Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Do sieciowania, a następnie immunoprecypitacji. Komórki o gęstości od 80 do 90% inkubuje się z 1 mM lodowatym DSP w samym PBS, wapniu, magnezie lub DMSO.

Kontrola nośnika. DSP jest homobifunkcyjnym, przenikającym przez błonę i redukowalnym czynnikiem sieciującym, który sieciuje wolne grupy w odległości do 12 angstromów od siebie. Po sieciowaniu komórki są lizowane, a następnie przeprowadza się immunoprecypitację z zastosowaniem standardowych kontroli.

Kompleksy białkowe są następnie rozdzielane za pomocą redukującej elektroforezy SDS-PAGE, w której środki redukujące rozszczepiają DSP, co umożliwia identyfikację poszczególnych białek za pomocą immunoblottingu. Cześć, jestem Stephanie Ick z laboratorium dr Victora Fonde'a w Katedrze Biologii Komórki na Uniwersytecie Emory. A ja jestem Pearl Ryder, również z laboratorium Fonde'a.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji kompleksów białkowych przy użyciu kontrolowanego sieciowania z następującą po nim immunomagnetyczną chromatografią powinowactwa. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania przejściowych, nietrwałych oddziaływań białkowych. Zatem zacznijmy.

Rozpocznij od opisania dna płytek hodowlanych, aby wskazać typ komórek i konkretny warunek eksperymentalny. Symbol dodatni oznacza próbki traktowane DSP, natomiast należy uwzględnić również ujemną kontrolę nośnika z samym DMSO. Dodaj pożywkę do płytek, aby przygotować je do wysiewu komórek.

Komórki HEK wysiano w rozcieńczeniu od 1:5, aby umożliwić izolację 500 µg białka na jedną standardową reakcję w probówce. Pojedyncza probówka może być wystarczająca do identyfikacji domniemanych partnerów wiązania badanego białka za pomocą immunoblottingu na podstawie analizy spektrometrii mas. Zwiększ liczbę standardowych reakcji co najmniej 10-krotnie.

Należy również przygotować zapasy większości roztworów wykorzystywanych w eksperymencie sieciowania. Obejmują one PBS uzupełniony o 0,1 mM chlorku wapnia oraz 1 mM chlorku magnezu, określany jako PBS wapniowo-magnezowy. Dodatek jonów wapnia i magnezu jest krytyczny dla adhezji komórek do płytki hodowlanej.

W trakcie prowadzenia eksperymentu roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Pozostałe zapasy obejmują roztwór do wygaszania sieciowania, 50 X kompletny koktajl inhibitorów proteaz, który należy mieszać w wortexie co 20 minut do momentu rozpuszczenia osadu, 20% Tritan X 100, który jest przechowywany w temperaturze 4 °C i powinien zostać zużyty w ciągu jednego miesiąca, oraz roztwory buforowe A w stężeniach 10 x i 1 x.

Przygotować i przechowywać wszystkie roztwory zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Na koniec przygotować bufor do lizy składający się z buforu 1X oraz 0,5% TRITTON X 100 oraz bufor do immunoprecypitacji magnetycznej lub bufor IP składający się z buforu 1X.

Po dwóch dniach od wysiania komórki osiągają 80 do 90% konfluencji, co jest optymalne dla procesu sieciowania. W warunkach wysokiej konfluencji komórki mają tendencję do nakładania się na siebie, co prowadzi do zmniejszenia dostępności sieciującego agenta przenikającego do komórek dla wszystkich populacji. Należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze do czasu rozpoczęcia sieciowania.

Roztwór sieciujący DSP należy przygotować bezpośrednio przed aplikacją na komórki. DSP jest silnie hydrofobowy, dlatego przed rozcieńczeniem w buforze PBS z wapniem i magnezem należy go rozpuścić w DMSO do stężenia 100 millimolar. Aby dodatkowo usprawnić rozcieńczenie DSP w podgrzanym i odpowiednim objętościowo buforze PBS z wapniem i magnezem, należy dodać 10 microliters roztworu zapasu DSP w DMSO.

Do każdego jednego mililitra ciepłego buforu PBS z wapniem i magnezem dodawaj kroplami roztwór stokowy D-S-P-D-M-S-O, wielokrotnie mieszając, aż cały DSP zostanie rozpuszczony. Przygotuj również roztwór kontrolny (nośnik) zawierający 10 µL DMSO na każdy mililitr buforu PBS z wapniem i magnezem. Po rozcieńczeniu DSP wszystkie roztwory PBS z wapniem i magnezem należy przechowywać w łaźni wodno-lodowej nie dłużej niż przez 10 minut.

Następnie przygotuj kąpiel w lodowatej wodzie, która pomieści wszystkie płytki wykorzystane w eksperymencie. Wyjmij płytki hodowlane z komórkami z inkubatora ustawionego na 37 °C i niezwłocznie umieść je w kąpieli w lodowatej wodzie. Przemyj komórki dwukrotnie lodowatym PBS z dodatkiem wapnia i magnezu, stosując takie same objętości, jakie przygotowano wcześniej do inkubacji z czynnikiem sieciującym; dla płytki 6-dołkowej oblicz 2 ml na dołek i analogicznie dla pozostałych.

Po drugim płukaniu należy dodać do komórek kontrolę nośnika (DMSO rozpuszczony w buforze) lub roztwór buforu sieciującego DSP, a następnie inkubować na lodzie przez dwie godziny, sprawdzając stan co około 20 minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte roztworem. Jeśli niektóre komórki zostaną odsłonięte, należy przechylić i obrócić szalkę, aby ponownie równomiernie je pokryć; niewielkie wytrącanie się DSP jest zjawiskiem normalnym.

W ciągu dwóch godzin inkubacji z komórkami, przed jej zakończeniem, należy przygotować 1X roztwór gaszący DSP, rozcieńczając go w buforze PBS z dodatkiem wapnia i magnezu. Roztwór należy przechowywać w lodzie do momentu zatrzymania reakcji sieciowania poprzez dezaktywację nieprzereagowanego DSP. Po upływie dwóch godzin należy usunąć z komórek kontrolę nośnika oraz roztwory sieciujące.

Dodaj lodowaty roztwór gaszący DSP i inkubuj na lodzie przez 15 minut. W międzyczasie rozcieńcz roztwór stokowy kompletnego koktajlu inhibitorów proteaz w stosunku 1:50 w buforze do lizy komórek. Po upływie 15 minut przemyj komórki dwukrotnie buforem PBS z dodatkiem wapnia i magnezu.

Następnie należy dodać do komórek bufor lizujący zawierający inhibitory proteaz i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w wytrząsarce obrotowej. Po 30 minutach lizy komórek, za pomocą skrobaka do komórek, należy zebrać komórki z płytki. Należy pamiętać o przechowywaniu lizatów w lodzie, aby zminimalizować aktywność proteaz.

Wirować lizaty komórkowe przez 15 minut w temperaturze 4 °C w minicentryfudze laboratoryjnej z maksymalną prędkością 15 000 Gs. Przenieść nadsącz pipetą do nowej probówki, a osad odrzucić. Przeanalizować poziom białek za pomocą metody Bradforda i przystąpić do immunoprecypitacji. Przygotowania do immunoprecypitacji rozpocząć niezwłocznie po zainicjowaniu dwugodzinnej reakcji sieciowania w probówkach do mikrocentryfugi z zakrętką.

Połącz 30 µL magnetycznych kulek przeciwciał anty-IgG z 500 µL buforu IP. Dodaj przeciwciało przeciwko badanemu celowi. Odpowiednią ilość przeciwciał należy dobrać dla każdego konkretnego antygenu.

W eksperymentach wstępnych możliwymi kontrolami negatywnymi dla kulek są: brak przeciwciała, same kulki oraz kulki z przeciwciałem kontrolnym izotypowym, aby związać przeciwciało IP z kulkami magnetycznymi. Inkubować na wytrząsarce typu end-over-end przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji krótko wirować probówki i wsunąć je do uchwytu magnetycznego. Kulki skoncentrują się przy magnesie.

Usunąć roztwór zawierający nieprzywiązane przeciwciała i natychmiast wypłukać kuleczki, aby zapobiec ich wyschnięciu. Po dwóch płukaniach dodać 500 µL lizatu komórkowego DSP ujemnego lub DSP dodatniego w stężeniu 1 µg/mL do odpowiednich probówek. Na tym etapie można przygotować ujemną kontrolę konkurencji peptydowej, dodając do mieszaniny lizatu i kuleczek peptyd immunogenny w stężeniu określonym w eksperymentach wstępnych.

Inną możliwą kontrolą negatywną przygotowywaną na tym etapie jest reakcja zawierająca tylko bufor lub pozbawiona lizatu, przygotowana poprzez dodanie do kuleczek samych 500 µL buforu do lizy. Delikatnie resuspenduj kuleczki w reakcjach eksperymentalnych i kontrolnych. Nie używaj wirówki typu vortex, ponieważ spowoduje to zniszczenie kuleczek; inkubuj w temperaturze 4 °C przy rotacji end-over-end przez dwie godziny.

Po upływie dwóch godzin usunąć lizat za pomocą uchwytu magnetycznego. Krótko wirować i przemyć kuleczki łącznie sześć razy, używając 1 mL buforu IP. Każde przemywanie należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C przez pięć minut.

Aby eluować kompleksy związane, należy dodać jeden x bufor do próbek żelowych do probówki z IP, tuż nad osadem kulek. Aby zgromadzić kulki na dnie probówki, należy delikatnie opukać dno probówki, aż wszystkie kulki zostaną resuspensowane w buforze do próbek żelowych. Alternatywnie, w przypadku izolacji immunoadfinitowej, należy dodać 30 µL buforu A uzupełnionego o peptyd immunogenny do kulek.

Wymagane stężenie peptydu immunogennego ustala się empirycznie. Po przetestowaniu zakresu od 10 do 200 µM, należy inkubować kulki w temperaturze 4 °C przez dwie godziny, opukując probówki co 30 minut. Za pomocą uchwytu magnetycznego należy usunąć 30 µL zawierających eluowane kompleksy i przenieść je do czystej probówki, a następnie przemyć kulki buforem IP i je zachować.

Do obu metod elucji dodaj 1x bufor do próbek żelowych do kulek. Podgrzej zawiesinę immunomagnetycznych kulek w buforze do próbek żelowych w temperaturze 75 °C przez pięć minut w celu denaturacji białek. Krok ten spowoduje również rozszczepienie cząsteczki DSP, co umożliwi rozdzielenie poszczególnych białek w kompleksie podczas elektroforezy.

Próbki na żelu SDS-PAGE do western blotu. Opróżnione magnetyczne kulki immunomagnetyczne można oddzielić przez wirowanie i usunąć z próbki za pomocą uchwytu magnetycznego przed aplikacją. Jeśli EUA o powinowactwie immunologicznym jest wolne od IgG, co potwierdzono barwieniem białek w SDS-PAGE lub immunoblotami, nadaje się ono do spektrometrii mas.

Poniżej przedstawiono przykład western blotu materiału z lizatu komórkowego sieciowanego i niesieciowanego, a następnie immunomagnetycznego wytrącania z użyciem przeciwciała monoklonalnego przeciwko podjednostce AP trzech. Sieciowanie umożliwia wykrycie białek oddziałujących, których nie zaobserwowano w próbkach niesieciowanych podczas izolacji immunomagnetycznych. Kontrole negatywne nie wykazały specyficznego wyciągania białek przy użyciu kontroli bezprzeciwciałowej oraz kontroli izotypowej z zastosowaniem IgG skierowanego przeciwko receptorowi transferyny, zarówno w przypadku próbek niesieciowanych, jak i sieciowanych.

W tym przykładzie w celu odzyskania białek związanych z przeciwciałem IP zastosowano elucję peptydową powinowactwa. Należy zauważyć, że przeciwciało immunologiczne nie występuje w frakcji nadsączu i pozostaje w frakcji osadu podczas elucji peptydowej. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji labilnych kompleksów MultiPro przy użyciu chemicznego czynnika sieciującego DSP, a następnie immunomagnetycznego oczyszczania powinowactwa.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymywanie niskiej temperatury roztworów komórek i lizatów, aby zachować nietrwałe oddziaływania podczas sieciowania oraz zminimalizować aktywność proteaz. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.