Name: Znakowanie fluorescencyjne białek fuzyjnych SNAP-tag z ekspresją COS-7 do obrazowania żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Naucz się znakowania fluorescencyjnego białek fuzyjnych SNAP-tag w komórkach COS-7 do obrazowania żywych komórek. Ta metoda umożliwia wizualizację lokalizacji białek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kai Johnsson 
Ivan Correa 
Andreas Brecht 
Katrin Müentener 
Chris Noren 
Luo Sun 
Ming Xu 
Theodore Davis 
Salvatore Russello 
Aihua Zhang 
Inca Ghosh 
Elissa Maunus 
Nicholas Labarthe 
James MacFarland 
John Buswell 
Brenda Desmond 
James Ellard 
Grzebień Dona

Wysiewanie komórek CHO-K1:
<ol>
 <li>Do 6 ml pełnego medium F-12K dodać 50-100 μl komórek CHO-K1 poddanych trypsynizacji zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
 <li>Zmieszać zawiesinę komórkową poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść po 300 μl zawiesiny komórek po trypsynizacji do każdej studni sterylnego 8-komorowego szkiełka podstawowego Lab-Tek II Chambered Coverglass z komorami z borokrzemianowego szkła okrywkowego nr 1,5 (Nalgene Nunc Int.; Product #155409; Lot: 100808-8-0).</li>
 <li>Próbki inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
Przejściowa transfekcja komórek CHO-K1 plazmidami pSNAP-ADRB2 i pSNAP-H2B:
<ol>
	<li>Należy sprawdzić komory hodowli komórkowej zasiane w poprzednim dniu, aby ocenić gęstość oraz stan zdrowia komórek.</li>
	<li>Oznakuj odpowiednią liczbę probówek do mikrowirówki.</li>
	<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przygotować mieszaniny kompleksów do transfekcji zgodnie z poniższą tabelą próbek, wykorzystując albo 0.3 μg plazmid kontrolny DNA pSNAP-ADBR2 lub 0.3 μg plazmidowego DNA kontrolnego pSNAP-H2B, 1 μl TransPass D2 oraz 1 μl TransPass V na reakcję.
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
	<tbody>
		<tr>
		 <td>plazmid</td>
		 <td>liczba reakcji</td>
		 <td>μl pożywki bezsurowiczej</td>
		 <td>μl TransPass D2</td>
		 <td>μl z TransPass V</td>
		 <td>μl DNA plazmidowego</td>
 		 <td>μl z TransPass D2/reakcji</td>
 	 	 <td>μl TransPass V/reakcja</td>
		 <td>ng DNA/reakcję</td>
		 <td>stężenie DNA (ng/μl)</td>
		 <td>μl plazmidowego DNA/reakcji</td>
 		 </tr>
 		 <tr>
		 <td>SNAP-ADRb2</td>
		 <td>5</td>
		 <td>236.5</td>
		 <td>5</td>
		 <td>5</td>
		 <td>3.5</td>
		 <td>1</td>
		 <td>1</td>
		 <td>300</td>
		 <td>472.34</td>
		 <td>0.7</td>
	 </tr>
 	 <tr>
		 <td>H2B-SNAP</td>
		 <td>5</td>
 		 <td>237</td>
 		 <td>5</td>
 		 <td>5</td>
 		 <td>3</td>
 		 <td>1</td>
		 <td>1</td>
		 <td>300</td>
		 <td>515.89</td>
		 <td>0.6</td>
	 </tr>
	 <tr>
		 <td>Symulacja</td>
		 <td>5</td>
		 <td>240</td>
		 <td>5</td>
		 <td>5</td>
		 <td>0</td>
		 <td>1</td>
		 <td>1</td>
		 <td>0</td>
		 <td>0</td>
		 <td>0</td>
 	 </tr>
 	 <tr>
 		 <td>Nietransfekowane</td>
 		 <td>5</td>
 		 <td>250</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
		 <td>0</td>
	 </tr>
	</tbody>
</table>
</li>
	<li>Najpierw należy zmieszać bezsurowicze podłoże F-12K z odpowiednim plazmidowym DNA, następnie dodać odczyn do transfekcji TransPass D2, a potem odczyn do transfekcji TransPass V. Po dodaniu każdego odczynnika należy dokładnie wymieszać składniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół kilka razy.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji wypłucz komórki raz za pomocą 600 μl pełnego medium DMEM i dodać 450 μl pełnego medium DMEM do każdej próbki.</li>
	<li>Dodaj 50 μl mieszaninę kompleksów transfekcyjnych do każdej próbki, powoli i kroplami.</li>
	<li>Inkubować próbki przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO22.</li>
</ol>
Znakowanie komórek CHO-K1 przejściowo transfekowanych pSNAP-ADRB2 i pSNAP-H2B za pomocą SNAP-Cell TMR Star:
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń medium z kompleksem transfekcyjnym z każdej próbki za pomocą ssania próżniowego. Przemyj komórki dwukrotnie 600 μl pełnego medium F-12K i zastąp medium w każdej studience 600 μl pełnego F-12K.</li>
	<li>Przygotuj medium do znakowania barwnikiem, dodając 995 μl pełnego F-12K i 51 μl 0.6 mM substratu SNAP-Cell TMR-Star. Końcowe stężenie SNAP-Cell TMR-Star powinno wynosić 3mM. Po dodaniu substratu wymieszaj roztwór, kilkukrotnie pobierając i wypuszczając go pipetą.</li>
	<li>Ostrożnie usuń medium wzrostowe z próbek i dodaj 200 μl medium do znakowania barwnikiem do każdej studzienki. Inkubuj próbki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 30 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji próbek przygotuj roztwór Hoechst 33342 do barwienia jąder komórkowych, mieszając 1 μl Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (roztwór 10 mg/ml w wodzie, stężenie 16.2 mM; Invitrogen Molecular Probes) w 10 ml pełnego F-12K.</li>
	<li>Usuń medium ze wszystkich próbek i dodaj 600 μl rozcieńczonego roztworu Hoechst do każdej próbki. Inkubuj próbki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 5 minut.</li>
	<li>Przemyj próbki trzykrotnie 600 μl pełnego F-12K.</li>
	<li>Inkubuj próbki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez dodatkowe 30 minut, aby umożliwić dyfuzję niezwiązanego fluoroforu z komórek.</li>
	<li>Po 30 minutach wymień medium w próbkach SNAP-Cell po raz ostatni i przystąp do obrazowania.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie komórek przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss Apotome Axiovert 200M.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek, niebieskie jądra, czerwona cytoplazma, wykorzystany w badaniach z zakresu biologii komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazowania fluorescencyjnego z zastosowaniem standardowej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek COS-7 wykazujących ekspresję fuzji SNAP-tag. Pierwszy obraz przedstawia żywe komórki COS-7 exprimujące pSNAP-H2B (histon jądrowy) znakowane SNAP-Cell TMR-Star. Konstrukt pSNAP-H2B został wygenerowany przy użyciu wektora pSNAP-tag(m). Komórki znakowano SNAP-Cell TMR-Star przez 30 minut, a następnie wykonano barwienie kontrastowe jąder Hoechst 33342 (niebieski). Różowa fluorescencja stanowi nałożenie czerwonej fluorescencji w miejscach występowania białka histonowego na niebieską fluorescencję wskazującą jądro komórkowe. Ekspresja białka H2B jest wyraźna i łatwa do zidentyfikowania.
<img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej jądra komórkowego, z DNA barwionym na niebiesko i białkami na czerwono do analizy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej barwionych komórek przedstawiający jądro komórkowe i cytoplazmę do analizy komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Ryciny 2 i 3. Te dwa kolejne obrazy przedstawiają żywe komórki COS-7 przejściowo transfekowane pSNAP-ADRβ2. Komórki znakowano SNAP-Cell TMR-Star (czerwony) i barwiono kontrastowo Hoechst 33342 (niebieski). Konstrukt pSNAP-ADRβ2 został wygenerowany przy użyciu wektora pSNAP-tag(m). Komórki znakowano SNAP-Cell TMR-Star przez 30 minut i barwiono kontrastowo Hoechst 33342 (niebieski) w celu wybarwienia jąder. Czerwona fluorescencja wskazuje na obecność białka receptora powierzchni komórkowej ADRB2, natomiast niebieska fluorescencja identyfikuje jądro.

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

Autorzy są zatrudnieni przez firmę New England Biolabs, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.

Na obserwowane wyniki wpływa kilka zmiennych, takich jak ostrość, intensywność lasera, możliwości sprzętowe, zastosowany obiektyw itp. Fotostabilność fluoroforu determinuje, jak szybko należy zarejestrować fluorescencję przed jej wygaszeniem.
Ta metoda znakowania białek jest wszechstronna i odpowiednia do wielu zastosowań. Technologie SNAP-tag i CLIP-tag, służące do specyficznego znakowania białek fuzyjnych za pomocą sond syntetycznych, umożliwiają badanie różnych aspektów funkcji białek, w tym różnorodnych procesów dynamicznych w żywych komórkach oraz w lizatach komórkowych. Technologie SNAP-, CLIP-, MCP- i ACP-tag zapewniają prostotę i nadzwyczajną wszechstronność w obrazowaniu białek w komórkach żywych i utrwalonych, a także w badaniach białek in vitro. Stworzenie pojedynczej konstrukcji genowej pozwala na uzyskanie znakowanego białka fuzyjnego zdolnego do tworzenia wiązania kowalencyjnego z różnymi grupami funkcyjnymi, w tym z fluoroforami, biotyną lub kuleczkami. Białko docelowe musi zostać sklonowane i wyekspresjonowane tylko raz, a następnie fuzja ta może być wykorzystywana z wieloma fluorescencyjnymi substratami w licznych zastosowaniach analitycznych, takich jak jednoczesne znakowanie białek wewnątrz żywych komórek, badanie lokalizacji i translokacji białek, eksperymenty typu pulse-chase, badania internalizacji receptorów, selektywne znakowanie powierzchni komórki, testy pull-down, detekcja białek w SDS-PAGE, cytometria przepływowa, wysokoprzepustowe testy wiązania na płytkach mikrotitracyjnych, eksperymenty z interakcjami biosensorowymi oraz testy wiązania oparte na FRET.

<table><tbody><tr><td>Komórki CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Bezserumowe pożywka F-12K</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe z komorami Lab-Tek II ze szkiełkiem borokrzemianowym #1.5</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>Partia: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342, trihydrochlorowodorek, trihydrat (roztwór 10 mg/ml w wodzie, roztwór 16.2 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Zeiss Apotome Axiovert 200M</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plazmid kontrolny pSNAP-ADBR2</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plazmid kontrolny pSNAP-H2B</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjne znakowanie linii cos-7 wykazujących ekspresję białek fuzyjnych snap-tag w celu obrazowania żywych komórek

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Systemy znakowania białek SNAP-tag i CLIP-tag umożliwiają specyficzne, kowalencyjne przyłączanie cząsteczek, w tym barwników fluorescencyjnych, do białka docelowego w żywych komórkach. Systemy te oferują szeroki wybór substratów fluorescencyjnych zoptymalizowanych dla różnych urządzeń do obrazowania. Po sklonowaniu i ekspresji białko z tagiem może być wykorzystywane z różnymi substratami w licznych zastosowaniach analitycznych bez konieczności ponownego klonowania. Stosowanie tego systemu składa się z dwóch etapów: klonowania i ekspresji białka docelowego jako fuzji z SNAP-tagiem oraz znakowania tej fuzji wybranym substratem SNAP-tag. SNAP-tag jest małym białkiem opartym na ludzkim O6-alkilguaninowa-DNA-alkilotransferaza (hAGT), białko naprawy DNA. Etykiety SNAP-tag to barwniki sprzężone z grupami opuszczającymi guaniny lub chloropirymidyny za pomocą łącznika benzylowego. W reakcji znakowania podstawiona grupa benzylowa substratu zostaje kowalencyjnie przyłączona do SNAP-tagu. CLIP-tag jest zmodyfikowaną wersją SNAP-tagu, zaprojektowaną tak, aby reagować z pochodnymi benzylo-cytozyny zamiast benzylo-guaniny. Stosowany wspólnie z SNAP-tagiem, CLIP-tag umożliwia ortogonalne i komplementarne znakowanie dwóch białek jednocześnie w tych samych komórkach.

Systemy znakowania białek SNAP-tag i CLIP-tag umożliwiają specyficzne, kowalencyjne przyłączanie cząsteczek, w tym barwników fluorescencyjnych, do białka docelowego w żywych komórkach. Po sklonowaniu i ekspresji białko z tagiem może być stosowane z różnymi substratami w wielu dalszych zastosowaniach bez konieczności ponownego klonowania.

Fluorescencyjne znakowanie linii COS-7 wykazujących ekspresję białek fuzyjnych SNAP-tag w celu obrazowania żywych komórek

Systemy znakowania białek SNAP-tag i CLIP-tag umożliwiają specyficzne, kowalencyjne przyłączenie cząsteczek, w tym barwników fluorescencyjnych, do białka docelowego...

Znaczniki SNAP i CLIP. Systemy znakowania białek umożliwiają specyficzne kowalencyjne przyłączenie praktycznie dowolnej cząsteczki do białka zainteresowania. Gen zainteresowania można sklonować do wektora po dowolnej stronie znacznika; ekspresja sklonowanego genu prowadzi do powstania białka fuzyjnego z znacznikiem SNAP.Podłoże snap tag składa się z dwóch części: benzoquinonu, który jest rozpoznawany przez snap tag, oraz grupy funkcyjnej. Grupą funkcyjną może być biotyna, kuleczka lub grupa fluorescencyjna, dostępna w różnych kolorach. Podczas reakcji znakowania podstawiona grupa benzo przyłącza się kowalencyjnie do SNAP tag, uwalniając guaninę. Jeśli z pożądanym białkiem sprzężony jest Fluora four, znacznik fluorescuje, co umożliwia wizualizację białka w komórkach żywych lub utrwalonych.Witajcie, jestem Chris Provost z New England Bile Labs. Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek COS-7 wykazujących ekspresję białek fuzyjnych z SNAP-tagiem. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania lokalizacji białek w komórkach.Zacznijmy zatem. Aby przygotować komórki COS-7 do transfekcji, należy je trypsynizować zgodnie ze standardowymi protokołami, a następnie dodać 50 do 100 µL komórek do 6 mL kompletnego medium DMEM. Wymieszaj zawiesinę komórkową, pipetując ją kilkukrotnie w górę i w dół. Następnie odmień 300 µL ztrypsynizowanej zawiesiny komórkowej do każdej studni sterylnego, ośmiokomorowego naczynia Lab-Tech z pokrywkami szklanymi. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 przez noc. Następnego dnia.Sprawdzić gęstość i stan zdrowia komórek w komorach hodowlanych. Oznakować odpowiednią liczbę probówek do mikrocentryfugi na mieszaniny kompleksów do transfekcji. W komorze z laminarnym przepływem powietrza.Przygotuj mieszaniny kompleksów transfekcyjnych dla każdej reakcji. Użyj 0,3 µg plazmidowego DNA snap fusion rozcieńczonego w medium bezsurowiczym i jednego 1 µL. Każdy z odczynników do transfekcji TPAs D two oraz TPAs v wraz z plazmidami kontrolnymi są dostępne w celu oceny skuteczności odczynników do transfekcji.Zalecamy również uwzględnienie próbki poddanej transfekcji pozornej oraz/lub próbki niewyciętej jako kontroli negatywnych dla każdej złożonej mieszaniny. Najpierw wymieszaj DMEM bez surowicy z odpowiednim plazmidowym DNA. Następnie dodaj odczynnik do transfekcji TPAs D, a po nim odczynnik do transfekcji TPAs v.Po dodaniu każdego z odczynników należy dokładnie wymieszać składniki, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół, a następnie inkubować mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 30 minut; w czasie inkubacji komórki należy wypłukać raz 600 µL pełnej pożywki DMEM, a do każdej próbki dodać 450 µL pełnej pożywki DMEM. Po zakończeniu inkubacji do każdej próbki należy powoli, kroplami, dodać 50 µL mieszaniny kompleksu transfekcyjnego. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2.Następnego dnia. Transfekowane komórki Cost seven można znakować substratem Snap-cell TMR*, aby rozpocząć tę procedurę. Do substratu Snap-cell TMR* dodać 50 µL DMSO i wymieszać, pipetując w górę i w dół lub poprzez wirowanie w wortexie przez jedną minutę. Następnie należy ostrożnie usunąć medium z kompleksem transfekcyjnym z każdej próbki za pomocą ssania próżniowego i dwukrotnie przemyć komórki 600 µL kompletnego DMEM.Następnie zastąp medium w każdej studzience 600 µL kompletnego DMEM. Przenieś próbki z powrotem do inkubatora. Przygotuj medium znakujące D, dodając 995 µL kompletnego DMEM oraz pięć µL roztworu 0,6 mM.Po dodaniu substratu pipetować substrat snap cell TMR star wielokrotnie w górę i w dół w celu wymieszania. Końcowe stężenie snap cell TMR STAR powinno wynosić 3 µM. Ostrożnie usunąć pożywkę wzrostową z próbek i dodać 200 µL pożywki do znakowania DIA do każdej studni; inkubować próbki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez 30 minut. Na tym etapie grupa benzylowa w substracie TMR zwiąże się kowalencyjnie z snap tagiem i uwolni quain podczas inkubacji próbek.Przygotować roztwór HX do barwienia jąder komórkowych w próbkach. Wymieszać 1 µL HSED 3 33 42 Tri Hydrochloride TRI w 10 mL kompletnego DMEM. Po zakończeniu inkubacji usunąć medium do znakowania ze wszystkich próbek i dodać 600 µL rozcieńczonego roztworu hooked do każdej próbki.Inkubować próbki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide przez pięć minut. Po pięciu minutach usunąć rozcieńczony roztwór hooked z każdej próbki i przemyć próbki trzykrotnie 600 µL kompletnej pożywki DMEM. Po ostatnim przemyciu dodać do każdej próbki 600 µL kompletnej pożywki DMEM.Próbki inkubować w temperaturze 37°C w atmosferze 5% carbon dioxide przez dodatkowe 30 minut, aby umożliwić dyfuzję nieprzyłączonego fluoroforu z wnętrza komórek, co jest niezbędne do znakowania wewnątrzkomórkowego. Po 30 minutach po raz ostatni wymienić medium w próbkach snap cell na 600 µL pełnego DMEM. Komórki są teraz gotowe do obrazowania z użyciem fluorescencyjnego mikroskopu zeis AOME vert 200 M.Oto reprezentatywne wyniki obrazowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem standardowej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek COS-7 wykazujących ekspresję fuzji z tagiem. Pierwszy obraz przedstawia żywe komórki COS-7 wykazujące ekspresję PNAP-H2B znakowanego Snap-Cell TMR*. Konstrukt pnap-H2B został wygenerowany przy użyciu wektora PNAP-TAG-M.Komórki znakowano barwnikiem snap cell TMR star przez 30 minut, a następnie zastosowano przeciwbarwienie Hoechst 33342 dla jąder komórkowych. Różowa fluorescencja reprezentuje nakładanie się fluorescencji czerwonej w miejscach występowania białek histonowych. Oprócz niebieskiej fluorescencji wskazującej jądro komórkowe, ekspresja białka H2B jest wyraźna i łatwa do zidentyfikowania.Kolejne dwa obrazy przedstawiają żywe komórki cost seven przejściowo transfektowane pnap. Komórki A DR beta two zostały znakowane snap cell, tmr, star i barwione kontrastowo HUX 3 33 42. Konstrukt pnap A DR beta two został wygenerowany przy użyciu wektora PNAP TAG M.Komórki znakowano snap cell TMR star przez 30 minut, a następnie zastosowano barwienie kontrastowe Hoechst 33342 dla jąder komórkowych. Czerwona fluorescencja wskazuje obecność białka receptora powierzchniowego komórki $\text{A}_{\text{DR}}\beta_2$, natomiast niebieska fluorescencja identyfikuje jądro. Przedstawiliśmy sposób wykonania obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek كو7 wykazujących ekspresję białek fuzyjnych z snap-tagiem.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o powolnym, kroplowym dodawaniu kompleksu transfekcyjnego oraz o przechowywaniu substratu snap tag w temperaturze -20 °C w ciemności, gdy nie jest on używany. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

fluorescent-labeling-cos-7-expressing-snap-tag-fusion-proteins-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fluorescencyjne oznakowanie białek fuzyjnych SNAP-tag występujących w komórkach COS-7 w celu obrazowania żywych komórek

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Barwniki biarseniowe FlAsH i ReAsH wiążą się specyficznie z motywami tetracysteiny w białkach i mogą selektywnie znakować białka w żywych komórkach. Niedawno strategia znakowania ta została wykorzystana do opracowania sensorów różnych konformacji białek lub stanów oligomerycznych. Opisujemy podejście do znakowania oraz metody ilościowej analizy wiązania.

Znakowanie ReAsH/FlAsH oraz analiza obrazu białek sensorowych tetracysteiny w komórkach

Opracowaliśmy test fuzji komórek, który pozwala na ilościowe określenie zdarzeń fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy.

Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodę określania okresu półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu znakowania impulsowego i fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego białek fuzyjnych znaczników SNAP.

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Naucz się znakowania fluorescencyjnego białek fuzyjnych SNAP-tag w komórkach COS-7 do obrazowania żywych komórek. Ta metoda umożliwia wizualizację lokalizacji białek w czasie rzeczywistym.

Fluorescencyjne znakowanie linii COS-7 wykazujących ekspresję białek fuzyjnych SNAP-tag w celu obrazowania żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów