Jednoczęściowe nagrania in vivo z skrzyżowania wzrokowego szczura

Dzisiaj zademonstrujemy system nagrywania, który opracowaliśmy do nagrywania in vivo z skrzyżowania wzrokowego szczura. Tego typu zapisy były bardzo rzadkie u szczurów, częściowo dlatego, że aksony komórek zwojowych siatkówki, które tworzą nerw wzrokowy, są bardzo małe, co utrudnia rejestrowanie z pojedynczych komórek, a ponieważ szczur jest powszechnym modelem zwierzęcym zwyrodnienia siatkówki, tego typu zapisy mogą potencjalnie dostarczyć wielu przydatnych informacji. Kluczem do osiągnięcia tych nagrań były zaprojektowane przez nas elektrody z wolframowego szkła barwionego z długą, ostrą końcówką, która umożliwia rejestrację potencjałów czynnościowych z aksonów o cienkiej średnicy z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

Przeprowadzimy Cię przez proces wytwarzania tych elektrod i pokażemy Ci, jak to zrobić, jak ustawić zwierzę na aparacie stereotaktycznym, a następnie pokażemy Ci przykład nagrywania ciągów kolców z pojedynczej komórki zwojowej. Do produkcji elektrod potrzebne są trzy główne elementy wyposażenia, standardowa dmuchawa do szkła do produkcji mikropipet. Do ostrzenia wolframu używana jest maszyna do szycia oraz standardowy mikroskop z obiektywem 40x.

Dodatkowo potrzebny jest grafitowy pierścień z dołączonym drążkiem, który zostanie umieszczony w stężonym roztworze wodorotlenku potasu i azotanu sodu. Umieszcza się go pod ramieniem do szycia, a następnie cienki kawałek drutu wolframowego przykleja się do ramienia szyjącego, częściowo zanurzając go w roztworze. Przewody są następnie nakładane na grafitowy słup z jednej strony do ramienia szyjącego.

Na pozostałych dwóch woltach zostaną przyłożone do przewodów i maszyna do szycia zostanie włączona. To zanurza dunston w roztworze i ostrzy go elektromagnetycznie przez dwie minuty. Po naostrzeniu wolframu ostrożnie wyjmuje się go z ramienia szyjącego, następnie zanurza w wodzie w celu usunięcia nadmiaru roztworu, a następnie umieszcza pod mikroskopem pod obiektywem 40x.

Szklana mikropipeta ma otwór o małej średnicy, około jednego do dwóch mikronów. Zaostrzony wolfram jest następnie ostrożnie wkładany do tylnej części mikropipety i wciskany za pomocą mechanicznego mikromanipulatora. Wolfram jest bardzo ostrożnie przepychany przez koniec szkła.

Ważne jest, aby między wolframem a szkłem było ciasno dopasowane i często naciska się na tyle, aby niewielka ilość szkła faktycznie się oderwała. Niewielką ilość szalonego kleju można nałożyć na tylny koniec mikropipety, aby przymocować tung do szkła. Teraz, gdy produkcja elektrody została zakończona, jej impedancja jest mierzona za pomocą testu impedancji elektrody metalowej.

Generalnie szukamy impedancji w pobliżu jednego megaoma. Elektroda jest następnie umieszczana w etui na przechowanie, ponieważ jest bardzo delikatna. Bodźce wzrokowe prezentowane są na monitorze, który umieszczony jest na ruchomej platformie.

Koc grzewczy służy do kontrolowania temperatury ciała zwierzęcia, a system stereotaktyczny umożliwia swobodny ruch mikronapędu, co pokazano tutaj. Metalowa obudowa w podskórnej osłonie igły prowadzącej, elektroda rejestrująca działa w celu zmniejszenia poziomu hałasu. Igła prowadząca jest wprowadzana do mózgu, a mikronapęd służy do powolnego opuszczania elektrody przez igłę prowadzącą.

Jest to zilustrowane tutaj, gdzie metalowa obudowa jest opuszczana na poprzeczkę, która spoczywa na czaszce zwierzęcia. Igła prowadząca będzie wystawać poniżej poprzeczki, jak pokazano, a kontakt elektryczny między metalową obudową a poprzeczką działa w celu zmniejszenia poziomu hałasu. Zwierzę jest następnie umieszczane na kocu grzewczym.

Nauszniki są ostrożnie wkładane. W tym momencie ważne jest, aby upewnić się, że głowa pozostaje wypoziomowana. Następnie wkładany jest pręt zębowy, aby upewnić się, że głowa jest skierowana we wszystkich kierunkach.

Sondę doodbytniczą wprowadza się za pomocą wazeliny. Spowoduje to pomiar temperatury ciała, która jest następnie wykorzystywana do kontrolowania temperatury koca grzewczego. Temperatura ciała powinna utrzymywać się w przedziale od 36 do 37 stopni.

Pojedynczy przewód EKG jest wprowadzany do skóry w celu monitorowania tętna, które zwykle wynosi około 300 stóp na minutę. Tętno jest dobrym wskaźnikiem głębokości znieczulenia. Parametry życiowe zwierzęcia są stale monitorowane za pomocą specjalnego oprogramowania.

Należą do nich ciśnienie krwi zwane CO2, temperatura ciała i tętno. Następnie usuwa się skórę z górnej części czaszki i czaszka jest odsłaniana. Ważne jest, aby dokładnie oczyścić czaszkę, aby zobaczyć właściwe znaczniki czaszki, które są używane do znalezienia skrzyżowania wzrokowego.

Zespół poprzeczki jest następnie umieszczany na miejscu. Służy do narysowania pięciomilimetrowego okręgu na czaszce, który zostanie następnie wywiercony i usunięty. Otwór zostanie wywiercony wokół pokazanego tutaj znacznika czaszki bgma.

Odsłonięta czaszka jest pokazana z okrągłym znakiem ołówka wokół bgma, który zostanie wywiercony przed nawierceniem czaszki. System stereotaktyczny musi być skalibrowany torema, a odbywa się to poprzez precyzyjne ustawienie igły prowadzącej na bgma i udokumentowanie położenia stereo. Po wierceniu czaszka zostaje usunięta, a mózg zostaje odsłonięty.

Po przewierceniu czaszki zwierzę jest sparaliżowane i wentylowane, aby zapobiec ruchom gałek ocznych. Odbywa się to za pomocą dożylnego wstrzyknięcia gaminy. Oddech jest dokładnie monitorowany w takiej postaci, w jakiej jest, a gdy oddech ustaje, rurka wentylacyjna jest wprowadzana do łącznika tchawicy, w którym to momencie zwierzę jest sztucznie oddychane.

Igła prowadząca jest następnie opuszczana do mózgu. Elektroda rejestrująca zostanie obniżona przez gyal do około 8 do 10 milimetrów poniżej czaszki, gdzie można zarejestrować potencjały czynnościowe z komórek wzrokowych w skrzyżowaniu wzrokowym. Elektroda jest powoli ładowana do mózgu.

Dzięki mikronapędowi można usłyszeć komórkę wizualną, która spontanicznie piszczy, słucha komórki, reaguje na obecność ręcznej różdżki w jej polu recepcyjnym. Następnie przedstawiono stopniowanie dryfujące i w tym momencie wszelkie interesujące bodźce wzrokowe można wykorzystać do badania właściwości odpowiedzi komórek zwojowych siatkówki za pomocą skrzyżowania wzrokowego. Nagranie.