Name: Izolacja labilnych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego in vivo sieciowania komórkowego i immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-09T17:05:05.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metodę izolacji labilnych kompleksów białkowych za pomocą sieciowania DSP i immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa. Technika stabilizuje przejściowe interakcje białkowe in vivo w komórkach hodowlanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health przyznanych V.F. (NS42599 oraz GM077569).

1. Przygotowanie do sieciowania
<ol>
	<li>Należy wysiać odpowiednią liczbę komórek, aby umożliwić izolację 500 μg białka na jedną standardową reakcję w probówce. Pojedyncza probówka może być wystarczająca do identyfikacji domniemanych interaktorów białka docelowego za pomocą immunoblottingu. W takim przypadku materiał związany z kuleczkami można eluować buforem do próbek SDS-PAGE (immunoprecypitacja). Do analizy spektrometrią mas liczbę standardowych reakcji należy zwiększyć co najmniej dziesięciokrotnie, a kompleksy białkowe należy eluować poprzez konkurencję z antygenem peptydowym rozpoznawanym przez użyte przeciwciało (chromatografia immunoafinicyjna). Strategia ta pozwoli na izolację kompleksów białkowych wolnych od immunoglobulin.</li>
	<li>Optymalna gęstość komórek do sieciowania wynosi od 75% do 90% konfluencji. W warunkach wysokiej konfluencji komórki mają tendencję do nakładania się na siebie, co zmniejsza dostępność przenikającego do komórek czynnika sieciującego dla wszystkich komórek.</li>
	<li>Typ komórek oraz warunki eksperymentalne powinny zostać opisane na spodzie płytki hodowlanej. Rutynowo stosujemy kontrole z samym nośnikiem.</li>
	<li>Przed sieciowaniem należy przygotować wszystkie roztwory Z WYJĄTKIEM roztworu DSP.
 <ol>
		<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwór stokowy soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z CaCl2 0.1 mM i CaCl2 1 mM (PBS/Ca/Mg). Dodanie jonów wapnia i magnezu jest kluczowe dla adhezji komórek do płytki hodowlanej w trakcie trwania eksperymentu. Przechowywać w 4°C.</li>
		<li>50X Kompletny Koktajl Inhibitorów Proteaz – 1 tabletka rozpuszczona w 1 mL wody Milli-Q. Przechowywać w -20°C.</li>
		<li>20% Triton X-100 – Odważyć 10 g Triton X-100 i rozcieńczyć do całkowitej objętości 50 ml wody Milli-Q. Mieszać na wytrząsarce w 4°C przez noc i przechowywać w 4°C do momentu użycia. Nie przechowywać dłużej niż 1 miesiąc. Rozcieńczات tego 20% roztworu stokowego należy wykorzystać do przygotowania buforów do lizy i IP opisanych poniżej.</li>
		<li>50X Roztwór do Gaszenia DSP – 1 M TRIS do pH 7.4. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować 10-krotny roztwór Buforu A. 
		10X Bufor A:
 <ul>
			<li>50 mL 1 M HEPES</li>
			<li>150 mL 5 M NaCl</li>
			<li>10 mL 0.5 M EGTA</li>
			<li>250 μL 2 M MgCl2</li>
			<li>Dostosować pH do 7.4</li>
			<li>Dopełnić objętość końcową do 500 mL</li>
 </ul>
Roztwór 10X Bufor A rozcieńcza się do 1X Bufor A w zależności od potrzeb. 1X Bufor A jest również stosowany w buforach do lizatu i immunomagnetycznej precypitacji. 
	Bufor A 1X
		<ul>
			<li>10 mM Hepes</li>
			<li>150 mM NaCl</li>
			<li>1 mM EGTA</li>
			<li>0.1 mM MgCl2</li>
			<li>pH 7.4</li>
 </ul>
 </li>
	<li>Bufor do Lizy – 1X Bufor A + 0.5% Triton X-100.</li>
	<li>Bufor do Immunomagnetycznej Precypitacji (Bufor IP) – 1X Bufor A + 0.1% Triton X-100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu sieciującego
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór DSP bezpośrednio przed zastosowaniem go do komórek. DSP jest silnie hydrofobowy i należy go rozpuścić w DMSO przed rozcieńczeniem w buforze PBS/Ca/Mg. Rozpuść 40 mg DSP w 1 mL DMSO. Pozwala to na otrzymanie 100 mM roztworu DSP (masa cząsteczkowa DSP wynosi 404,42 g/mol).</li>
	<li>Podgrzej odpowiednią objętość PBS/Ca/Mg do 37°C, aby ułatwić rozcieńczenie DSP/DMSO w PBS. 
Objętości wymagane dla poszczególnych rozmiarów płytek: płytka 6-dołkowa 2 mL na dołek płytka 10 cm 10 mL na płytkę płytka 15 cm 20 mL na płytkę</li>
	<li>Dodaj 10 μL roztworu stokowego DSP/DMSO na każdy 1 mL ciepłego PBS/Ca/Mg. Dodawaj roztwór stokowy DSP/DMSO kropla po kropli, wielokrotnie mieszając, aż cały DSP zostanie rozpuszczony. Przygotuj roztwór kontrolny, dodając 10 μL DMSO do każdego 1 mL PBS/Ca/Mg.</li>
	<li>Umieść wszystkie roztwory PBS/Ca/Mg w kąpieli wodno-lodowej na maksymalnie 10 min.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do sieciowania
<ol>
	<li>Przygotować kąpiel wodno-lodową, która pomieści wszystkie płytki do inkubacji z czynnikiem sieciującym lub kontrolą nośnika.</li>
	<li>Wyjąć płytki z inkubatora 37°C i niezwłocznie umieścić je w kąpieli wodno-lodowej.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie lodowatym PBS/Ca/Mg. Należy użyć tej samej objętości, która będzie stosowana podczas inkubacji z czynnikiem sieciującym (patrz sekcja 2.2).</li>
	<li>Usunąć drugi płuczyn oraz dodać kontrolę nośnika lub roztwór buforu sieciującego DSP.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez dwie godziny. Należy sprawdzać płytki mniej więcej co dwadzieścia minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki są przykryte roztworem. Można zauważyć niewielką ilość wytrąconego z roztworu DSP. Jest to zjawisko normalne.</li>
</ol>
4. Inaktywacja reakcji DSP
<ol>
	<li>Przygotować 1X roztwór gaszący DSP zawierający 20 mM Tris pH 7.4 w buforze PBS/Ca/Mg (20 μL 1 M Tris pH 7.4 na każdy 1 mL PBS/Ca/Mg).</li>
	<li>Usunąć roztwór kontrolny (vehicle control) oraz roztwory sieciujące.</li>
	<li>Dodać lodowaty roztwór inaktywujący i inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
</ol>
5. Lizacja komórek
<ol>
	<li>Podczas inkubacji w celu wygaszenia DSP, przygotować bufor do lizy komórek zawierający 0,5% Triton X-100 w Buforze A z dodatkiem Complete protease inhibitor cocktail. Dodać 20 μL 50X roztworu zapasowego Complete na każdy 1 mL buforu do lizy.</li>
	<li>Po 15-minutowej inkubacji w celu wygaszenia DSP, przemyć komórki dwukrotnie za pomocą PBS/Ca/Mg.</li>
	<li>Dodać do komórek bufor do lizy + Complete i inkubować w wytrząsarce w temperaturze 4°C przez 30 minut. Sugerowane objętości buforu do lizy dla różnych rozmiarów płytek:
 <ul>
 	<li>płytka 6-dołkowa: 0,5 mL na dołek</li>
 	<li>płytka 10 cm: 1 mL na płytkę</li>
 	<li>płytka 15 cm: 1 mL na płytkę</li>
 </ul>
 </li>
	<li>Po lizie zebrać komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek. Należy pamiętać o przechowywaniu lizatów na lodzie, aby zminimalizować aktywność proteaz</li>
	<li>Wirować lizaty komórkowe przez 15 minut w temperaturze 4°C w minicentry fudze stołowej przy maksymalnej prędkości (15.000 x g). </li>
	<li>Przenieść nadfiltr pipetą do nowej probówki. Odrzucić osad.</li>
	<li>Przeanalizować poziom białek i przystąpić do immunoprecypitacji.</li>
 </ol>
6. Przygotowanie kulek do precypitacji immunomagnetycznej
Uwaga: Ten etap rozpoczyna się zazwyczaj bezpośrednio po rozpoczęciu 2-godzinnej inkubacji w celu sieciowania.
<ol>
	<li>Do probek do mikrocentryfugi z zakrętkami należy wprowadzić 30 μL kulek immunomagnetycznych Dynal, 500 μL buforu do immunoprecypitacji (IP Buffer; 1x Buffer A + 0,1% Triton X-100) oraz odpowiednią ilość przeciwciała specyficznego dla antygenu. Przygotować probówki bez przeciwciał oraz z przeciwciałami nieswoistymi jako kontrole negatywne. Odpowiednią ilość przeciwciała należy wyznaczyć dla poszczególnych antygenów w osobnych doświadczeniach. Wszystkie probówki do immunoprecypitacji należy odpowiednio oznakować.</li>
	<li>Probówki do immunoprecypitacji należy inkubować na rotatorze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Alternatywnie można inkubować probówki z przeciwciałami przez noc w temperaturze 4°C w dniu poprzedzającym sieciowanie.</li>
	<li>Po inkubacji należy przeprowadzić krótkie, 10-sekundowe wirowanie w mikrocentry fudze, aby osadzić kulki na dnie probówki.</li>
	<li>Probówki należy wsunąć do uchwytu magnetycznego, co spowoduje przyciągnięcie kulek magnetycznych i odsunie je od dna probówki. Po zabezpieczeniu kulek można łatwo wypłukać niezwiązane przeciwciała.</li>
	<li>Do usunięcia buforu inkubacyjnego i niezwiązanych przeciwciał należy użyć końcówki aspiracyjnej o małej średnicy, np. końcówki do nakładania żelu lub końcówki p200. Natychmiast po usunięciu objętości inkubacyjnej należy dodać 1 mL buforu do immunoprecypitacji (IP Buffer).</li>
	<li>Probówkę należy zakręcić, delikatnie resuspender kulki i inkubować wszystkie probówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut na rotatorze.</li>
	<li>Krok płukania trwający 5 minut (kroki od 6.3 do 6.6) należy powtórzyć jeszcze raz, używając świeżego mililitra buforu do immunoprecypitacji (IP Buffer).</li>
	<li>Probówki do immunoprecypitacji mogą pozostać w ostatniej inkubacji płuczącej do momentu, gdy sieciowany lizat będzie gotowy do dodania do kulek.</li>
</ol>
7. Inkubacja lizatu sieciowanego z kulkami immunomagnetycznymi
<ol>
	<li>Po ostatnim płukaniu odwiruj kulki immunomagnetyczne w miniwirówce przez 10 sekund. Następnie umieść probówki w uchwycie magnetycznym.</li>
	<li>Ponownie, używając końcówki aspiracyjnej o małej średnicy, usuń objętość inkubacyjną z probówki. Natychmiast dodaj do probótek zawierających kulki immunomagnetyczne 500 μL sieciowanego lizatu komórkowego (zakładając stężenie lizatu 1 μg/mL). Jeśli jako kontrolę negatywną stosowana jest konkurencja peptydowa, na tym etapie należy dodać odpowiednią ilość peptydu. W celu ustalenia odpowiednich warunków konkurencji peptydowej należy wcześniej przeprowadzić eksperymenty pilotażowe. Alternatywnie, jako kontrolę negatywną można zastosować kulki immunomagnetyczne bez lizatu. W takim przypadku natychmiast dodaj do kulek immunomagnetycznych 500 μL buforu do lizatu (1x Buffer A + 0.5% Triton X-100) + Complete.</li>
	<li>Delikatnie resuspenduj kulki. Zresuspendowane kulki należy inkubować w temperaturze 4°C przy rotacji typu end-over-end przez 2 godziny.</li>
</ol>
8. Płukanie niezwiązanego lizatu z kulek
<ol>
	<li>Po odpowiednim czasie inkubacji lizatu należy wykonać szybkie wirowanie przez 10 sekund w miniwirówce. Następnie należy wsunąć probówki do uchwytu magnetycznego. Uchwyt magnetyczny powinien pozostawać w kąpieli lodowej przez resztę eksperymentu.</li>
	<li>Używając końcówki aspiracyjnej o małej średnicy, należy usunąć cały niezwiązany lizat. Natychmiast po usunięciu całego niezwiązanego lizatu należy dodać 1 mL buforu IP.</li>
	<li>Należy zamknąć probówkę i delikatnie resuspender kuleczki.</li>
	<li>Po resuspensji kuleczek należy powtórzyć krok osadzania kuleczek (8.1).</li>
	<li>Ponownie należy odessać całą objętość inkubacyjną i natychmiast dodać 1 mL buforu IP, a następnie zamknąć probówkę.</li>
	<li>Należy delikatnie resuspender kuleczki w buforze IP. Zresuspenderowane kuleczki należy inkubować przez 5 minut w temperaturze 4°C przy zastosowaniu rotatora end-over-end.</li>
	<li>Należy powtórzyć kroki płukania kuleczek (od 8.4 do 8.6) jeszcze 4 razy.</li>
</ol>
9. Denaturacja próbki i odzyskanie z kulek
<ol>
	<li>Po przemyciu wszystkich probówek do immunoprecypitacji magnetycznej ponownie osadź koraliki (8.1) i wsuń probówki do uchwytu magnetycznego.</li>
	<li>Białka związane z koralikami immunomagnetycznymi są usuwane w warunkach denaturujących. Odsuń pipetą ostatnią porcję buforu do IP i wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego.</li>
	<li>Dodaj 1x Gel Sample Buffer do probówki z IP, tuż nad osadem z koralików, aby ponownie zgromadzić koraliki na dnie probówki. Ilość buforu do próbek zależy od rozmiaru dołka żelu, który będzie wykorzystywany. Może być konieczne delikatne opukanie dna probówki, aby wszystkie koraliki zostały resuspensowane w Gel Sample Buffer.</li>
	<li>Powtórz proces denaturacji (od punktu 9.2 do 9.3) dla każdej probówki IP.</li>
	<li>Koraliki immunomagnetyczne resuspensowane w Gel Sample Buffer są następnie podgrzewane w temperaturze 75°C przez 5 minut w celu zakończenia procesu denaturacji.</li>
	<li>Po zdenaturowaniu próbki można ją poddać elektroforezie na żelu SDS-PAGE w celu wykonania western blottingu. Oczyszczone koraliki immunomagnetyczne można ponownie osadzić poprzez wirowanie i usunąć z próbki za pomocą uchwytu magnetycznego.</li>
</ol>
10. Elucja kompleksów sieciowanych peptydami antygenicznymi (chromatografia immuno powinowactwa).
<ol>
	<li>Po przemyciu wszystkich probówek do immunomagnetycznej immunoprecypitacji, ponownie osadź kulki (8.1) i wsuń probówki do uchwytu magnetycznego. Odessać nadmiar cieczy i dodać 10 μl Buforu A uzupełnionego o peptyd antygenowy rozpoznawany przez przeciwciało użyte do immunoisolacji kompleksów białkowych. W celu uzyskania efektywnej elucji należy przetestować stężenia w zakresie 10-200 μM.</li>
	<li>Inkubować kulki przez 2 h w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Umieścić kulki w statywie magnetycznym i ostrożnie zebrać 10 μL eluatowanego materiału. Zachować ten nadosad.</li>
	<li>Szybko przemyć kulki Buforem A i odrzucić płuczkę. Zachować kulki.</li>
	<li>Do zachowanego nadosadu oraz kulek dodać Bufor do Próbek żelowych do uzyskania stężenia 1X. Inkubować te probówki w temperaturze 75°C przez 5 minut.</li>
	<li>Przeanalizować kulki oraz eluat peptydowy za pomocą SDS-PAGE. Eluat powinien być wolny od IgG, co należy potwierdzić barwieniem białek w SDS-PAGE lub za pomocą immunoblotów (Rycina 1B). Materiał ten, wolny od IgG, nadaje się do spektrometrii mas.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1855/1855fig1.jpg" alt="Analiza Western blot; badanie oddziakiwań białek; wyniki eksperymentalne; prążki AP-3, CHC, PI4KIIα." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Izolacja kompleksów białkowych oddziałujących z AP-3 oraz białek błonowych. Komórki HEK293 (A) lub komórki PC12 (B) poddano działaniu kontroli nośnika (DMSO, nieparzyste ścieżki na Rys. 1A) lub DSP (parzyste ścieżki na Rys. 1A lub wszystkie ścieżki na Rys. 1B). Klarowne ekstrakty inkubowano z samymi kuleczkami (Rys. 1A, ścieżki 3-4), przeciwciałami przeciwko receptorowi transferyny (Rys. 1A, ścieżki 5-6) lub przeciwciałami przeciwko δ AP-3 (Rys. 1A, ścieżki 7-10; Rys. 1B, ścieżki 1-10). Kompleksy immunologiczne eluowano buforem do próbek SDS-PAGE (Rys. 1A), samym Buforem A (Rys. 1B, ścieżki 1-2) lub Buforem A z dodatkiem rosnących stężeń peptydu antygenowego δ odpowiadającego aminokwasom 680-710 ludzkiej δ-adaptyny (NCBI:AAD03777; gi:1923266) (Rys. 1B, ścieżki 3-10). Peptyd ten wiąże przeciwciało δ. Po elucji peptydu analizowano supernatanty (S) i kuleczki (B) za pomocą immunoblotu (Rys. 1B). AP-3, wykrywany przeciwciałami przeciwko podjednostkom δ, β3 i σ3, współwytrąca się z następującymi czynnikami rozpuszczalnymi: ciężkim łańcu klatryny (CHC), podjednostką pallidyną kompleksu BLOC-1 oraz podjednostką vps33b kompleksu HOPS; a także z białkami błonowymi: fosfatydyloinozyto-4-kinazą typu II alfa (PI4KIIα) i transporterem cynku 3 (ZnT3). Zauważalny jest brak ciężkich łańcuchów IgG mysich w supernatancie po elucji peptydu na Rys. 1B.

<ol><li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome+protein+complexes+associate+with+phosphatidylinositol+4-kinase+type+II+alpha+in+neuronal+and+non-neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells.</a> J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate.</a> J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).</li>
<li>Xiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+DSP%2C+a+reversible+cross-linker%2C+to+fix+tissue+sections+for+immunostaining%2C+microdissection+and+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling.</a> Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).</li>
<li>Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4-Kinase+Type+II+Alpha+Contains+an+AP-3+Sorting+Motif+and+a+Kinase+Domain+that+are+both+Required+for+Endosome+Traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic.</a> Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).</li>
<li>Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+non-neuronal+functions+of+the+AP-3+sorting+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery.</a> J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).</li>
<li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zinc+Transporter+ZnT3+interacts+with+AP-3+and+it+is+Targeted+to+a+Distinct+Synaptic+Vesicle+Subpopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation.</a> Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
</ol>

DSP, przenikający przez błony, chemicznie redukowalny czynnik sieciujący z ramieniem dystansowym o długości 12 Å, jest stosowany do stabilizacji przejściowych oddziaływań białkowych 1,2,3,4. W niniejszej pracy zilustrowaliśmy tę strategię na przykładzie kompleksu adaptorowego AP-3, który jest rozpuszczalnym kompleksem białkowym rozpoznającym białka błonowe i sortującym je do pęcherzyków z endosomów 5. AP-3 selektywnie wiąże transporter cynku ZnT3 oraz kinazę lipidową fosfatydyloinozyto-4-kinazę typu...

<table><tbody><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>P4417</td><td>Rozpuścić 1 tabletkę w 200 mL wody; dodać MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; do stężenia końcowego 1 mM oraz CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; do stężenia końcowego 0.1 mM</td></tr><tr><td>Ditionbis (propionian sukcynimidylowy) (DSP)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22585</td><td>Wrażliwy na wilgoć, przechowywać w szczelnym pojemniku w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Dimetylosulfoksyd (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads, owcze przeciwko mysim IgG</td><td>Invitrogen</td><td>110.31</td><td>Kuleczki dostępne są również w wersji owcze przeciwko króliczym</td></tr><tr><td>Magnes Dyna-Mag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Dynamiczny charakter mechanizmów komórkowych często opiera się na przejściowych i/lub słabych asocjacjach białek. Te oddziaływania o niskim powinowactwie wykluczają stosowanie rygorystycznych metod izolacji i identyfikacji sieci białkowych wokół białka docelowego. Zastosowanie chemicznych czynników sieciujących pozwala na selektywną stabilizację nietrwałych oddziaływań, co pozwala ominąć ograniczenia biochemiczne podczas oczyszczania. Przedstawiamy tutaj protokół odpowiedni dla komórek w hodowli, który wykorzystuje homobifunkcyjny czynnik sieciujący z ramieniem dystansowym o długości 12 Å, ditiobis-(succinimidylopropionian) (DSP). DSP jest rozszczepiany poprzez redukcję wiązania disiarczkowego obecnego w cząsteczce. Sieciowanie w połączeniu z chromatografią immunoafinicyjną białek docelowych z użyciem kulek magnetycznych pozwala na izolację kompleksów białkowych, które w przeciwnym razie nie przetrwałyby procesu oczyszczania. Protokół ten jest kompatybilny ze standardowymi technikami western blot i może zostać przeskalowany w celu identyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas1.
Stephanie A. Zlatic i Pearl V. Ryder wniosły równy wkład w tę pracę.

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Dynamiczny charakter maszynerii komórkowej często opiera się na przejściowych i/lub słabych asocjacjach białek. Te oddziaływania o niskim powinowactwie wykluczają ...

Do sieciowania, a następnie immunoprecypitacji. Komórki o gęstości od 80 do 90% inkubuje się z 1 mM lodowatym DSP w samym PBS, wapniu, magnezie lub DMSO.Kontrola nośnika. DSP jest homobifunkcyjnym, przenikającym przez błonę i redukowalnym czynnikiem sieciującym, który sieciuje wolne grupy w odległości do 12 angstromów od siebie. Po sieciowaniu komórki są lizowane, a następnie przeprowadza się immunoprecypitację z zastosowaniem standardowych kontroli.Kompleksy białkowe są następnie rozdzielane za pomocą redukującej elektroforezy SDS-PAGE, w której środki redukujące rozszczepiają DSP, co umożliwia identyfikację poszczególnych białek za pomocą immunoblottingu. Cześć, jestem Stephanie Ick z laboratorium dr Victora Fonde'a w Katedrze Biologii Komórki na Uniwersytecie Emory. A ja jestem Pearl Ryder, również z laboratorium Fonde'a.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji kompleksów białkowych przy użyciu kontrolowanego sieciowania z następującą po nim immunomagnetyczną chromatografią powinowactwa. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania przejściowych, nietrwałych oddziaływań białkowych. Zatem zacznijmy.Rozpocznij od opisania dna płytek hodowlanych, aby wskazać typ komórek i konkretny warunek eksperymentalny. Symbol dodatni oznacza próbki traktowane DSP, natomiast należy uwzględnić również ujemną kontrolę nośnika z samym DMSO. Dodaj pożywkę do płytek, aby przygotować je do wysiewu komórek.Komórki HEK wysiano w rozcieńczeniu od 1:5, aby umożliwić izolację 500 µg białka na jedną standardową reakcję w probówce. Pojedyncza probówka może być wystarczająca do identyfikacji domniemanych partnerów wiązania badanego białka za pomocą immunoblottingu na podstawie analizy spektrometrii mas. Zwiększ liczbę standardowych reakcji co najmniej 10-krotnie.Należy również przygotować zapasy większości roztworów wykorzystywanych w eksperymencie sieciowania. Obejmują one PBS uzupełniony o 0,1 mM chlorku wapnia oraz 1 mM chlorku magnezu, określany jako PBS wapniowo-magnezowy. Dodatek jonów wapnia i magnezu jest krytyczny dla adhezji komórek do płytki hodowlanej.W trakcie prowadzenia eksperymentu roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Pozostałe zapasy obejmują roztwór do wygaszania sieciowania, 50 X kompletny koktajl inhibitorów proteaz, który należy mieszać w wortexie co 20 minut do momentu rozpuszczenia osadu, 20% Tritan X 100, który jest przechowywany w temperaturze 4 °C i powinien zostać zużyty w ciągu jednego miesiąca, oraz roztwory buforowe A w stężeniach 10 x i 1 x.Przygotować i przechowywać wszystkie roztwory zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Na koniec przygotować bufor do lizy składający się z buforu 1X oraz 0,5% TRITTON X 100 oraz bufor do immunoprecypitacji magnetycznej lub bufor IP składający się z buforu 1X.Po dwóch dniach od wysiania komórki osiągają 80 do 90% konfluencji, co jest optymalne dla procesu sieciowania. W warunkach wysokiej konfluencji komórki mają tendencję do nakładania się na siebie, co prowadzi do zmniejszenia dostępności sieciującego agenta przenikającego do komórek dla wszystkich populacji. Należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze do czasu rozpoczęcia sieciowania.Roztwór sieciujący DSP należy przygotować bezpośrednio przed aplikacją na komórki. DSP jest silnie hydrofobowy, dlatego przed rozcieńczeniem w buforze PBS z wapniem i magnezem należy go rozpuścić w DMSO do stężenia 100 millimolar. Aby dodatkowo usprawnić rozcieńczenie DSP w podgrzanym i odpowiednim objętościowo buforze PBS z wapniem i magnezem, należy dodać 10 microliters roztworu zapasu DSP w DMSO.Do każdego jednego mililitra ciepłego buforu PBS z wapniem i magnezem dodawaj kroplami roztwór stokowy D-S-P-D-M-S-O, wielokrotnie mieszając, aż cały DSP zostanie rozpuszczony. Przygotuj również roztwór kontrolny (nośnik) zawierający 10 µL DMSO na każdy mililitr buforu PBS z wapniem i magnezem. Po rozcieńczeniu DSP wszystkie roztwory PBS z wapniem i magnezem należy przechowywać w łaźni wodno-lodowej nie dłużej niż przez 10 minut.Następnie przygotuj kąpiel w lodowatej wodzie, która pomieści wszystkie płytki wykorzystane w eksperymencie. Wyjmij płytki hodowlane z komórkami z inkubatora ustawionego na 37 °C i niezwłocznie umieść je w kąpieli w lodowatej wodzie. Przemyj komórki dwukrotnie lodowatym PBS z dodatkiem wapnia i magnezu, stosując takie same objętości, jakie przygotowano wcześniej do inkubacji z czynnikiem sieciującym; dla płytki 6-dołkowej oblicz 2 ml na dołek i analogicznie dla pozostałych.Po drugim płukaniu należy dodać do komórek kontrolę nośnika (DMSO rozpuszczony w buforze) lub roztwór buforu sieciującego DSP, a następnie inkubować na lodzie przez dwie godziny, sprawdzając stan co około 20 minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte roztworem. Jeśli niektóre komórki zostaną odsłonięte, należy przechylić i obrócić szalkę, aby ponownie równomiernie je pokryć; niewielkie wytrącanie się DSP jest zjawiskiem normalnym.W ciągu dwóch godzin inkubacji z komórkami, przed jej zakończeniem, należy przygotować 1X roztwór gaszący DSP, rozcieńczając go w buforze PBS z dodatkiem wapnia i magnezu. Roztwór należy przechowywać w lodzie do momentu zatrzymania reakcji sieciowania poprzez dezaktywację nieprzereagowanego DSP. Po upływie dwóch godzin należy usunąć z komórek kontrolę nośnika oraz roztwory sieciujące.Dodaj lodowaty roztwór gaszący DSP i inkubuj na lodzie przez 15 minut. W międzyczasie rozcieńcz roztwór stokowy kompletnego koktajlu inhibitorów proteaz w stosunku 1:50 w buforze do lizy komórek. Po upływie 15 minut przemyj komórki dwukrotnie buforem PBS z dodatkiem wapnia i magnezu.Następnie należy dodać do komórek bufor lizujący zawierający inhibitory proteaz i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w wytrząsarce obrotowej. Po 30 minutach lizy komórek, za pomocą skrobaka do komórek, należy zebrać komórki z płytki. Należy pamiętać o przechowywaniu lizatów w lodzie, aby zminimalizować aktywność proteaz.Wirować lizaty komórkowe przez 15 minut w temperaturze 4 °C w minicentryfudze laboratoryjnej z maksymalną prędkością 15 000 Gs. Przenieść nadsącz pipetą do nowej probówki, a osad odrzucić. Przeanalizować poziom białek za pomocą metody Bradforda i przystąpić do immunoprecypitacji. Przygotowania do immunoprecypitacji rozpocząć niezwłocznie po zainicjowaniu dwugodzinnej reakcji sieciowania w probówkach do mikrocentryfugi z zakrętką.Połącz 30 µL magnetycznych kulek przeciwciał anty-IgG z 500 µL buforu IP. Dodaj przeciwciało przeciwko badanemu celowi. Odpowiednią ilość przeciwciał należy dobrać dla każdego konkretnego antygenu.W eksperymentach wstępnych możliwymi kontrolami negatywnymi dla kulek są: brak przeciwciała, same kulki oraz kulki z przeciwciałem kontrolnym izotypowym, aby związać przeciwciało IP z kulkami magnetycznymi. Inkubować na wytrząsarce typu end-over-end przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji krótko wirować probówki i wsunąć je do uchwytu magnetycznego. Kulki skoncentrują się przy magnesie.Usunąć roztwór zawierający nieprzywiązane przeciwciała i natychmiast wypłukać kuleczki, aby zapobiec ich wyschnięciu. Po dwóch płukaniach dodać 500 µL lizatu komórkowego DSP ujemnego lub DSP dodatniego w stężeniu 1 µg/mL do odpowiednich probówek. Na tym etapie można przygotować ujemną kontrolę konkurencji peptydowej, dodając do mieszaniny lizatu i kuleczek peptyd immunogenny w stężeniu określonym w eksperymentach wstępnych.Inną możliwą kontrolą negatywną przygotowywaną na tym etapie jest reakcja zawierająca tylko bufor lub pozbawiona lizatu, przygotowana poprzez dodanie do kuleczek samych 500 µL buforu do lizy. Delikatnie resuspenduj kuleczki w reakcjach eksperymentalnych i kontrolnych. Nie używaj wirówki typu vortex, ponieważ spowoduje to zniszczenie kuleczek; inkubuj w temperaturze 4 °C przy rotacji end-over-end przez dwie godziny.Po upływie dwóch godzin usunąć lizat za pomocą uchwytu magnetycznego. Krótko wirować i przemyć kuleczki łącznie sześć razy, używając 1 mL buforu IP. Każde przemywanie należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C przez pięć minut.Aby eluować kompleksy związane, należy dodać jeden x bufor do próbek żelowych do probówki z IP, tuż nad osadem kulek. Aby zgromadzić kulki na dnie probówki, należy delikatnie opukać dno probówki, aż wszystkie kulki zostaną resuspensowane w buforze do próbek żelowych. Alternatywnie, w przypadku izolacji immunoadfinitowej, należy dodać 30 µL buforu A uzupełnionego o peptyd immunogenny do kulek.Wymagane stężenie peptydu immunogennego ustala się empirycznie. Po przetestowaniu zakresu od 10 do 200 µM, należy inkubować kulki w temperaturze 4 °C przez dwie godziny, opukując probówki co 30 minut. Za pomocą uchwytu magnetycznego należy usunąć 30 µL zawierających eluowane kompleksy i przenieść je do czystej probówki, a następnie przemyć kulki buforem IP i je zachować.Do obu metod elucji dodaj 1x bufor do próbek żelowych do kulek. Podgrzej zawiesinę immunomagnetycznych kulek w buforze do próbek żelowych w temperaturze 75 °C przez pięć minut w celu denaturacji białek. Krok ten spowoduje również rozszczepienie cząsteczki DSP, co umożliwi rozdzielenie poszczególnych białek w kompleksie podczas elektroforezy.Próbki na żelu SDS-PAGE do western blotu. Opróżnione magnetyczne kulki immunomagnetyczne można oddzielić przez wirowanie i usunąć z próbki za pomocą uchwytu magnetycznego przed aplikacją. Jeśli EUA o powinowactwie immunologicznym jest wolne od IgG, co potwierdzono barwieniem białek w SDS-PAGE lub immunoblotami, nadaje się ono do spektrometrii mas.Poniżej przedstawiono przykład western blotu materiału z lizatu komórkowego sieciowanego i niesieciowanego, a następnie immunomagnetycznego wytrącania z użyciem przeciwciała monoklonalnego przeciwko podjednostce AP trzech. Sieciowanie umożliwia wykrycie białek oddziałujących, których nie zaobserwowano w próbkach niesieciowanych podczas izolacji immunomagnetycznych. Kontrole negatywne nie wykazały specyficznego wyciągania białek przy użyciu kontroli bezprzeciwciałowej oraz kontroli izotypowej z zastosowaniem IgG skierowanego przeciwko receptorowi transferyny, zarówno w przypadku próbek niesieciowanych, jak i sieciowanych.W tym przykładzie w celu odzyskania białek związanych z przeciwciałem IP zastosowano elucję peptydową powinowactwa. Należy zauważyć, że przeciwciało immunologiczne nie występuje w frakcji nadsączu i pozostaje w frakcji osadu podczas elucji peptydowej. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji labilnych kompleksów MultiPro przy użyciu chemicznego czynnika sieciującego DSP, a następnie immunomagnetycznego oczyszczania powinowactwa.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymywanie niskiej temperatury roztworów komórek i lizatów, aby zachować nietrwałe oddziaływania podczas sieciowania oraz zminimalizować aktywność proteaz. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

isolation-labile-multi-protein-complexes-vivo-controlled-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych przez in vivo kontrolowane krzyżowanie komórkowe i chromatografię afinową immunomagnetyczną

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Wieloskładnikowe kompleksy białkowe odgrywają kluczową rolę podczas funkcjonowania i rozwoju komórek. W tym miejscu opisujemy metodę stosowaną do izolowania natywnych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila po sieciowaniu in vivo, a następnie oczyszczeniu usieciowanych kompleksów w celu późniejszej analizy strukturalno-funkcjonalnej.<br...

Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Poznaj metodę izolacji labilnych kompleksów białkowych za pomocą sieciowania DSP i immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa. Technika stabilizuje przejściowe interakcje białkowe in vivo w komórkach hodowlanych.

Izolacja labilnych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego in vivo sieciowania komórkowego i immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Przeglądaj więcej filmów