minut. Użyj uchwytu magnetycznego, aby usunąć 30 mikrolitrów zawierających usunięte kompleksy i zapisać w czystej probówce z buforem IP i zachować kulki.

Dodać jeden x bufor próbki żelu do kulek dla obu metod elucji. Podgrzewaj immunomagnetyczne kulki ponownie zawieszone w żelowym buforze próbki w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez pięć minut, a także denaturuj białka. Ten krok pozwoli również na wzmocnienie cząsteczki DSP, co pozwoli na rozdzielenie poszczególnych białek w złożonym przebiegu.

Próbki na stronie SDS żel do western blot. Opróżnione immunomagnetyczne kulki można odpychać przez odwirowanie i usuwać z próbki za pomocą uchwytu magnetycznego przed załadowaniem. Jeśli EUA powinowactwa immunologicznego jest wolna od IgG zarówno przez barwienie białka strony SDS, jak i przez plamy immunologiczne, nadaje się do spektrometrii mas.

Oto przykład western blot materiału z usieciowanego i nieusieciowanego lizatu komórkowego, po którym następuje immunomagnetyczne wytrącanie przy użyciu przeciwciała monoklonalnego przeciwko podjednostce AP three. Sieciowanie delta pozwala na wykrycie oddziałujących białek, których nie zaobserwowano w próbkach nieusieciowanych podczas izolacji immunologiczno-magnetycznych. Kontrole ujemne nie wykazały swoistego ściągania białka w dół przy użyciu kontroli wolnej od przeciwciał i dopasowanej izotypu przeciwciała przy użyciu IgG skierowanej na receptor transferyny zarówno dla próbek nieusieciowanych, jak i usieciowanych.

W tym przykładzie wykorzystano elucję peptydu powinowactwa w celu odzyskania białek związanych z przeciwciałem IP. Zauważ, że przeciwciało immunologiczne jest nieobecne we frakcji supernat i pozostaje we frakcji dudnionej podczas elucji peptydów. Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować labilne kompleksy MultiPro za pomocą chemicznego środka sieciującego DSP, a następnie oczyścić z powinowactwa immunomagnetycznego.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby roztwory komórkowe i lizaty były schłodzone, aby utrzymać labilne interakcje podczas sieciowania i zminimalizować aktywność proteazy. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.