Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy badań przesiewowych chemicznych ryb pręgowanych.
24 czerwca 2010
Informujemy o rozwoju systemu do automatycznego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów danio pręgowanego na płytkach wielodołkowych. Pokazuje to zdolność do pomiaru zależnego od dawki wpływu małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego czynnika wzrostu fibroblastów i zapewnia technologię do tworzenia wysokoprzepustowych badań chemicznych danio pręgowanego.
W tym filmie przeprowadzono badania przesiewowe o wysokiej zawartości oparte na obrazach w celu oceny opartej na małych cząsteczkach modulacji szlaku kinazy mapy czynnika wzrostu fibroblastów W zarodkach danio pręgowanego transgeniczne samce i samice danio pręgowanego typu dzikiego są kryte w klatce hodowlanej. Zapłodnione jaja opadają na dno i są zbierane i przenoszone na szalkę Petriego. Zarodki są inkubowane przez noc, a następnie umieszczane w pojedynczych dołkach z 96-dołkową okrągłą płytką denną.
Mała cząsteczka BCI jest dodawana w celu hiperaktywacji sygnalizacji FGF, a płytka jest inkubowana przez sześć godzin. Obrazy z każdego testamentu są rejestrowane za pomocą czytnika płytek konfokalnych i analizowane za pomocą samodzielnie zaprojektowanego algorytmu, który informuje o intensywności fluorescencji w określonych strukturach embrionalnych. Cześć, nazywam się Hiba Kado i pracuję w laboratorium dr Michaela Changa na Wydziale Mikrobiologii i Genetyki Molekularnej Uniwersytetu w Pittsburghu.
Cześć, nazywam się Andrea Spock i pracuję w Instytucie Odkrywania Leków Uniwersytetu w Pittsburghu. Dziś pokażemy Ci procedurę hodowli, selekcji i układania zarodków danio pręgowanego do leczenia chemicznego. Na 96-dołkowej płytce użyjemy transgenicznych embrionów, które informują o aktywności czynnika wzrostu z włókna szklanego i potraktowanych cząsteczką, która hiperaktywuje tę przeszłą biel.
Pokażemy Ci, w jaki sposób wykorzystujemy metodologię badań przesiewowych o wysokiej zawartości do automatycznego pozyskiwania, analizowania i ilościowego określania aktywności czynnika wzrostu fibroblastów w transgenicznych zarodkach danio pręgowanego. Ta procedura podkreśli technologię platformy do wykorzystania transgenicznych ryb danio pręgowanego i wysokowydajnych badań chemicznych. Więc zacznijmy.
Dwa dni przed leczeniem zidentyfikuj homozygotycznego samca transgenicznego danio pręgowanego i umieść go w indywidualnych zbiornikach godowych. Dodaj separatory do zbiorników, a następnie dodaj samicę ryby typu dzikiego do każdego zbiornika i pozostaw ryby w klatkach godowych na noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Następnego ranka wyjmij separator Po godzinie przenieś rybę do nowego zbiornika i wlej zarodki do plastikowego sita.
Przenieś zarodki na 100-milimetrowe szalki z roztworem E 3 i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu godzin. Po inkubacji zbadaj zarodki pod mikroskopem stereoskopowym. Zarodki nadające się do eksperymentów będą poddawane gazowi
.W tym czasie usuń wszelkie niezapłodnione zarodki, które pozostaną w stadium pojedynczej komórki. Usuń również zarodki niezdolne do życia, które wydają się nieprzezroczyste lub zniekształcone. Następnie dodaj świeży roztwór E 3 i inkubuj przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza.
Następnego dnia umieść zarodki pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym, aby posortować transgeniczne zarodki do podobnego stadium i jednorodności. Ekspresja GFP 24 Zarodki HPF wykazują widoczną środkową granicę tylnej półmózgowia z intensywną ekspresją GFP i dobrze uformowanymi oczami z dodatnimi siatkówkami grzbietowymi GFP. Zarodki te są aktywne i poruszają się i poruszają w swoim rdzeniu za pomocą plastikowej pipety pastwiskowej.
Przenieś 24 zarodki HPF pojedynczo do indywidualnych dołków na 96-dołkowej płytce. Za pomocą mikropipety usuń nadmiar roztworu E 3 z dołków. Następnie za pomocą pipetera wielokanałowego dodaj 200 mikrolitrów roztworu E trzy do każdej studzienki.
Następnie dodaj dwa mikrolitry DMSO do wszystkich studzienek w kolumnach pierwszej i 12. Następnie dodaj dwa mikrolitry BCL przygotowanego w DMSO w następujący sposób, jeden, mikromolowy do kolumn drugiej i siódmej. Pięć mikromolowców do trzech i ośmiu, 10 mikromolowych do czterech i dziewięciu 20.
Mikromolowe do kolumn piątej i dziesiątej. I wreszcie 25 mikromolowych do kolumny szóstej i 11. Teraz przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj ją przez sześć godzin w temperaturze 28 stopni Celsjusza.
Dodaj 10 mikrolitrów trica do każdej studzienki, aby znieczulić 30 zarodków HPF. Następnie załaduj płytkę do urządzenia molekularnego Image Express ultra otwarte oprogramowanie Meta Express. Wybierz konfigurację z celem Forex i maksymalną średnicą otworka.
Skonfiguruj laserowy autofokus tak, aby wykrywał dno płyty i używał z góry określonego optymalnego przesunięcia Z. Aby wykryć obszary zainteresowania, ustaw obszar skanowania jako pojedynczy obszar o wymiarach 2000 na 2000 pikseli bez wygięć. Wybierz odpowiedni typ płytki i laser argonowy 488 nanometrów przy wzbudzeniu na długościach fal emisji 488 na 525 nanometrów.
Następnie wybrać studzienkę zawierającą zarodek poddany działaniu nośnika i kliknąć przycisk znajdź próbkę. Przyrząd wykona skanowanie z autofokusem i uzyska pojedynczy obraz, aby potwierdzić prawidłowe przyswojenie obrazu. Losowo wybierz dobrze potraktowany pojazd i zdobądź zdjęcie.
Jeśli obraz jest ostry i pokazuje ekspresję GFP w głowie. Umieść kursor nad najjaśniejszymi obszarami i sprawdź, czy intensywność fluorescencji mieści się w zakresie kamery 16-bitowej. Mniej niż 65 000 sztuk.
Powtórz te kroki z innym pojazdem kontrolnym i kilkoma studzienkami poddanymi działaniu mieszanki. W razie potrzeby dostosuj moc i wzmocnienie lasera w taki sposób, aby najjaśniejsze obszary na obrazach kontroli pozytywnej nie uległy nasyceniu. Następnie w oknie akwizycji i kontroli płyt wybierz opcję Pobierz płytę, aby rozpocząć skanowanie płyty.
Przyrząd automatycznie pobierze jeden obraz na studzienkę dla całej mikropłytki i zarchiwizuje go w bazie danych serwera SQL. Po zakończeniu skanowania prześlij obrazy do definicji D. Programista, otwierając programistę z włączoną opcją procy.
Utwórz nowy obszar roboczy. Następnie z menu plik wybierz import niestandardowy. Następnie przejdź do folderu zawierającego obrazy i otwórz przykładowy plik.
Wybierz filtr importu, który rozpoznaje format obrazu i strukturę pliku generowany przez platformę Molecular Devices Image Express Ultra. Teraz, aby przetworzyć obrazy, otwórz obraz kontrolny i załaduj żądaną technologię sieci poznawczej lub algorytm CNT lub zestaw reguł. Zastosowany tutaj niestandardowy algorytm został zaprojektowany do automatycznej identyfikacji zarodka, żółtka i głowy oraz do ilościowego określenia jasności i obszaru struktur głowy wyrażających GFP, wykonania reguły ustawionej na etapie wykrywania głowy i żółtka.
Aby zapewnić prawidłowe przypisanie worka żółtkowego i główki, zmodyfikuj zestaw reguł, aby dostosować próg wykrywania żółtka, jeśli żółtko jest za duże lub za małe. Następnie wykonaj regułę ustawioną do etapu wykrywania jasnych struktur głowy. Aby zapewnić prawidłowe przypisanie obszarów wyrażających GFP w głowie, zmodyfikuj zestaw reguł, aby dostosować próg wykrywania struktur głowy jako wielokrotności intensywności służebnej, aż wykrycie jasnych struktur głowy będzie zgodne z obserwacją wzrokową.
Następnie należy ręcznie wykonać cały zestaw reguł na kilku losowo wybranych obrazach wygenerowanych z zarodków poddanych działaniu nośnika oraz obrazów kontroli pozytywnej z zarodków poddanych działaniu PCI. Aby uruchomić algorytm na wszystkich obrazach płyt, wybierz płyty do analizy i wybierz. Przeanalizuj, a następnie przejdź do zoptymalizowanego zestawu reguł i przeanalizuj wszystkie dołki.
Korzystając ze zintegrowanego harmonogramu zadań, puste studzienki lub niejednoznaczne obrazy zostaną automatycznie wykluczone z analizy podczas skanowania. Wyświetlana jest stale aktualizowana mapa twierdzy. Zarówno dane, jak i obrazy są dostępne podczas przebiegu w celu kontroli wizualnej.
Dane liczbowe i przetworzone obrazy są zapisywane automatycznie. Po przeanalizowaniu wszystkich obrazów dane można wyeksportować do oprogramowania innych firm, takiego jak Excel, GraphPad lub prism. Rysunek ten przedstawia zarchiwizowane obrazy skanów z nośnika poddanego działaniu substancji i prawidłowo potraktowanego BCI A z analizą CNT i bez niej.
Stosowane białko zielonej fluorescencji lub GFP wykrywa się w oku, środkowej tylnej granicy mózgu i zwojach nerwu trójdzielnego transgenicznych zarodków. Należy zauważyć, że zarówno intensywność GFP, jak i domeny ekspresji są rozszerzone. W zarodkach leczonych BCI obserwuje się zależny od dawki wpływ BCI na ekspresję genu reporterowego GFP w zarodkach transgenicznych.
Stężenie wymagane do wywołania połowy maksymalnej odpowiedzi lub EC 50 wynosiło około 12 mikromolów. Właśnie pokazaliśmy, jak hodować, zbierać i umieszczać transgeniczne zarodki danio pręgowanego na 96-dołkowych płytkach. Dodaliśmy zwiększające stężenie PCI we własnym aktywatorze szlaku sygnałowego.
Pokazaliśmy również, jak zautomatyzować obrazowanie transgenicznych embrionów i przeanalizowaliśmy obrazy za pomocą specjalnie zaprojektowanego algorytmu opartego na technologii sieci poznawczych. Dzięki takiemu podejściu byliśmy w stanie zmierzyć ilościowo w stopniowy sposób wpływ małocząsteczkowego aktywatora sygnalizacji czynnika wzrostu fibroblastów. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o starannym doborze zarodków, aby zminimalizować zmienność między próbkami.
Otóż to. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia system do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych zarodków danio pręgowanego w płytkach wielodołkowych. Wykazano w nim możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki BCI na ekspresję genu reporterowego czynnika wzrostu fibroblastów (Fibroblast Growth Factor), co usprawnia wysokoprzepustowe przesiewy chemiczne z wykorzystaniem danio pręgowanego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Przesiew wysokoprzepustowy
Wprowadzenie
- Danio pręgowany jest powszechnie wykorzystywany jako organizm modelowy w biologii rozwoju.
- Transgeniczne rybki danio mogą wykazywać ekspresję białek fluorescencyjnych, co umożliwia wizualizację ekspresji genów.
- Przesiewanie wysokoprzepustowe (high-content screening) pozwala na jednoczesną analizę wielu próbek.
- Sygnalizacja czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) jest kluczowa dla wielu procesów rozwojowych.
Cel badania
- Opracowanie systemu obrazowania wysokoprzepustowego dla zarodków rybek danio.
- Ocena wpływu małych cząsteczek na sygnalizację FGF.
- Automatyzacja analizy ekspresji genów u transgenicznych rybek danio.
Zastosowane metody
- Hodowla transgenicznych danio pręgowanych i zbieranie embrionów.
- Inkubacja embrionów w płytkach wielodołkowych z różnymi stężeniami BCI.
- Zautomatyzowane obrazowanie z wykorzystaniem konfokalnego czytnika płytek.
- Analiza intensywności fluorescencji przy użyciu autorskiego algorytmu.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie i analiza zarodków danio pręgowanego w formacie wysokoprzepustowym.
- Wykazanie zależnych od dawki efektów BCI na sygnalizację FGF.
- Zautomatyzowana analiza zapewniła wiarygodną kwantyfikację ekspresji genów.
- Ustanowienie platformy do przyszłych badań przesiewowych związków chemicznych u danio pręgowanego.
Wnioski
- Opracowany system zwiększa wydajność chemicznych przesiewów z wykorzystaniem danio pręgowanego.
- Stanowi on wartościowe narzędzie do badania sygnalizacji FGF w procesach rozwojowych.
- Metodologia ta może zostać zastosowana do innych małych cząsteczek i szlaków sygnalizacyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Zautomatyzowane obrazowanie i analiza embrionów zebrafish umożliwiają skalowalną ocenę in vivo modulacji szlaków sygnalizacyjnych, co wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków. Podejście to zapewnia ilościowe odczyty zależne od dawki, które zwiększają pewność prognostyczną w zakresie wpływu związków na aktywność szlaku FGF/RAS/MAPK. Upozycjonowuje to metodę jako pomost translacyjny pomiędzy przesiewaniem fenotypowym a identyfikacją związków wiodących w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez modulowanie sygnalizacji FGF w istotnym dla danej choroby systemie kręgowców.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki zautomatyzowanej kwantyfikacji ekspresji reportera GFP w strukturach głowy zarodka.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane EC50 (około 12 micromolar dla BCI) w celu określenia relacji struktura-aktywność oraz selekcji projektów w portfolio.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanych, powtarzalnych odczytów intensywności fluorescencji z formatów płytek 96-dołkowych, kompatybilnych z procesami wysokoprzepustowymi.
- Skalowalność: Umożliwia układanie embrionów transgenicznych w 24 hpf w celu podania związków i automatycznego obrazowania za pomocą konfokalnych czytników HCS.
- Użyteczność algorytmu: Specjalistyczny algorytm Cognition Network Technology wykrywa i kwantyfikuje ekspresję GFP w określonych obszarach embrionalnych, co pozwala na wiarygodną ocenę związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystanie embrionów danio pręgowanego w 24–48 hpf, co stanowi stadium rozwojowe z uformowanymi organami i przejrzystością tkanek, wspierając ekstrapolację z badań in vivo do badań przedklinicznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pomiar odpowiedzi specyficznych dla danej ścieżki (aktywacja FGF) w celu odróżnienia efektów celowanych od efektów pozacelowych związku.
- Zgodność z biomarkerami: Ekspresja reportera GFP służy jako biomarker translacyjny dla modulacji ścieżki FGF, wykrywalny za pomocą zautomatyzowanej analizy obrazu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez w walidacji celów terapeutycznych oraz umożliwiając skalowalny rozwój testów dla kampanii identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych i zwiększenie pewności co do wybranego celu poprzez analizę zależności dawka-odpowiedź w modulacji sygnalizacji FGF.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testu dzięki zautomatyzowanemu pozyskiwaniu i analizie obrazów, co gwarantuje powtarzalność w różnych stężeniach związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (intensywność i powierzchnia GFP), co umożliwia porównanie siły i skuteczności związków.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną dzięki wykorzystaniu embrionów kręgowców o konserwatywnych szlakach sygnalizacyjnych i widocznej organogenezie.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania wielu małych cząsteczek i szlaków sygnalizacyjnych przy użyciu wymiennych reporterów transgenicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji celu i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki zautomatyzowanemu obrazowaniu i analizie opartej na algorytmach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie ilościowych, zależnych od dawki danych na temat aktywności szlaku.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wskaźniki EC50 i maksymalnej odpowiedzi.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w hodowli rybek danio pręgowanych, obchodzeniu się z embrionami transgenicznymi oraz w mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od aparatury do konfokalnego screeningu wysokoprzepustowego (np. Molecular Devices ImageXpress Ultra) oraz oprogramowania do analizy obrazu (Definiens Developer).
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie określania stadium rozwoju embrionów, przygotowania związków oraz parametrów akwizycji obrazu.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu algorytmu do różnych reporterów transgenicznych lub struktur embrionalnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność embrionów oraz konieczność starannego doboru preparatów w celu zminimalizowania szumów, zgodnie z zapisami w protokole.
