Name: Zoptymalizowany test kulek żelu fibrynowego do badania angiogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test kulek żelu fibrynowego do badania angiogenezy in vitro. Ta metoda pozwala obserwować tworzenie naczyń krwionośnych, rozgałęzianie i anastomozowanie w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PRZYGOTOWANIE KOMÓREK
<ol>
<li>Hodować komórki HUVEC i fibroblasty w pożywce M199 z dodatkiem 10% FBS i Pen-Strep (1:100) przez 1–2 dni przed formowaniem kulek.</li>
<li>Zmień pożywkę na EGM-2 (Clonetics) dzień przed formowaniem kuleczek w przypadku HUVEC oraz dzień przed zamykaniem w hydrożelu w przypadku fibroblastów.</li>
<li>A&nbsp;wymagane jest stężenie wynoszące ok. 400 komórek HUVEC na kuleczkę.</li>
<li>Wymagane jest 20 000 fibroblastów na dołek.</li>
</ol>
POKRYWANIE KULEK KOMÓRKAMI HUVEC – DZIEŃ -1
<ol>
<li>Przeprowadzić trypsynizację komórek HUVEC.</li>
<li>Pozostawić kuleczki do osadzenia (NIE WIROWAĆ!). Odessać nadsącz i krótko przemyć kuleczki w 1 mL ciepłego medium EGM-2.</li>
<li>W probówce do FACS zmieszać 2500 kuleczek z 1X106 komórek HUVEC w 1,5 mL ciepłego medium EGM-2. Umieścić probówkę pionowo w inkubatorze. (Ilość ta będzie wystarczająca dla ok. 10 studzienek. W razie potrzeby zwiększyć skalę)</li>
<li>Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37°C, wstrząsając probówką co 20 min. (Prawidłowe pokrycie kuleczek jest kluczowe dla procesu kiełkowania.)</li>
<li>Po 4 godzinach przenieść pokryte kuleczki do kolby T25 w 5 mL medium EGM-2 i pozostawić przez noc.</li>
</ol>
OSADZANIE POWLEKANYCH KULEK W ŻELU FIBRYNOWYM -&nbsp;DZIEŃ 0
<ol>
<li>Przygotować 2.0 mg/mL roztwór fibrynogenu (zob. sekcję z recepturami).</li>
<li>Do roztworu fibrynogenu dodać 0.15 Units/mL aprotininy.</li>
<li>Przenieść powlekane kuleczki do stożkowej probówki 15mL i odstawić do sedymentacji. Resuspendować kuleczki w 1mL EGM-2 i przenieść do probówki wirówkowej 1.5mL.</li>
<li>Przemyć kuleczki 3X w 1mL EGM-2, powoli pipetując ciecz w górę i w dół.</li>
<li>Policzyć kuleczki na szkiełku nakrywnym i resuspendować w roztworze fibrynogenu do stężenia ~500 beads/mL.</li>
<li>Do każdego dołka dodać 0.625 Units/mL trombiny.</li>
<li>Do każdego dołka płytki 24-dołkowej dodać 0.5 mL zawiesiny fibrynogenu z kuleczkami. Zmieniać końcówkę pipety dla każdego dołka !!! </li>
<li>Wymieszać trombinę z fibrynogenem, delikatnie pipetując w górę i w dół około 4 do 5 razy. Należy uważać, aby nie wytworzyć dużych pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Pozostawić płytkę na 5 min w dygestorium, a następnie umieścić w inkubatorze 37°C na 10-15 min w celu wytworzenia skrzepu.</li>
<li>Podczas oczekiwania na utworzenie się skrzepu przeprowadzić trypsynizację fibroblastów.</li>
<li>Do każdego dołka dodać kroplami 1 mL EGM-2.</li>
<li>Wysiać fibroblasty na powierzchnię żelu fibrynowego w zagęszczeniu 20 000 komórek na dołek.</li>
</ol>
UWAGI:
Zazwyczaj po utworzeniu się żelu fibrynowego w żelu widoczne są maleńkie pęcherzyki powietrza. Nie należy się nimi niepokoić, ponieważ znikną one w ciągu 3-4 dni.
Wymieniaj pożywkę co drugi dzień, t.j. w dniu 2, 4, 6 itd...
W 3. lub 4. dniu powinny zacząć pojawiać się pędy.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

Rośnie przekonanie, że trójwymiarowe (3D) testy angiogenezy in vitro stanowią model znacznie bardziej zbliżony do rzeczywistego środowiska in vivo niż to, co można osiągnąć w hodowlach 2D. Oczywiste jest, że doskonałe systemy 3D powinny być powtarzalne i zdolne do naśladowania kilku głównych etapów angiogenezy. Choć opracowano już kilka wcześniejszych testów 3D, wiele z nich wykorzystuje trudnodostępne komórki mikrovascularne lub odtwarza jedynie niektóre etapy procesu. W tym filmie opisujemy i przeprowadzamy zoptymalizo...

<table><tbody><tr><td>Kuleczki Cytodex-3</td><td>Odczynnik</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/opakowanie. 1.0.5 g suchych kuleczek hydratuje się i pęcznieje w 50 mL PBS (pH = 7.4) przez co najmniej 3 h w RT. Należy użyć probówki 50 mL i umieścić ją na homogenizatorze obrotowym.2.Pozostawić kuleczki do osadzenia (~ 15 min). Odlać nadsącz i przemyć kuleczki przez kilka minut w świeżym PBS (50 mL).3.Odlać PBS i zastąpić świeżym PBS: 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60000 kuleczek/mL lub 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30,000 kuleczek/mL4.Umieścić zawiesinę kuleczek w silikonizowanej butelce szklanej (Windshield Wiper lub Sigmacote).5.Sterylizować kuleczki w autoklawie przez 15 min w 115&amp;#x00B0;C.6.Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/opakowanie. Zrekonstytuować liofilizowaną aprotyninę do stężenia 4 U/mL w wodzie DI. Przefiltrować sterylnie. Przygotować aliquoty po 1 mL każdy. Przechowywać w -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrynogen typu I</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. Rozpuścić 2 mg/mL fibrynogenu w DPBS. Należy odnotować % białka krzepliwego i odpowiednio dostosować. Podgrzać w kąpieli wodnej 37 &amp;#x00B0;C, aby rozpuścić fibrynogen. Mieszać poprzez odwracanie probówki. Nie używać wirówki typu vortex. Przefiltrować sterylnie przez membranę 0.22 um</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1,000 jednostek. Zrekonstytuować w sterylnej wodzie do stężenia 50 U/mL. Przygotować aliquoty po 0.5 mL każdy. Przechowywać w -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogeneza to złożony, wieloetapowy proces, w którym w odpowiedzi na bodźce angiogenne z istniejącego układu naczyniowego powstają nowe naczynia. Etapy te obejmują: degradację błony podstawnej, proliferację i migrację (kiełkowanie) komórek śródbłonka (EC) do macierzy zewnątrzkomórkowej, układanie się komórek śródbłonka w sznury, rozgałęzianie, tworzenie światła naczynia, anastomozy oraz formowanie nowej błony podstawnej. Opracowano wiele testów in vitro do badania tego procesu, jednak większość z nich naśladuje jedynie określone stadia angiogenezy, a naczynia w tych testach często nie przypominają morfologicznie naczyń in vivo. W oparciu o wcześniejsze prace Nehlsa i Drenckhahna zoptymalizowaliśmy test angiogenezy in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej oraz fibroblastów. Model ten odtwarza wszystkie kluczowe wczesne etapy angiogenezy, a co istotne, naczynia wykazują drożne światła wewnątrzkomórkowe otoczone spolaryzowanymi komórkami śródbłonka. Komórki śródbłonka są nanoszone na mikronośniki Cytodex i zatapiane w żelu fibrynowym. Fibroblasty są nakładane warstwą na wierzch żelu, gdzie dostarczają niezbędnych czynników rozpuszczalnych, które stymulują kiełkowanie komórek śródbłonka z powierzchni kulek. Po kilku dniach powstaje liczne naczynia, które można łatwo obserwować w mikroskopie fazowo-kontrastowym oraz w technice time-lapse. Niniejsze wideo prezentuje kluczowe kroki przygotowania tych hodowli.

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Angiogeneza to złożony, wieloetapowy proces, w którym w odpowiedzi na bodźce angiogenne z istniejącego układu naczyniowego powstają nowe naczynia. Te ...

Cześć, nazywam się Mar Katsu. Pochodzę z laboratorium Hughes w Katedrze Biologii Molekularnej i Biochemii na uc Irvine. Przeprowadzę test z użyciem kulek fibrynowych.Cały proces trwa dwa dni. Pierwszy dzień obejmuje powlekanie kulek komórkami nabłonka naczyniowego pępka człowieka. Drugi dzień polega na osadzaniu tych powlekanych kulek w żelach fibrynowych, a następnie nakładaniu warstwy fibroblastów na wierzch tych żeli.Wykorzystujemy ten test do badania wielu etapów angiogenezy w warunkach in vitro. Pierwszego dnia, w części pierwszej, stosujemy kuleczki CY X three. Następnie drugiego dnia używamy tych trzech odczynników: fibrynogenu, trombiny oraz aprotininy cytx.Kuleczki trzecie pochodzą z Amazon Biosciences i są specjalnie powlekane kolagenem, aby komórki śródbłonka przylegały do kuleczek. Kolejnym odczynnikiem jest fibrynogen, który pozyskujemy z firmy Sigma. Tworzy on właściwy żel lub skrzep w teście z kuleczkami.Trombina jest czynnikiem krzepnięcia. Białko to przekształca fibrynogen w fibrynę, dlatego dodajemy je do testu. Aprotynina jest inhibitorem proteaz surowiczych.Używamy tego, aby zapobiec degradacji żelu fibrynowego przez proteazy. To, co tutaj widzicie, to vac. Są t

optimized-fibrin-gel-bead-assay-for-the-study-of-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Optymalizacja metody oznaczania kul fiolbowych z żelem fibrynowym w badaniach nad angiogeneszą

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Ten film przedstawia zmodyfikowany test oparty na kulkach mikronośnika, obejmujący perycyty w celu zbadania kiełkowania śródbłonka we wczesnych stadiach angiogenezy. Test zapewnia eksperymentalny model in vitro w celu zrozumienia molekularnych mechanizmów angiogenezy i wpływu terapii antyangiogenetycznej.

Test kiełkowania kulek do oceny angiogenezy we wczesnym stadium: model oparty na kulkach in vitro do badania kiełkowania śródbłonka w obecności perycytów

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Rekapitulacja mikrośrodowiska specyficznego dla danego narządu, która stymuluje miejscową angiogenezę, jest niezbędna do skutecznej regeneracji uszkodzonych tkanek. W niniejszym raporcie przedstawiono nowatorską metodę wszczepiania żeli fibrynowych na powierzchnię płuc żywej myszy w celu zbadania, w jaki sposób mikrośrodowisko specyficzne dla płuc moduluje angiogenezę i regenerację pęcherzyków płucnych u dorosłych myszy.

Implantacja żelu fibrynowego do płuca myszy w celu zbadania angiogenezy specyficznej dla płuc

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Ten protokół przedstawia nowatorski test kulkowy in vitro, który bardziej odpowiednio modeluje proces angiogenezy kiełkowania in vivo poprzez włączenie perycytów. Ta modyfikacja umożliwia testowi kulkowemu dokładniejsze odwzorowanie heterotypowych interakcji komórkowych między komórkami śródbłonka a komórkami ściennymi, które mają kluczowe znaczenie dla angiogenezy.

Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka

Tutaj prezentujemy protokół do badania patofizjologii proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej za pomocą pobranych od pacjenta, chirurgicznie wyciętych tkanek włóknisto-naczyniowych do trójwymiarowej charakterystyki tkanek natywnych i hodowli ex vivo. Ten model hodowli ex vivo jest również podatny na testowanie lub opracowywanie nowych metod leczenia.

Model hodowli tkankowej ex vivo powikłań włóknisto-naczyniowych w proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Przedstawiona tutaj metoda może ocenić wpływ odczynników na angiogenezę lub przepuszczalność naczyń in vivo bez barwienia. Metoda wykorzystuje wstrzyknięcie dekstranu-FITC przez żyłę ogonową w celu uwidocznienia naczyń nowych lub nieszczelności naczyniowej.

Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy

Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu (SVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym oferuje łatwy i skuteczny nośnik dla żywotnych komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej dla różnych wskazań, w tym inżynierii tkankowej i/lub gojenia się ran. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie mechanicznego konstruktu hydrożelowego SVF (mSVF)-fibryna do badań translacyjnych i zastosowań klinicznych.

Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania

Tutaj prezentujemy protokół elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakrylamidowym (PAGE) do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych Sipunculus nudus.

Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym

Poznaj zoptymalizowany test kulek żelu fibrynowego do badania angiogenezy in vitro. Ta metoda pozwala obserwować tworzenie naczyń krwionośnych, rozgałęzianie i anastomozowanie w czasie rzeczywistym.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Przeglądaj więcej filmów