Name: Jednoczęściowe nagrania in vivo z skrzyżowania wzrokowego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-02T15:15:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę rejestracji potencjałów czynnościowych z pojedynczych komórek zwojowych siatkówki in vivo u szczura. Technika wykorzystuje specjalnie zaprojektowane elektrody szklane z wolframem, umożliwiając wysokiej jakości pomiary z małych aksonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Danowi Greenowi za wkład techniczny podczas opracowywania tych technik eksperymentalnych. Praca ta była wspierana przez grant NIH R01-EY016849A oraz nagrodę Smith Family New Investigator Award.

Część I: Wykonanie elektrod wolframowych w szkle
<ol>
 <li>Pierścień grafitowy umieszcza się w zlewce wypełnionej stężonym roztworem azotanu sodu (0,71g/mL) i wodorotlenku potasu (0,34g/mL) rozpuszczonych w wodzie1, a zlewkę ustawia się pod ramieniem zmodyfikowanej maszyny do szycia.</li>
 <li>Drut wolframowy (średnica 0,5mm, długość 6cm) przytwierdza się taśmą do ramienia maszyny w taki sposób, aby był częściowo zanurzony (1-2cm) w roztworze.</li>
 <li>Do drutu wolframowego przykłada się napięcie 2V, podłączając dodatni przewód do ramienia maszyny, a ujemny do pierścienia grafitowego.</li>
 <li>Włącza się maszynę do szycia, a drut wolframowy jest wielokrotnie zanurzany w roztworze z częstotliwością ~4Hz przez 2 min, co powoduje trawienie elektrolityczne metalu do uzyskania ostrego wierzchołka.</li>
 <li>Wytrawiony drut umieszcza się w manualnym mikromanipulatorze, a wierzchołek ustawia się pod kontrolą mikroskopową (powiększenie 40x) względem trzpienia szklanej pipety (średnica zewnętrzna 0,25mm, średnica wewnętrzna 0,175mm), której końcówkę zwężono do 1mm za pomocą wyciągarki szklanej. Aby zapobiec przesunięciu podczas wprowadzania drutu, szkło tymczasowo mocuje się do stolika mikroskopu za pomocą masy plastycznej.</li>
 <li>Drut ostrożnie wsuwa się do niezaciętego końca szkła, wzdłuż trzpienia i przez otwór o rozmiarze 1μm. Na nagraniu widać, że z końcówki odpryskuje mały kawałek szkła, co świadczy o ścisłym dopasowaniu wolframu w szkle. W przypadku rejestracji z włókien nerwu wzrokowego szczura drut powinien wystawać poza końcówkę o około 5-10mm.</li>
 <li>Do niezaciętego końca szkła nanosi się cyjanoakrylan, a po jego utwardzeniu mierzy się impedancję elektryczną; zazwyczaj najlepiej sprawdzają się elektrody o impedancji 1MΩ.</li>
</ol>
Część II: Konfiguracja stereotaktyczna i rejestracja serii impulsów
<ol>
 <li>System wyświetlania bodźców został przedstawiony w materiale wideo wraz z aparatem stereotaksycznym i mikrodrajwerem służącym do pozycjonowania i wprowadzania elektrody do mózgu.</li>
 <li>W celu zarejestrowania serii impulsów (spike trains) z siatkówki szczura poddaje się znieczuleniu, a następnie paraliżowi. Standardowe procedury (nieprzedstawione) są stosowane do chirurgicznego wprowadzenia kaniuli do żyły udowej w celu podawania leków oraz kaniuli tchawiczej (rurka w kształcie litery Y) do wentylacji mechanicznej podczas paraliżu. Eksperymenty mają charakter terminalny dla zwierzęcia.</li>
 <li>Po procedurach przygotowawczych zwierzę umieszcza się na kocu grzewczym, a głowę unieruchamia w pozycji stereotaksycznej, zdefiniowanej zgodnie z atlasem mózgu szczura2, za pomocą prętów usznych i zębowych.</li>
 <li>Wprowadza się sondę rektalną, która steruje kocem grzewczym za pomocą jednostki kontroli homeotermicznej, utrzymującej temperaturę ciała na poziomie 37°C.</li>
 <li>Metalowe igły są wykorzystywane jako elektrody do pomiaru elektrokardiogramu i monitorowania częstotliwości akcji serca.</li>
 <li>Nacinane jest skórę na szczycie czaszki i odsłania się miejsce przecięcia płyt czaszki (bregma). Montuje się specjalnie zaprojektowaną ramę poprzeczną, a następnie poprzez otwór w ramie wyznacza się na czaszce okrąg wokół bregma, po czym ramę tymczasowo zdejmuje się.</li>
 <li>System stereotaksyczny jest kalibrowany poprzez ustawienie igły prowadzącej nad bregma. W zaznaczonym miejscu wierci się w czaszce otwór o średnicy 5 mm i usuwa kość, odsłaniając mózg. Wokół otworu w czaszce umieszcza się cienki pierścień szpachli, aby zapewnić szczelność wokół otworu w ramie poprzecznej, którą ponownie montuje się na miejscu.</li>
 <li>Jeśli zwierzę znajduje się w stabilnej fazie znieczulenia przez pewien czas, wstrzykuje się środek paraliżujący, aby zapobiec ruchom gałek ocznych podczas gromadzenia danych. Po ustaniu oddechu zwierzę jest wentylowane mechanicznie. Specjalny program monitoruje wentylację i parametry fizjologiczne w trakcie całego eksperymentu i informuje eksperymentatora o konieczności podjęcia działań kompensacyjnych, jeśli jakiekolwiek parametry wyjdą poza normę.</li>
 <li>Do igły prowadzącej wprowadza się od tyłu elektrodę wolframową i opuszcza ją do mózgu. Po penetracji mózgu otwór w ramie poprzecznej wypełnia się agarem (nie pokazano), a zespół mikrodrajwera mocuje do ramy w celu zapewnienia stabilności mechanicznej. Następnie elektroda wolframowa jest powoli wysuwana (2μm/sec) z igły prowadzącej, aż jej końcówka znajdzie się około 8-9mm poniżej czaszki, w miejscu położenia skrzyżowania wzrokowego.</li>
 <li>Serie impulsów pochodzące z komórek zwojowych siatkówki są identyfikowane na podstawie ich reakcji na bodźce wzrokowe. Po izolacji pojedynczego włókna nerwu wzrokowego mapuje się pole recepcyjne rejestrowanej komórki w przestrzeni wzrokowej oraz charakteryzuje jej właściwości odpowiedzi za pomocą dryfujących kratowań lub innych interesujących wzorów wizualnych. Stabilność systemu umożliwia rejestrację pojedynczych jednostek przez kilka godzin3.</li>
</ol>
Materiały
Dorosłe szczury rasy Brown-Norway (250-400g) zakupiono od komercyjnego dostawcy i utrzymywano w regulowanym cyklu światła/ciemności (12/12). Znieczulenie wprowadzono poprzez dostryperitonealny wtrysk chlorowodorku ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 70 i 2 mg/kg, Henry Schein Inc) i utrzymywano przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą dożylnej infuzji ketaminy i ksylazyny (30 i 1 mg/kg/hr) zmieszanych z dekstrozą, solą fizjologiczną i trietiodkiem gallaminy (40 mg/kg/hr, Fischer Inc) poprzez cewnik (0.13mm OD, Small Parts Inc) w prawej żyle udowej. Gallaminę włączono do mieszaniny w celu sparaliżowania ruchów gałek ocznych. Prędkość infuzji pompy (WPI Inc) dostosowywano w razie potrzeby, aby utrzymać stabilny poziom znieczulenia, oceniany na podstawie zmienności częstotliwości akcji serca i ciśnienia tętniczego. Po sparaliżowaniu zwierzę było wentylowane mechanicznie (Harvard Apparatus, Model 683) przez kaniulę tchawiczą z częstotliwością 60-80 oddechów/min (objętość 2cc), przy czym częstotliwość dostosowywano w razie potrzeby, aby utrzymać końcowe stężenie CO2 w powietrzu wydychanym, mierzone za pomocą kapnometru przepływowego (Novametrix Inc, Model 710Sp), na poziomie 30%. Temperaturę ciała regulowano za pomocą homeotermicznego systemu kontroli koca grzewczego (Harvard Apparatus Inc). Temperaturę ciała, końcowe stężenie CO2, częstotliwość akcji serca oraz ciśnienie tętnicze monitorowano w sposób ciągły podczas całego eksperymentu za pomocą programu LABVIEW. Bodźce wzrokowe prezentowano na monitorze CRT Sony Multiscan 17e (średnia luminancja 30 cd/m2) pracującym z częstotliwością 100 Hz i rozdzielczością 800x600 pikseli. Akwizycję danych i wyjście monitora kontrolowano za pomocą specjalistycznego oprogramowania napisanego w Matlab i LabView wraz z procesorem obrazu wideo (Cambridge Research Systems Inc, Bits++) oraz Psychophysics Toolbox4. Zwierzę obserwowało wyświetlacz bodźca (40.4 x 30.2 cm) z odległości 16.5cm przez soczewki kontaktowe (Ocular Instruments Inc), a w trakcie eksperymentu okresowo aplikowano roztwór okulistyczny, aby utrzymać wilgotność oczu. Pole widzenia dostępne dla stymulacji zmaksymalizowano poprzez zamontowanie zwierzęcia w odwróconej pozycji w aparacie stereotaksycznym (Stoelting Co) uniesionym 14cm ponad powierzchnią pływającego stołu (TMC Inc) i ustawienie monitora na specjalnie zaprojektowanym płozie, która poruszała się po stole wzdłuż łuku ±100 deg względem nosa. Zapewniło to repositionowalny obszar wyświetlania, który rozciągał się o 60-deg powyżej i 35-deg poniżej poziomu oczu oraz o ±42-deg bocznie od centrum monitora. Elektrody wolframowe wykonano z drutu pozyskanego z Small Parts Inc oraz specjalnego szkła borokrzemianowego z Friedrich and Dimmock Inc. Do ukształtowania szklanej końcówki użyto standardowego wyciągacza do mikropipet (Sutter Instruments, Model P-97). Tester impedancji elektrod zakupiono w Bak-Electronics. Elektrody przesuwano za pomocą zmotoryzowanego systemu mikropopychacza (Newport Inc, StepperMike). Sygnały z elektrokardiogramu i nerwu wzrokowego były wzmacniane i filtrowane za pomocą wielokanałowego wzmacniacza o wysokiej impedancji wejściowej (FHC Inc, X-Cell 3x4). Skurcze serca wykrywano za pomocą dyskryminatora okiennego (WPI Inc, Model 121). Potencjały czynnościowe nerwu wykrywano i znakowano czasowo z rozdzielczością 0.1ms za pomocą cyfrowego dyskryminatora impulsów (FHC Inc, APM). Dyskryminator impulsów był sterowany sygnałem wyzwalającym z procesora obrazu wideo, tak aby czasy wystąpienia impulsów były zsynchronizowane z bodźcem.

<ol><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med Biol Eng. 10 (4), 510-515 (1972).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).</li>
<li>Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintained+discharge+of+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The maintained discharge of rat retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).</li>
<li>Brainard, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychophysics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Spat+Vis%22%5BJournal%5D)">The psychophysics toolbox.</a> Spat Vis. 10, 433-436 (1997).</li>
</ol>

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Uniwersytecie Bostońskim.

Rejestracja z pojedynczych włókien nerwu wzrokowego stanowi atrakcyjne podejście do badania kwestii eksperymentalnych dotyczących kodowania i przesyłania informacji w siatkówce, które wymagają nienaruszonego oka. Co więcej, właściwości sygnalizacyjne obu oczu można badać w niemal identycznym stanie fizjologicznym, jeśli elektrodę umieści się w chiasmie lub drodze wzrokowej, gdzie aktywność skrzyżowanych i nieskrzyżowanych włókien nerwu wzrokowego może być rejestrowana za pomocą jednej penetracji elektrody. Rejestracje z ...

rejestracja pojedynczych jednostek in vivo z skrzyżowania wzrokowego szczura

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Informacje o świecie wizualnym są przekazywane do mózgu w postaci sekwencji potencjałów czynnościowych w aksonach komórek zwojowych siatkówki, które tworzą nerw wzrokowy.In vivorejestracje serii impulsów komórek zwojowych w kilku modelach zwierzęcych ujawniły znaczną część wiedzy na temat tego, w jaki sposób wczesny system wzrokowy przetwarza i koduje informacje wizualne. Jednakże takie rejestracje były rzadkością w jednym z najczęstszych modeli zwierzęcych, szczurze, co może wynikać z trudności w wykrywaniu impulsów generowanych przez aksony o małej średnicy. Liczne modele chorób siatkówki z wykorzystaniem szczurów motywują potrzebę charakterystyki właściwości funkcjonalnych komórek zwojowych bez zakłócania struktury oka, co ma miejsce w przypadku metod wewnątrzgałkowych lubin vitronagrania. W niniejszym materiale przedstawiamy metodę rejestracji serii potencjałów czynnościowych komórek zwojowych z skrzyżowania wzrokowego znieczulonego szczura. W pierwszej kolejności pokazujemy, jak wykonać elektrody wolframowe w szkle, które pozwalają na rejestrację aktywności elektrycznej pojedynczych aksonów komórek zwojowych u szczura. Elektrody te wykazują lepsze właściwości niż wszystkie przetestowane przez nas produkty komercyjne. Następnie prezentujemy nasz autorski system stereotaktyczny doin vivoeksperymenty z zakresu neurofizjologii wzroku oraz nasze procedury przygotowania zwierząt i niezawodnego oraz stabilnego umieszczania elektrod w skrzyżowaniu wzrokowym.

Komórki zwojowe siatkówki przekazują informacje wizualne z oka do mózgu za pomocą sekwencji potencjałów czynnościowych. W niniejszym materiale demonstrujemy sposób rejestracji potencjałów czynnościowych pojedynczych komórek zwojowych in vivo u znieczulonych szczurów.

Rejestracja pojedynczych jednostek In vivo z skrzyżowania wzrokowego szczura

Informacje o świecie wizualnym są przekazywane do mózgu w postaci sekwencji potencjałów czynnościowych w aksonach komórek zwojowych siatkówki, które tworzą nerw wzrokowy...

Zaprezentujemy dzisiaj system rejestracyjny, który opracowaliśmy w celu prowadzenia pomiarów in vivo z commissary optycznej szczura. tego typu rejestracje są u szczurów rzadkością, częściowo dlatego, że aksony komórek zwojowych siatkówki tworzące nerw wzrokowy są bardzo małe, co utrudnia rejestrację z pojedynczych komórek; ponieważ szczur jest powszechnym modelem zwierzęcym w badaniach nad degeneracją siatkówki, tego rodzaju pomiary mają potencjał dostarczyć wielu użytecznych informacji. Kluczem do przeprowadzenia tych rejestracji były zaprojektowane przez nas szklane elektrody barwione wolframem, które posiadają długą, ostrą końcówkę umożliwiającą rejestrację potencjałów czynnościowych z aksonów o małej średnicy przy wysokim stosunku sygnału do szumu.Przeprowadzimy Państwa przez proces wykonania tych elektrod, pokażemy sposób ustawienia zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym, a następnie zaprezentujemy przykład rejestracji serii impulsów (spike trains) z pojedynczej komórki zwojowej. Do wykonania elektrod potrzebne są trzy główne elementy wyposażenia: standardowa lampa do wyciągania szkła do wykonania mikro pipet, maszyna do szycia służąca do ostrzenia wolframu oraz standardowy mi

single-unit-in-vivo-recordings-from-the-optic-chiasm-of-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jednostkowe in vivo Rejestrowania z chiazmy wzrokowej szczura

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Ten film pokazuje przygotowanie modelu szczura do badania zdrowia siatkówki i integralności szlaku wzrokowego. Wizualny potencjał wywołany i elektrody referencyjne i aktywne elektroretinografii są podłączone do szczura, a następnie wyrównuje platformę ze szczurem przed misą Ganzfelda, aby uzyskać równomierne oświetlenie siatkówki i zamyka klatkę Faradaya, aby uniknąć zakłóceń zewnętrznych.

Przygotowanie modelu szczura do oceny integralności ścieżki wzrokowej przy użyciu konfiguracji elektrofizjologicznej

Ten film demonstruje szczegółową procedurę przygotowania znieczulonego szczura do elektrofizjologicznych zapisów aktywności mózgu z wielu miejsc. Skóra głowy jest preparowana w celu uzyskania dostępu do czaszki, a otwory są wiercone w precyzyjnych miejscach, aby zainstalować i zabezpieczyć elektrody. Elektrody wolframowe są następnie umieszczane w docelowym miejscu w celu zarejestrowania danych.

Elektrofizjologiczne zapisy in vivo aktywności mózgu z wielu miejsc u szczurów

Ten film demonstruje proces pomiaru wzrokowych potencjałów wywołanych lub VEP u przystosowanego do ciemności, znieczulonego szczura z wszczepionymi elektrodami czaszkowymi, które rejestrują sygnały elektryczne z kory wzrokowej mózgu w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Rejestracja wizualnych potencjałów wywołanych za pomocą elektrod czaszkowych w modelu szczurzym

Ten film pokazuje, jak rejestrować elektroretinogram (ERG) i wizualny potencjał wywołany (VEP) u przytomnego szczura. Szczur, z chirurgicznie wszczepionymi elektrodami, jest najpierw przystosowany do ciemności. Po zastosowaniu kropli rozszerzających zwierzę umieszcza się w unieruchomieniu i umieszcza w misce Ganzfelda. Następnie rejestrowane są sygnały ERG i VEP.

Zapis elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u szczura

Ex vivo ERG może być używany do rejestrowania aktywności elektrycznej komórek siatkówki bezpośrednio z izolowanych nienaruszonych siatkówk zwierząt lub ludzi. Pokazujemy tutaj, jak powszechne systemy ERG in vivo można dostosować do zapisów ERG ex vivo w celu zbadania aktywności elektrycznej komórek siatkówki.

Jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo

Ogniskowa demienizacja jest indukowana w nerwie wzrokowym za pomocą mikroiniekcji lizolecytyny. Wzrokowe potencjały wywołane są rejestrowane za pomocą elektrod czaszkowych wszczepionych w korę wzrokową w celu zbadania przewodzenia sygnału wzdłuż szlaku wzrokowego in vivo. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury chirurgiczne leżące u podstaw implantacji elektrod i mikroiniekcji nerwu wzrokowego.

Wizualny zapis potencjału wywołanego w szczurzym modelu eksperymentalnej demielinizacji nerwu wzrokowego

Ten protokół opisuje jednoczesny pomiar elektroretinogramu i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów.

Jednoczesna rejestracja elektroretinografii i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów

Pokazujemy chirurgiczne implanty i procedury rejestrujące do pomiaru wizualnych sygnałów elektrofizjologicznych z oka (elektroretinogram) i mózgu (wizualny potencjał wywołany) u przytomnych szczurów, co jest bardziej analogiczne do stanu ludzkiego, gdzie nagrania są prowadzone bez zakłóceń znieczulenia.

Implantacja i rejestracja bezprzewodowego elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u świadomych szczurów

Tutaj opisujemy metody optogenetycznej manipulacji poszczególnych typów neuronów podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy, przedstawiając jako przykład naszą niedawną pracę nad jądrem łożyska prążka końcowego.

Manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania in vivo, wysokiej gęstości nagrań pojedynczych neuronów z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową. Podejście to jest stosowane do pomiaru potencjału czynnościowego neuronów w brzuszno-bocznej szarości okołowodociągowej - regionie pnia mózgu nieaktywnym podczas snu z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) - przed i podczas znieczulenia ogólnego.

Ostre jednojednostkowe nagrania wieloelektrodowe z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową

Poznaj metodę rejestracji potencjałów czynnościowych z pojedynczych komórek zwojowych siatkówki in vivo u szczura. Technika wykorzystuje specjalnie zaprojektowane elektrody szklane z wolframem, umożliwiając wysokiej jakości pomiary z małych aksonów.

Rejestracja pojedynczych jednostek In vivo z skrzyżowania wzrokowego szczura

Przeglądaj więcej filmów