Name: Obrazowanie poklatkowe mitozy po transfekcji siRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę obrazowania poklatkowego mitozy w żywych komórkach ssaków po transfekcji siRNA. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki chromosomów i kwantyfikację zmian w czasie podziału komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), National Institutes of Health (R01 GM61275 oraz P30 CA042014), Leukemia and Lymphoma Society oraz Huntsman Cancer Foundation.

transfekcja siRNA i przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Przygotować 4-dołkową szkiełko przedmiotowe z komorami LabTek II, dodając 0,5 mL fibronektyny (10μg/mL) do każdego otworu, który będzie wykorzystany. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować kompleksy siRNA/Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) do transfekcji odwróconej zgodnie z instrukcjami producenta. Należy użyć ilości zalecanych dla jednego dołka płytki 24-dołkowej na każdą komorę przeznaczoną do użycia (łącznie 100μL). Można zastosować analogiczny produkt/protokół transfekcji siRNA.</li>
 <li>Usunąć fibronektynę z dołków szkiełka z komorami. Do każdego wykorzystanego dołka dodać 100μL kompleksów siRNA/Lipofectamine RNAiMAX.</li>
 <li>Do każdego dołka zawierającego mieszaninę do transfekcji przelać 20 000 komórek wykazujących ekspresję histonu H2B-mCherry (w 500μL).</li>
 <li>Inkubować komórki przez ok. 24 godziny przed zastąpieniem mieszaniny do transfekcji 1mL standardowej pożywki hodowlanej.</li>
 <li>Inkubować komórki przez kolejne 24 godziny przed akwizycją obrazów (48 godzin po transfekcji).</li>
</ol>
Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazu
<ol start="7">
 <li>Układ do akwizycji obrazów składa się z trzech głównych części: 1) inkubatora komórkowego montowanego na stoliku mikroskopu, który utrzymuje stałą wilgotność, temperaturę 37°C oraz stężenie 5% CO2; 2) mikroskopu odwróconego wyposażonego w zautomatyzowany stolik, automatyczne przesłony dla fluorescencji i światła przechodzącego oraz automatyczne koła filtrowe; oraz 3) pakietu oprogramowania, który integruje i steruje stolikiem, przesłonami oraz kołami filtrowymi. W naszym układzie obrazowania stosujemy dostosowany inkubator komórkowy firmy OKO Lab, który można wykorzystać z szkiełkami przedmiotowymi z komorami LabTek II. Stolikiem, przesłonami i kołami filtrowymi steruje oprogramowanie Metamorph. Wskazówka: System inkubatora nablatowego OKO Lab zawiera adaptery dla różnych rozmiarów płytek, naczyń lub szkiełek przedmiotowych.</li>
 <li>Umieść szkiełko przedmiotowe z komorami LabTek II w inkubatorze, otwierając pokrywę wstępnie ogrzanego i ustabilizowanego inkubatora, wkładając szkiełko do adaptera i mocując je za pomocą plasteliny modelarskiej. Pozostaw pokrywkę na szkiełku z komorami, aby pożywka hodowlana nie wyschła. Zamknij pokrywę i ustaw cały inkubator na stoliku mikroskopu, upewniając się, że inkubator jest stabilnie zamocowany.</li>
 <li>Za pomocą programu Metamorph skonfiguruj eksperyment, wybierając „Apps/Multidimensional Acquisition” w pasku menu oprogramowania. Spowoduje to otwarcie okna, w którym można wybrać częstotliwość i czas trwania timelapse, czas ekspozycji dla każdego koloru (w przypadku stosowania wielu ustawień), liczbę i położenie pozycji stolika oraz liczbę sekcji z (jeśli jest wymagane). Wybierz miejsce zapisu plików z danymi. Wskazówka: W przypadku korzystania z oprogramowania innego niż Metamorph funkcje mogą się nieco różnić, ale ogólna koncepcja pozostaje taka sama. Doskonałą alternatywą jest Micromanager – otwartoźródłowe oprogramowanie do akwizycji oparte na ImageJ, kompatybilne z większością konfiguracji sprzętowych.</li>
 <li>Na potrzeby niniejszego protokołu będziemy pobierać obrazy przy dwóch długościach fal (światło przechodzące i mCherry) co 15 minut przez 8 godzin w 15 pozycjach stolika. Wskazówka: Jeśli wymagana jest lepsza rozdzielczość czasowa, można skrócić odstęp czasu między akwizycjami; wówczas należy jednak użyć mniejszej liczby pozycji stolika, przez co do analizy dostępnych będzie mniej komórek w fazie mitozy. Przy określaniu odstępów czasowych ważne jest uwzględnienie czasu potrzebnego na przełączenie zestawów filtrów w kole filtrowym.</li>
 <li>Wyznacz optymalny czas ekspozycji dla każdej długości fali, najpierw ustawiając ostrość na polu komórek przy użyciu oświetlenia polem jasnym. W oprogramowaniu dostosuj funkcję autofokusu tylko dla kanału światła przechodzącego (pozwoli to oprogramowaniu automatycznie ustawić ostrość w każdej pozycji stolika przed każdą akwizycją). Wskazówka: Stosujemy suchy obiektyw fazokontrastowy 40x, aby uzyskać doskonałą rozdzielczość bez konieczności użycia olejku. W zależności od wymaganej rozdzielczości optycznej można zastosować inne obiektywy.</li>
 <li>Przełącz na długość fali dla mCherry i wykonaj zdjęcie przy czasie ekspozycji 50 ms. Dostosuj czas ekspozycji do minimum niezbędnego do uzyskania dobrego obrazu. Niezbędne jest ograniczenie ekspozycji na światło w celu zapewnienia utrzymania żywotności komórek. Zasadniczo najlepiej osiągnąć to poprzez zastosowanie filtra neutralnego (aby zmniejszyć strumień światła wzbudzenia) i wydłużenie czasu ekspozycji kamery, zamiast zwiększać natężenie oświetlenia. Powtórz tę procedurę dla wszystkich dodatkowych długości fal, które mają być użyte. Wskazówka: Aby określić długoterminową żywotność komórek przy danej ekspozycji w Twoim eksperymencie, możesz sprawdzić całkowitą liczbę obrazów, przy których komórka przeżyje podczas planowanego timelapse, tymczasowo zmieniając odstępy między punktami czasowymi z minut na sekundy (np. 10 min staje się 10 sekundami). Jeśli komórki przeżyją 100–200 ekspozycji (lub odpowiednią liczbę), ekspozycja jest prawidłowa. W przeciwnym razie zmniejsz światło wzbudzenia, czas ekspozycji lub całkowitą liczbę obrazów, aby zasymulować pełny eksperyment.</li>
 <li>Następnie wybierz i zaznacz odpowiednią liczbę pozycji stolika, aby uzyskać właściwą próbkę populacji komórek. Metamorph zapisze te pozycje i będzie do nich powracać przy każdej akwizycji. Wskazówka: Zazwyczaj staram się znaleźć pozycje, w których znajduje się dużo komórek do obrazowania, ale nie tak wiele, by były zbyt gęste. Ważne jest również wybranie wystarczającej liczby pozycji, aby mieć dużą szansę na zaobserwowanie wielu komórek przechodzących przez mitozę.</li>
 <li>Po zarejestrowaniu wszystkich informacji dotyczących timelapse, czasu ekspozycji dla długości fal i pozycji stolika, wybierz przycisk „Preview” na ekranie, aby sprawdzić, czy oprogramowanie prawidłowo steruje urządzeniami.</li>
 <li>Po upewnieniu się, że wszystko jest w porządku, wybierz przycisk „Acquire” na ekranie, aby rozpocząć akwizycję. Następnie pozostaw komputer i mikroskop do wykonania pracy. Wskazówka: Obserwuj automatyzację przez co najmniej jeden pełny cykl akwizycji, aby upewnić się, że wszystko działa prawidłowo.</li>
</ol>
Przetwarzanie i analiza obrazu
<ol start="16">
 <li>Po zakończeniu akwizycji kolejnym krokiem jest przekształcenie danych obrazowych w formę łatwiejszą w obróbce. Na potrzeby niniejszego protokołu zaprezentuję najpierw, jak generować filmy za pomocą programu Metamorph, a następnie, jak tworzyć montaże obrazów w programie ImageJ. Oba formaty będą przydatne do celów ilościowych.</li>
 <li>Pierwszym krokiem jest przegląd danych. W tym celu należy wybrać z paska menu opcję „Apps/Review Multidimensional Data”. Wskaż lokalizację plików, a następnie wybierz „View”. Pozwoli to na indywidualny przegląd stosu obrazów dla każdej pozycji stolika. Wybierz żądaną pozycję stolika, a następnie „Load Images”. Można teraz przesuwać się przez dane klatka po klatce.</li>
 <li>Dla tych pozycji stolika, w których komórki przechodzą mitozę (co określono na podstawie DNA oraz morfologii komórkowej), można tworzyć filmy i montaże za pomocą programu Metamorph lub innych programów, takich jak ImageJ (dostępny bezpłatnie poprzez NIH).</li>
 <li>Aby stworzyć film w programie Metamorph, wybierz z paska menu opcję „Process/Save movie”. Będzie można wybrać klatki do wykorzystania, prędkość oraz typ pliku filmu. Następnie wybierz „Save Movie”.</li>
 <li>Aby stworzyć montaż, zapisuję stos obrazów jako plik .stk, który może być wykorzystany w innych programach, takich jak ImageJ.</li>
 <li>Otwórz plik w programie ImageJ i przechodź przez klatki, aż znajdziesz komórkę przechodzącą mitozę. Wytnij obszar wokół komórki i wybierz „Image/Duplicate”. Wskazówka: Upewnij się, że powielono wszystkie klatki.</li>
 <li>Aby stworzyć montaż, wybierz z paska menu opcję „Image/Stacks/Make Montage”. Można tutaj określić, które klatki mają zostać uwzględnione, rozmiar i kształt montażu oraz czy między klatkami mają znajdować się obramowania. Wybierz te parametry i zatwierdź przyciskiem „Okay”. Zapisz montaż jako plik .tif i wykonaj dalszą obróbkę w programie ImageJ lub Adobe Photoshop. Wskazówka: Zmień pliki montażu z formatu 16-bitowego stosowanego przez Metamorph na format 8-bitowy, aby ułatwić przetwarzanie obrazów.</li>
 <li>Aby obliczyć czas trwania poszczególnych etapów mitozy, wyznacz t=0 (pierwsza oznaka kondensacji DNA lub zaokrąglenia komórki), policz liczbę klatek do momentu ułożenia chromosomów na równiku (czas w profazie/prometafazie), liczbę klatek do momentu rozpoczęcia segregacji chromosomów (czas w metafazie) oraz liczbę klatek do momentu, gdy komórki zaczną się spłaszczać (anafaza/telofaza/cytokineza). Obliczony czas dla każdego etapu mitozy zależy od odstępu czasowego między poszczególnymi klatkami.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" alt="Cykl komórkowy mitozy, fazy przedstawione w mikroskopii poklatkowej, ustawienie chromosomów, fluorescencja jądra." data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 1 przedstawia wyniki typowego eksperymentu kontrolnej transfekcji siRNA z użyciem linii komórek HeLa wykazujących ekspresję histony H2B-mCherry. Metoda ta była skutecznie stosowana do ilościowego określania czasu trwania mitozy, ujawniając nieoczekiwaną rolę nukleoporyny Nup153 w czasie trwania późnej fazy mitozy1. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li>
<li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li>
<li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li>
<li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC%2FC%28Cdc20%29+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li>
<li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li>
<li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li>
<li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li>
<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

Dzięki niedawnym postępom w obrazowaniu i technologii białek fluorescencyjnych, obrazowanie żywych komórek stało się rutynowym elementem analizy komórkowej2. Szeroko dostępne lub stosunkowo łatwe do skonstruowania białka znakowane GFP (oraz innymi wariantami kolorystycznymi3) mogą być wykorzystywane do śledzenia wielu cech charakterystycznych dla podziału komórki, w tym dynamiki DNA/chromosomów4, 5, duplikacji centrosomów6, dynamiki cykliny B7, rozpadu i ponownego formowania się otoczki jądrowej8, 9, tworzenia wrzeciona mitotycznego10 oraz różnych etapów cytokinezy11. Białka znakowane można stosować pojedynczo lub w kombinacjach, gdy widma wzbudzenia/emisji znaczników fluorescencyjnych są kompatybilne, co pozwala na ocenę koordynacji między konkretnymi zdarzeniami. W przypadku potrzeby uzyskania większej rozdzielczości przestrzennej i/lub czasowej można zastosować mikroskopię konfokalną – niezależnie od tego, czy jest to skanowanie laserowe, dysk obrotowy czy skanowanie rezonansowe – a lista zaawansowanych opcji mikroskopowych o coraz wyższej rozdzielczości stale rośnie. Obrazowanie żywych komórek ssaków podczas mitozy zostało również przystosowane do zastosowania w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych RNAi oraz małych cząsteczek12-14. Zatem, choć pierwsze eksperymenty z wykorzystaniem tej techniki mogą być stosunkowo proste, możliwości rozbudowy tej strategii są ogromne.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki z komorami Lab Tek II (4-dołkowe)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>Dostępne są dodatkowe rozmiary komór</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator komórkowy na stolik mikroskopu</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>Można użyć dowolnej odpowiedniej komory</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Można użyć dowolnego odpowiedniego mikroskopu</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania</td><td>Metamorph</td><td></td><td>Można użyć dowolnego odpowiedniego oprogramowania</td></tr></tbody></table>

obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji sirna

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zmiany w organizacji komórkowej i dynamice chromosomów zachodzące podczas mitozy są ściśle skoordynowane, aby zapewnić dokładne dziedziczenie zawartości genomowej i komórkowej. Kluczowe zdarzenia mitozy, takie jak ruch chromosomów, można łatwo śledzić w pojedynczych komórkach, wykorzystując fluorescencyjną mikroskopię poklatkową (time-lapse) linii komórkowych ssaków wykazujących ekspresję specyficznych białek znakowanych GFP. W połączeniu z wyciszaniem opartym na RNAi może to być potężna metoda pozwalająca na precyzyjne określenie etapu lub etapów mitozy, na których pojawiają się defekty po obniżeniu poziomu konkretnego białka. W niniejszym protokole przedstawiamy podstawową metodę oceny wpływu wyciszenia potencjalnego białka regulacyjnego mitozy na czas trwania mitozy. Komórki są transfekowane siRNA, umieszczane w komorze inkubacyjnej na stoliku mikroskopu i obrazowane przy użyciu zautomatyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego. Opisujemy sposób wykorzystania oprogramowania do konfiguracji eksperymentu poklatkowego, przetwarzania sekwencji obrazów w celu utworzenia montaży obrazów statycznych lub filmów, a także kwantyfikacji i analizy czasu trwania etapów mitozy z wykorzystaniem linii komórkowej wykazującej ekspresję histony H2B znakowanej mCherry. Na koniec omawiamy ważne kwestie dotyczące projektowania eksperymentu poklatkowego. Strategia ta jest komplementarna wobec innych podejść i oferuje następujące zalety: 1) wrażliwość na zmiany w kinetyce, których mogłoby nie być zauważono podczas badania komórek jako populacji oraz 2) możliwość analizy mitozy bez konieczności synchronizacji cyklu komórkowego za pomocą leków. Informacje wizualne z takich eksperymentów obrazowych pozwalają nie tylko na ocenę podetapów mitozy, ale mogą również dostarczyć nieoczekiwanych spostrzeżeń, które nie byłyby widoczne podczas analizy cyklu komórkowego metodą FACS.

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Zmiany w organizacji komórkowej i dynamice chromosomów, które zachodzą podczas mitozy, są ściśle koordynowane, aby zapewnić dokładne dziedziczenie genomu i...

Zmiany w organizacji komórkowej i dynamice chromosomów zachodzące podczas mitozy są ściśle koordynowane, aby zapewnić dokładne dziedziczenie zawartości genomicznej i komórkowej. W niniejszym artykule wideo przedstawiono metodę śledzenia kluczowych zdarzeń mitozy. Ruch chromosomów jest monitorowany na poziomie pojedynczych komórek z wykorzystaniem linii komórkowych wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie.Transfekcja siRNA skierowana przeciwko białkom mitotycznym prowadzi do zmian w cyklu komórkowym, które można zwizualizować za pomocą obrazowania time-lapse i ilościowo określić poprzez analizę obrazu. Cześć, jestem Douglas Mackey z laboratorium Katie Oman w Huntsman Cancer Institute na Uniwersytecie Utah. Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania żywych komórek podczas przechodzenia przez mitozę po transfekcji siRNA.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę, aby badać wpływ zaburzeń białek docelowych na czas trwania przebiegu mitozy. Zacznijmy zatem. Przygotuj dwukomorowe szkiełko podstawne typu four wall lab tech, dodając do każdej komory 0,5 milliliters fibronektyny.Inkubować przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotować kompleksy irna i lip RNAI max do transfekcji odwrotnej. Zgodnie z instrukcjami producenta dla każdej komory, należy użyć ilości zalecanej dla jednej dołka płytki 24-dołkowej.Po 15 minutach usunąć fibronektynę z dołków szkiełka podstawowego z komorami. Następnie do każdego dołka dodać 100 µL kompleksów irna, a następnie do każdego dołka nanieść 20 000 komórek w 500 µL. Umieścić komórki w inkubatorze na 24 godziny.Następnego dnia należy zastąpić mieszaninę do transfekcji jednym mililitrem standardowej pożywki do hodowli komórkowej, a następnie inkubować komórki przez kolejne 24 godziny przed akwizycją obrazów. Układ do akwizycji obrazów składa się z dostosowanego inkubatora komórkowego, który mieści się na stoliku mikroskopu odwróconego, sterowanego przez oprogramowanie do akwizycji obrazów. W celu przygotowania do akwizycji obrazów należy upewnić się, że inkubator został wstępnie ogrzany i wyrównany termicznie.Następnie należy otworzyć pokrywę inkubatora i umieścić komórki z założoną pokrywą komory w adapterze. Aby ustabilizować ich położenie, można użyć niewielkiej ilości plasteliny. Zamknij pokrywę i ustaw cały inkubator na stoliku mikroskopu, upewniając się, że jest on stabilnie zamocowany.Następnie, korzystając z programu MetaMorph, należy przygotować eksperyment, wybierając opcję multidimensional acquisition w pasku menu oprogramowania. Spowoduje to wyświetlenie okna, w którym można wybrać parametry obrazowania. Należy określić miejsce zapisywania plików z danymi.Następnie należy wybrać długości fal dla pola jasnego oraz m cherry, korzystając z czterokrotnego obiektywu TX z suchym kontrastem fazowym, odnaleźć pole z komórkami za pomocą oprogramowania i dostosować funkcję automatycznego ostrzenia wyłącznie dla kanału pola jasnego. Pozwoli to oprogramowaniu na automatyczne ustawienie ostrości w każdej pozycji stolika przed każdą akwizycją. Dla pierwszej długości fali należy wykonać zdjęcie przy czasie naświetlania 50 ms, a następnie dostosować czas naświetlania do minimum wymaganego do uzyskania wyraźnego obrazu.Kluczowe jest ograniczenie ekspozycji na światło, aby zapewnić utrzymanie żywotności komórek. Co do zasady, najlepiej osiągnąć to poprzez zastosowanie filtra neutralnego oraz wydłużenie czasu ekspozycji kamery, zamiast zwiększania natężenia oświetlenia.Powtórz tę procedurę dla wszystkich pozostałych długości fal. Następnie ustaw czas ekspozycji dla każdego kanału. W kolejnym kroku wyznacz 15-minutowy interwał time-lapse przez osiem godzin dla 15 pozycji stolika.Jeśli pożądana jest lepsza rozdzielczość czasowa, należy skrócić odstęp czasu między akwizycjami. Należy pamiętać, że wykorzystanie większej liczby pozycji stolika wydłuży czas obrazowania. W każdym odstępie czasu należy wybrać i zaznaczyć odpowiednią liczbę pozycji stolika, aby zapewnić reprezentatywne próbkowanie populacji komórek.Metamor zarejestruje pozycje i powróci do wyznaczonego miejsca dla każdego pomiaru. Po ekspozycji na długość fali w trybie poklatkowym wyznaczono informacje o czasie i pozycji stolika. Wybierz przycisk podglądu na ekranie, aby potwierdzić, że oprogramowanie prawidłowo steruje urządzeniem.Po upewnieniu się, że system działa poprawnie, kliknij przycisk acquire na ekranie, aby rozpocząć akwizycję. Obserwuj proces automatyzacji przez co najmniej jeden pełny cykl akwizycji, aby upewnić się, że wszystko funkcjonuje prawidłowo. Następnie pozostaw komputer i mikroskop do samodzielnej pracy.Aby przejrzeć dane, wybierz aplikacje, przejrzyj dane wielowymiarowe w pasku menu, wybierz widok lokalizacji pliku, a następnie wybierz pozycję stolika. Kliknij załaduj obrazy, aby przejrzeć stos obrazów z tej pozycji. Po załadowaniu obrazów użyj myszy, aby przesuwać się przez dane klatka po klatce.Poniżej przedstawiono filmy z komórkami w fazie mitozy wygenerowane przy użyciu programu Metamorph. Aby utworzyć film w programie Metamorph, należy wybrać opcję stack make movie. Na pasku menu należy wskazać klatki do wykorzystania, prędkość oraz typ pliku filmu.Następnie wybierz opcję zapisu, aby utworzyć montaż. Najpierw zapisz dane jako plik .stk w programie MetaMorph. Następnie uruchom program ImageJ, otwórz w nim plik .stk i wytnij obszar zainteresowania, zaznaczając odpowiedni region i wybierając opcję crop image w pasku menu.Następnie należy wybrać stosy obrazów. W funkcji tworzenia montażu należy określić, które klatki mają zostać uwzględnione, a także rozmiar i kształt montażu oraz to, czy pożądane są obramowania między klatkami.Następnie kliknij OK. Zapisz montaż jako plik .tiff. Na koniec oblicz czas trwania każdego etapu mitozy, przyjmując klatkę, w której widoczne są pierwsze oznaki kondensacji DNA lub zaokrąglenia komórki, jako T = 0 dla profazy.Prometafaza kończy się, gdy chromosomy ustawią się w płaszczyźnie równikowej, następnie następuje metafaza, która trwa do momentu rozpoczęcia segregacji DNA w anafazie i telofazie. Na koniec następuje cytokineza i komórki zaczynają się spłaszczać. Obrazowanie time-lapse komórek wnęki łączącej wykazujących ekspresję histonów.Przedstawiono BCFP. Komórki te zostały przetransfekowane kontrolnym siRNA i prawidłowo przechodzą przez cykl komórkowy. W porównaniu z nimi, komórki przetransfekowane siRNA skierowanymi przeciwko porowi jądrowemu NUP 153 wykazują poważne zaburzenia przebiegu mitozy.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przygotowania, przeprowadzenia i analizy eksperymentu obrazowania time-lapse w celu określenia czasu trwania progresji mitozy komórek po transfekcji siRNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby traktować komórki jak najdelikatniej, utrzymując odpowiednią temperaturę i stężenie CO2 oraz ograniczając czas ekspozycji komórek na światło. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przetwarzanie obrazów time-lapse po transfekcję siRNA do widokowania mitozy

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Źródło: Daniele, F.,  et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015). Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji,...

Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Tutaj prezentujemy monitorowanie migracji komórek w czasie rzeczywistym w teście gojenia ran przy użyciu komórek nabłonka piersi MCF10A zubożonych w TIP60. Implementacja technik obrazowania żywych komórek w naszym protokole pozwala nam analizować i wizualizować ruch pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym i w czasie.

Obrazowanie na żywo migracji komórek nabłonka piersi po przejściowym wyczerpaniu TIP60

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Ten protokół ilustruje chemicznie indukowany system dimeryzacji białek w celu tworzenia kondensatów na chromatynie. Pokazano tworzenie ciała jądrowego białaczki promielocytowej (PML) na telomerach za pomocą chemicznych dimeryzatorów. Wzrost, rozpuszczanie, lokalizacja i skład kropel są monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek, immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach

Ten protokół przedstawia nowy system genów reporterowych i eksperymentalne ustawienie do wykrywania transkrypcji przy pęknięciach dwuniciowych DNA z czułością pojedynczej cząsteczki.

Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metodę obrazowania poklatkowego mitozy w żywych komórkach ssaków po transfekcji siRNA. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki chromosomów i kwantyfikację zmian w czasie podziału komórkowego.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Przeglądaj więcej filmów