Name: Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy badań przesiewowych chemicznych ryb pręgowanych. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj zautomatyzowane obrazowanie i analizę transgenicznych zarodków Danio rerio w płytkach wielodziurkowych. Ta metoda umożliwia ilościowe pomiary ekspresji reportera FGF w badaniach przesiewowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana przez NICHD/NIH (1R01HD053287) dla Hukriede, NCI/NIH (P01 CA78039) dla Vogt oraz NHLBI/NIH (1R01HL088016) dla Tsang.

1) Przygotowanie krzyżówek rybek zebrafish oraz traktowanie BCI.
<ol>
<li> Na dwa dni przed rozpoczęciem leczenia należy zidentyfikować samce homozygotyczne Tg(dusp6:d2eGFP)pt6 danio przeżebrowane i umieścić je pojedynczo w zbiornikach do rozrodu1Wstawić przegrodę oraz samicę ryby typu dzikiego AB* i pozostawić w klatkach do tarła na noc.</li>
<li> Następnego dnia rano należy usunąć separator i zebrać zarodki po upływie 1 godziny. Przenieść zarodki do szalek o średnicy 100 mm z roztworem E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) i inkubować w 28°C przez 6 godzin. Usunąć martwe i niezapłodnione embriony, dodać świeży roztwór E3 i inkubować przez noc.</li>
<li> Wyselekcjonuj embriony transgeniczne o zbliżonym stadium rozwoju (24 hpf) i jednorodnej ekspresji GFP. Rozmieść pojedynczo embriony w poszczególnych studzienkach płytki 96-dołkowej.</li>
<li> Usunąć nadmiar roztworu E3 za pomocą mikropipety. Dodać 200μl roztworu E3 za pomocą pipety wielokanałowej do każdej studzienki.</li>
<li> Dodać następujące związki zgodnie z listą: 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>1</td>
 <td>2</td>
 <td>3</td>
 <td>4</td>
 <td>5</td>
 <td>6</td>
 <td>7</td>
 <td>8</td>
 <td>9</td>
 <td>10</td>
 <td>11</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>A</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>F</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0,5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2,5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Stężenia końcowe wynoszą 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI w 1% DMSO. Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 28°C.</li></ol>
2) Zautomatyzowane obrazowanie płytek 96-dołkowych i analiza.
<ol>
<li> Do każdego dołka dodaj 10μl tricainy (0,61mM), aby zanieczulić zarodki w wieku 30hpf.</li>
<li> Włóż płytkę do urządzenia Molecular Devices Imagexpress Ultra.</li>
<li> Otwórz oprogramowanie Metaxpress. Wybierz konfigurację z obiektywem 4x i maksymalną średnicą otworu (pinhole), skonfiguruj laserowy autofokus do wykrywania dna płytki i określ optymalną płaszczyznę Z w celu wykrycia obszarów zainteresowania. Pozyskaj obrazy przy długościach fal wzbudzenia/emisji 488/525 nm (GFP). Ustaw obszar skanowania jako pojedynczy punkt o wymiarach 2000x2000 pikseli (4 x 4 mm) bez binningu. Skonfiguruj moc lasera i wzmocnienie (gain) w taki sposób, aby najjaśniejsze obszary na obrazach kontroli pozytywnej nie uległy nasyceniu. Potwierdź poprawność akwizycji obrazów w kilku dołkach kontroli pozytywnej i negatywnej.</li>
<li> Rozpocznij skanowanie płytki. Urządzenie automatycznie pozyska obrazy ze wszystkich dołków i zarchiwizuje je w bazie danych serwera SQL.</li>
<li> Prześlij obrazy do programu Definiens Developer, korzystając z modułu aplikacji Cellenger oraz filtra importu rozpoznającego format obrazu i strukturę plików generowaną przez platformę Molecular Devices Imagexpress Ultra.</li>
<li> Przetwórz obrazy przy użyciu specjalnie zaprojektowanego algorytmu Cognition Network Technology (zwanego również zestawem reguł – ruleset). Algorytm, który opracowaliśmy na podstawie niedawno opublikowanego zestawu reguł 2, został zaprojektowany do automatycznej identyfikacji zarodka, żółtka i głowy oraz do ilościowego pomiaru jasności i powierzchni struktur głowy wykazujących ekspresję GFP. Dołki, w których nie wykryto zarodka lub w których nie można jednoznacznie przypisać głowy (na przykład przy wysokiej toksyczności związku lub w przypadku obrazów nieostrożnych), są wykluczane z analizy. Skonfiguruj algorytm, używając kilku obrazów kontroli negatywnej (traktowanych nośnikiem) i obrazów kontroli pozytywnej (traktowanych BCI), tak aby głowa i żółtko były prawidłowo identyfikowane w obu przypadkach. Ustaw próg detekcji „struktur głowy” jako wielokrotność średniej intensywności żółtka, aż wykrywanie jasnych struktur głowy będzie zgodne z obserwacją wizualną. Zdefiniuj parametry do eksportu. W tym przykładzie najbardziej informacyjnym parametrem była całkowita zintegrowana jasność obszarów GFP-dodatnich w obrębie głowy, zwana dalej „całkowitą jasnością struktur głowy” (Rysunek 1). 
<img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="Wykres zależności dawka-odpowiedź, analiza EC50; jasność względem log μM BCI, porównanie wyników z płytek 1-1 i 1-2." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rysunek 1"> 
Rysunek 1 Wykres przedstawiający zależne od dawki efekty BCI na ekspresję GFP w zarodkach transgenicznych.</li>
<li> Uruchom algorytm dla wszystkich obrazów z płytki, korzystając z zintegrowanego harmonogramu zadań. Oprogramowanie Definiens wykorzystuje obliczenia rozproszone na kilku procesorach („silnikach”), co umożliwia jednoczesną analizę wielu obrazów. Algorytm oblicza miary numeryczne na podstawie wyników analizy obrazu, które są zapisywane w bazie danych wraz z kopią przetworzonego obrazu z naniesioną analizą.</li></ol>

Reprezentatywne wyniki:
Po przeanalizowaniu wszystkich obrazów dane można zwizualizować w programie Cellenger lub wyeksportować do zewnętrznego oprogramowania (Excel, GraphPad Prism) w celu dalszej analizy i reprezentacji graficznej. Rycina 2 przedstawia zarchiwizowane obrazy skanów z dołka kontrolnego (vehicle) oraz dołka traktowanego BCI, z zastosowaną i bez zastosowanej analizy CNT. Rycina 1 dokumentuje zależny od dawki efekt BCI na ekspresję genu reporterowego GFP w embrionach Tg(dusp6:d2EGFP)pt6. Stężenie wymagane do wywołania połowy maksymalnej odpowiedzi (EC50) wynosiło około 12 μM. 
<img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="Morfologia embrionu danio pręgowanego po podaniu DMSO i 20μM BCI, mikroskopia fluorescencyjna, badanie ekspresji genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rycina 2"> 
Rycina 2 Zautomatyzowane pozyskiwanie i analiza obrazów transgenicznych embrionów danio pręgowanego. (A) Embrion Tg(dusp6:d2eGFP)pt6 w 30hpf traktowany DMSO (vehicle). (B) Embriony transgeniczne traktowane 20μM BCI wykazują zwiększoną ekspresję GFP. (C) Obraz embrionu z (A) po zastosowaniu zestawu reguł Definiens w celu znalezienia ekspresji GFP w głowie. Pomarańczowe punkty oznaczają miejsca, w których oprogramowanie mierzy intensywność GFP. (D) Obraz embrionu z (B) po zastosowaniu zestawu reguł Definiens w celu znalezienia ekspresji GFP w głowie. Pomarańczowe punkty oznaczają miejsca, w których oprogramowanie mierzy intensywność GFP. Należy zauważyć, że zestaw reguł był w stanie wykryć powiększony obszar ekspresji GFP w embrionie traktowanym.

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

Głównym czynnikiem ograniczającym wydajność chemicznych badań przesiewowych na danio pręgowanym jest brak metodologii pozwalającej na systematyczne przetwarzanie płytek 96-dołkowych w celu obrazowania i analizy. Ponieważ obrazy organizmów wielokomórkowych są złożone, charakteryzują się niskim kontrastem i są z natury heterogeniczne, istniejące algorytmy analizy obrazu nie radzą sobie z wykrywaniem i kwantyfikowaniem konkretnych struktur wewnątrz organizmu. W związku z tym większość opublikowanych badań przesiewowych na danio pręgowanym opiera się na wizualnej ocenie poszczególnych dołków przez wykwalifikowany personel w trakcie całej procedury. Zazwyczaj uniemożliwia to generowanie numerycznych wyników oraz pełną archiwizację obrazów i danych z przesiewu. Co więcej, ocena manualna eliminuje kilka kluczowych zalet przesiewania opartego na obrazowaniu, a mianowicie możliwość przeprowadzania retrospektywnych analiz efektywności przesiewu, badanie zmian fenotypowych, które nie były głównym celem kampanii przesiewowej (np. toksyczność lub wady rozwojowe), oraz korelację danych z przesiewu z poprzednimi lub przyszłymi badaniami z wykorzystaniem tej samej biblioteki związków.
 
W niniejszym raporcie przedstawiamy metodologię zautomatyzowanego obrazowania i analizy zarodków danio pręgowanego w płytkach wielodołkowych bez ingerencji użytkownika. Zautomatyzowaliśmy proces akwizycji obrazów za pomocą konfokalnego skanera laserowego ImageXpress Ultra (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), aby obrazować zarodki Tg(dusp6:d2EGFP)pt6 w płytkach 96-dołkowych, oraz opracowaliśmy algorytm analizy obrazu oparty na technologii Cognition Network firmy Definiens, który ilościowo określił ekspresję GFP w głowach zarodków transgenicznych. Metoda ta dostarczyła odpowiedzi stopniowane i pozwoliła na ilościowe określenie aktywności in vivo małocząsteczkowego aktywatora sygnalizacji FGF. Podobne wyniki uzyskano przy użyciu systemu ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) opartego na epifluorescencji, co dowodzi, że możliwe jest wdrożenie zautomatyzowanej akwizycji obrazów zarodków danio pręgowanego na różnych komercyjnie dostępnych czytnikach płytek 2. Opracowanie metodologii automatycznej analizy obrazów organizmów wielokomórkowych wyeliminowało potrzebę wizualnej oceny przez obserwatora i umożliwiło generowanie oraz archiwizowanie danych liczbowych i obrazów do późniejszej analizy retrospektywnej oraz porównań z przyszłymi badaniami przesiewowymi.

<table><tbody><tr><td>Tricaina (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat. nr A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na daniowiczkach zebrafish.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

Prezentujemy zastosowanie metodologii wysokoprzepustowego przesiewu obrazowego (HCS) w celu zidentyfikowania małych cząsteczek zdolnych do modulacji szlaku FGF/RAS/MAPK w embrionach danio pręgowanego. Embrion danio pręgowanego stanowi idealny system do wysokoprzepustowych badań chemicznych in vivo. Jednodniowy embrion ma średnicę około 1mm i może być łatwo rozmieszczony w płytkach 96-dołkowych, które są standardowym formatem w badaniach wysokoprzepustowych. W ciągu pierwszej doby rozwoju embriony są przezroczyste, a większość głównych narządów jest już obecna, co umożliwia wizualizację formowania się tkanek podczas embriogenezy. Pełna automatyzacja chemicznych badań przesiewowych na danio pręgowanym wciąż stanowi jednak wyzwanie, szczególnie w zakresie opracowania zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Wcześniej stworzyliśmy transgeniczną linię reporterową, która wykazuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą aktywności FGF, i wykazaliśmy jej przydatność w badaniach chemicznych.1Aby opracować metodologię wysokoprzepustowych przesiewów całych organizmów, stworzyliśmy system zautomatyzowanego obrazowania i analizy embrionów zebrafish w 24–48 godzinach po zapłodnieniu (hpf) w płytkach 96-dołkowych.2W tym filmie przedstawiamy procedury rozmieszczania embrionów transgenicznych w płytkach wielodołkowych w 24hpf oraz dodawanie cząsteczki o małej masie cząsteczkowej (BCI), która hiperaktywuje sygnalizację FGF3Płytki inkubuje się przez 6 godzin, po czym dodaje się trikainę w celu znieczulenia larw przed automatycznym obrazowaniem przy użyciu skaningowego konfokalnego czytnika HCS Molecular Devices ImageXpress Ultra. Obrazy są przetwarzane przez oprogramowanie Definiens Developer z wykorzystaniem algorytmu Cognition Network Technology, który opracowaliśmy w celu wykrywania i ilościowego określania ekspresji GFP w głowach embrionów transgenicznych. W tym przykładzie podkreślamy zdolność algorytmu do pomiaru efektów zależnych od dawki BCI w ekspresji genu reporterowego GFP w traktowanych embrionach.

Opisujemy opracowanie systemu do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów zebrafish w płytkach wielodołkowych. System ten wykazuje możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego Fibroblast Growth Factor i dostarcza technologii do tworzenia wysokoprzepustowych skriningów chemicznych na zebrafish.

Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na daniowiczkach Zebrafish.

Prezentujemy zastosowanie metodyki obrazowania w wysokoprzepustowym przesiewaniu wysokotreściowym (HCS) w celu zidentyfikowania małych cząsteczek zdolnych do modulowania szlaku FGF/RAS/MAPK...

W niniejszym filmie przeprowadzono obrazowy wysokoprzepustowy screening (HCS), aby ocenić modulację szlaku kinazy MAPK czynnika wzrostu fibroblastów za pomocą małych cząsteczek. W zarodkach danio pręgowanego skrzyżowano transgeniczne samce i samice typu dzikiego w klatce hodowlanej. Zapłodnione jaja opadają na dno, gdzie są zbierane i przenoszone do szalki Petriego. Zarodki inkubowano przez noc, a następnie umieszczono w poszczególnych studzienkach okrągłodنnej płytki 96-dołkowej.Mała cząsteczka BCI jest dodawana w celu hiperaktywacji sygnalizacji FGF, a płytka jest inkubowana przez sześć godzin. Obrazy z każdej studni są rejestrowane za pomocą konfokalnego czytnika płytek i analizowane przy użyciu autorskiego algorytmu, który raportuje intensywność fluorescencji w konkretnych strukturach embrionalnych. Cześć, jestem Hiba Kado z laboratorium dr. Michaela Changa z Katedry Mikrobiologii i Genetyki Molekularnej na Uniwersytecie w Pittsburghu.Witam, nazywam się Andrea Spock z Instytutu Odkrywania Leków na Uniwersytecie w Pittsburghu. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę rozmnażania, selekcji i rozmieszczania embrionów danio pręgowanego w celu przeprowadzenia obróbki chemicznej. W płytce 96-dołkowej wykorzystamy embriony transgeniczne raportujące aktywność czynników wzrostu fibroblastów, które zostaną poddane działaniu cząsteczki hiperaktywującej tę ścieżkę.Przedstawimy sposób wykorzystania metodologii wysokoprzepustowego przesiewania obrazowego (high content screening) do automatycznej akwizycji, analizy i kwantyfikacji aktywności czynnika wzrostu fibroblastów w embrionach transgenicznych danio pręgowanego. Procedura ta zaprezentuje technologię platformową pozwalającą na wykorzystanie transgenicznych rybek danio oraz wysokoprzepustowych przesiewów chemicznych. Przejdźmy zatem do realizacji.Na dwa dni przed rozpoczęciem zabiegu należy wytypować homozygotyczne samce transgeniczne danio pręgowanego i umieścić je w oddzielnych zbiornikach do tarła. W zbiornikach należy zainstalować przegrody, a następnie do każdego z nich dodać samicę typu dzikiego i pozostawić ryby w klatkach do tarła na noc w temperaturze 28°C. Następnego ranka należy usunąć przegrodę. Po godzinie ryby należy przenieść do nowego zbiornika, a embriony przelać przez plastikowe sito.Przenieść zarodki do szalek 100 mm z roztworem E3 i inkubować w temperaturze 28 °C przez sześć do ośmiu godzin. Po inkubacji zbadać zarodki pod mikroskopem stereoskopowym. Zarodki odpowiednie do eksperymentów będą znajdować się w fazie gastrulacji.W tym momencie należy usunąć wszystkie niezapłodnione embriony, które pozostaną w stadium jednej komórki. Należy również usunąć embriony nieżywe, które wydają się nieprzezroczyste lub zdeformowane. Następnie należy dodać świeży roztwór E three i inkubować przez noc w temperaturze 28 °C.Następnego dnia umieść embriony pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym, aby wyselekcjonować embriony transgeniczne o podobnym stadium rozwoju i jednorodnej ekspresji GFP. Embriony w 24 HPF wykazują widoczną granicę między mózgiem przednim a tylnym z intensywną ekspresją GFP oraz dobrze wykształcone oczy z GFP-dodatnimi siatkówkami grzbietowymi. Embriony te są aktywne i będą poruszać się oraz wirować w swoich chorionach podczas przenoszenia plastikową pipetą Pasteura.Przenieś zarodki w 24 HPF pojedynczo do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej. Za pomocą mikropipety usuń nadmiar roztworu E three z dołków. Następnie, używając pipety wielokanałowej, dodaj 200 µl roztworu E three do każdego dołka.Następnie do wszystkich dołków w kolumnach 1 i 12 należy dodać 2 µL DMSO. Następnie dodaje się 2 µL BCL przygotowanego w DMSO w następujący sposób: 1 µM do kolumn 2 i 7, 5 µM do kolumn 3 i 8, 10 µM do kolumn 4 i 9 oraz 20 µM do pozostałych.Stężenie mikromolarne do kolumn pięciu i 10. I na koniec 25 micromolar do kolumny szóstej i 11. Teraz przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować przez sześć godzin w temperaturze 28 °C.Dodaj 10 µL trica do każdej studni, aby znieczulić zarodki 30 HPF. Następnie wprowadź płytkę do systemu Molecular Devices ImageXpress Ultra z uruchomionym oprogramowaniem MetaXpress. Wybierz konfigurację z obiektywem 4x i maksymalną średnicą otworu przesłony (pinhole).Skonfiguruj automatyczne ogniskowanie lasera tak, aby wykrywało dno płytki i stosowało wcześniej określone optymalne przesunięcie Z. Aby wykryć obszary zainteresowania, ustaw obszar skanowania jako pojedynczy obszar o wymiarach 2000 na 2000 pikseli bez binningu. Wybierz odpowiedni typ płytki oraz laser argonowy o długości fali 488 nanometrów przy długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i emisji 525 nanometrów.Następnie należy wybrać dołek zawierający embrion traktowany nośnikiem i kliknąć przycisk find sample. Instrument przeprowadzi skanowanie autofokus i zarejestruje pojedynczy obraz w celu potwierdzenia prawidłowego obrazowania. Należy losowo wybrać dołek z traktowaniem nośnikiem i zarejestrować obraz.Jeśli obraz jest ostry i wykazuje ekspresję GFP w głowie, należy umieścić kursor nad najjaśniejszymi obszarami i zweryfikować, czy intensywność fluorescencji mieści się w zakresie 16-bitowej kamery, tj. poniżej 65 000 jednostek.Powtórz te kroki z innym kontrolnym nośnikiem oraz kilkoma studzienkami traktowanymi związkiem. W razie potrzeby dostosuj moc lasera i wzmocnienie w taki sposób, aby najjaśniejsze obszary na obrazach kontroli pozytywnej nie uległy nasyceniu. Następnie w oknie akwizycji i kontroli płytek wybierz opcję acquire plate, aby rozpocząć skanowanie płytki.Urządzenie automatycznie pozyska jeden obraz z każdej dołka dla całej mikropłytki i zarchiwizuje je w bazie danych serwera SQL. Po zakończeniu skanowania prześlij obrazy do D definition's. Developer, otwierając program developer z włączoną opcją slinger.Utwórz nowy obszar roboczy. Następnie z menu pliku wybierz opcję spersonalizowanego importu. Następnie przejdź do folderu zawierającego obrazy i otwórz plik próbny.Wybierz filtr importu, który rozpoznaje format obrazu i strukturę plików generowanych przez platformę Molecular Devices Image Express Ultra. Aby przystąpić do przetwarzania obrazów, otwórz obraz kontrolny i załaduj odpowiednią technologię sieci poznawczych (cognition network technology), algorytm CNT lub zestaw reguł. Zastosowany tutaj niestandardowy algorytm został opracowany w celu automatycznej identyfikacji zarodka, żółtka i głowy oraz ilościowego określenia jasności i powierzchni struktur głowy wykazujących ekspresję GFP; wykonaj zestaw reguł do etapu detekcji głowy i żółtka.Aby zapewnić prawidłowe przypisanie pęcherzyka żółtkowego i głowy, zmodyfikuj zestaw reguł w celu dostosowania progu detekcji żółtka, jeśli jest ono zbyt duże lub zbyt małe. Następnie wykonaj zestaw reguł do etapu detekcji jasnych struktur głowy. Aby zapewnić prawidłowe przypisanie obszarów wykazujących ekspresję GFP w głowie, zmodyfikuj zestaw reguł, dostosowując próg detekcji struktur głowy jako wielokrotność intensywności tła, aż detekcja jasnych struktur głowy będzie zgodna z obserwacją wizualną.Następnie należy ręcznie zastosować cały zestaw reguł na kilku losowo wybranych obrazach pochodzących z embrionów traktowanych nośnikiem oraz obrazach kontroli pozytywnej z embrionów traktowanych PCI. Aby uruchomić algorytm dla wszystkich obrazów z płytek, należy wybrać płytki do analizy i wybrać Analyze, a następnie przejść do zoptymalizowanego zestawu reguł i przeprowadzić analizę wszystkich studzienek.Dzięki zintegrowanemu harmonogramowi zadań, puste dołki lub niejednoznaczne obrazy zostaną automatycznie wykluczone z analizy podczas skanowania. Wyświetlana jest stale aktualizowana mapa zachowania próbek. Zarówno dane, jak i obrazy są dostępne podczas uruchomienia w celu wizualnej inspekcji.Dane liczbowe oraz przetworzone obrazy są zapisywane automatycznie. Po przeanalizowaniu wszystkich obrazów dane można wyeksportować do zewnętrznego oprogramowania, takiego jak Excel, GraphPad lub Prism. Na tej rycinie przedstawiono zarchiwizowane obrazy skanów z próbki kontrolnej oraz próbki traktowanej BCI, z przeprowadzoną analizą CNT oraz bez niej.Zastosowaną zieloną białko fluorescencyjne lub GFP wykryto w oku, w granicy przedniego i tylnego mózgowia oraz w zwojach trójdzielnych embrionów transgenicznych. Należy zauważyć, że zarówno intensywność GFP, jak i domeny ekspresji uległy rozszerzeniu. W przedstawionych tutaj embrionach traktowanych BCI widoczny jest efekt zależny od dawki BCI na ekspresję genu reporterowego GFP w embrionach transgenicznych.Stężenie wymagane do wywołania połowy maksymalnej odpowiedzi, czyli EC 50, wynosiło około 12 µM. Przedstawiliśmy właśnie sposób hodowli, zbierania i rozmieszczania transgenicznych embrionów danio pręgowanego w płytkach 96-dołkowych. Dodaliśmy rosnące stężenia PCI we własnym aktywatorze ścieżki sygnałowej.Pokazaliśmy również, jak zautomatyzować obrazowanie embrionów transgenicznych, a następnie przeanalizowaliśmy obrazy za pomocą specjalnie zaprojektowanego algorytmu opartego na technologii sieci kognitywnych. Dzięki temu podejściu mogliśmy w sposób ilościowy i stopniowalny zmierzyć efekty działania małocząsteczkowego aktywatora sygnalizacji czynnika wzrostu fibroblastów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby starannie dobrać embriony, aby zminimalizować zmienność między badanymi okazami.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

development-automated-imaging-analysis-for-zebrafish-chemical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rozwój zautomatyzowanych obrazowania i analizy dla ekranów chemicznych na rybkach zebrafish.

Danio pręgowany stał się potężną platformą in vivo do przesiewowych badań leków opartych na fenotypie oraz analiz genetyki chemicznej. W niniejszej pracy prezentujemy prostą i praktyczną metodę wielkoskalowego przesiewu małych cząsteczek z wykorzystaniem embrionów danio pręgowanego.

Wielkoskalowe badania z wykorzystaniem rybek zebrafish In vivo Przesiewanie małych cząsteczek

W niniejszej pracy opisujemy nowatorski wysokoprzepustowy test chemicznie indukowanego stanu zapalnego, którego celem jest identyfikacja bioaktywnych substancji immunomodulujących. Skutecznie połączyliśmy zautomatyzowaną mikroskopię z autorskimi skryptami oprogramowania, co umożliwia automatyczną kwantyfikację odpowiedzi zapalnej, a także dalsze przetwarzanie, analizę, wydobywanie i przechowywanie danych.

Usprawnianie odkrywania leków: zautomatyzowany wysokotreściowy test stanu zapalnego u rybek danio pręgowanych

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Opisujemy procedurę i analizę danych chemicznego systemu przesiewowego sygnalizacji glikokortykosteroidowego hormonu stresu za pomocą larw danio pręgowanego: test aktywności lucyferazy zebry reagujący na glikokortykosteroidy in vivo (GRIZLY). Test z czułością i swoistością wykrywa wpływ związków wymagających metabolizowania lub wpływających na endogenną produkcję glikokortykosteroidów na sygnalizację glikokortykosteroidów.

Chemiczna procedura przesiewowa sygnalizacji glikokortykosteroidów za pomocą systemu reporterowego lucyferazy larw danio pręgowanego

Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.

Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem doświadczalnym do badania procesów rozwojowych kręgowców i modelowania chorób ludzkich. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego z odczytem hybrydyzacji in situ (WISH) w całości.

Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół projektowania i produkcji szablonu do układania zarodków danio pręgowanego, a następnie szczegółową procedurę użycia takiego szablonu do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego na 96-dołkowej płytce.

Drukowany w 3 wymiarach (3D) szablon do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Poznaj zautomatyzowane obrazowanie i analizę transgenicznych zarodków Danio rerio w płytkach wielodziurkowych. Ta metoda umożliwia ilościowe pomiary ekspresji reportera FGF w badaniach przesiewowych.

Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na daniowiczkach Zebrafish.

Przeglądaj więcej filmów