Wykorzystanie automatycznego licznika komórek w celu uproszczenia badań nad ekspresją genów: wyciszenie siRNA ekspresji genów zależnych od IL-4 w komórkach Namalwa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie elektroporacji do wprowadzenia siRNA do komórek trudnych do transfekcji w celu badania ekspresji genów. Osiąga się to poprzez uprzednie określenie ilości zawiesiny komórkowej przy użyciu automatycznego licznika komórek TC 10. Następnie do zawiesiny komórkowej dodaje się siRNA, a komórki poddaje się elektroporacji.

Z zastosowaniem systemu elektroporacji MXL komórki inkubuje się przez 24 godziny po elektroporacji. Następnie dodaje się IL-4, aby zindukować transkrypcję genów w komórkach doświadczalnych. Na koniec izoluje się RNA i przeprowadza reakcję real-time PCR w celu pomiaru poziomów ekspresji genów.

W rezultacie można uzyskać dane wykazujące wpływ konkretnych siRNA na szlaki ekspresji genów. Dzień dobry, nazywam się Adam McCoy i jestem starszym naukowcem w dziale ekspresji genów w Bio Rad Laboratories. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wprowadzania RNA do trudnych do transfekcji linii komórkowych za pomocą elektroporacji, a następnie przyjrzymy się efektom wpływającym na ekspresję genów.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do analizy ekspresji pojedynczych genów lub badania szlaków genowych poprzez wyłączenie jednego genu i analizę efektów w dół szlaku. Zatem zacznijmy. Pracując pod dygestorium do hodowli komórkowych, usuń komórki z kolby hodowlanej.

Komórki wykorzystane w tym protokole to komórki w zawiesinie. W przypadku użycia komórek adherentnych konieczne będzie ich potraktowanie trypsyną przed usunięciem. Odwiruj komórki, aby uzyskać osad.

Po odwirowaniu komórek usunąć nadsącz i resuspender komórki w PBS. Aby określić liczbę żywych komórek, pobrać alikwot zawiesiny komórkowej i dodać barwnik trypanowy w stosunku jeden do jednego w celu zabarwienia martwych komórek. Barwnik trypanowy jest niezbędny do oceny żywotności komórek, ale nie jest wymagany do oznaczenia całkowitej liczby komórek.

Należy nanieść mieszaninę pipetą na otwór jednorazowej kasetki do liczenia i włożyć ją do automatycznego licznika komórek TC 10. Urządzenie TC 10 najpierw automatycznie ustawi ostrość, aby zapewnić najdokładniejszy pomiar, a następnie rozpocznie liczenie komórek. Wyświetlona zostanie liczba żywych oraz całkowita liczba komórek na mililitr w próbce.

Wybierz opcję view image, aby wyświetlić komórki na ekranie podglądu. Następnie, używając strzałek w górę lub w dół, przybliż lub oddal obraz w zależności od potrzeb, aby obliczyć ilość zawiesiny komórkowej niezbędną do eksperymentów, wybierając dilution calculator.

Wprowadź pożądane wartości stężenia i objętości końcowej dla tego eksperymentu. Przygotowanych zostanie łącznie 16 próbek, w tym powtórzenia dla każdego wariantu. W związku z tym wymagane będzie łącznie 3.6 milliliters zawiesiny o stężeniu five times 10 of the six cells per milliliter.

Licznik komórek poda następnie objętość zawiesiny komórkowej niezbędną do uzyskania założonych wartości na podstawie liczby żywych komórek. Jeśli użyto TRIAM blue, licznik automatycznie uwzględni zastosowane rozcieńczenie w stosunku jeden do jednego. Następnie, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przenieś obliczoną objętość zawiesiny komórkowej do nowej probówki.

Następnie odwiruj mieszaniny komórkowe, aby osadzić komórki w formie pelletu. W czasie wirowania przygotuj probówki do mikrowirówki do elektroporacji, dodając SIR A do każdej z nich. W tym doświadczeniu zostaną przygotowane: jedna kontrola irna, dwie stat sześć specyficznych siRNA oraz kontrole niezmodyfikowane. Po odwirowaniu usuń PBS i resuspenduj komórki w 3,6 milliliters buforu do elektroporacji gene Pulser. Przenieś aliquoty po 800 microliter do probówek zawierających odpowiednie IRNA i delikatnie wymieszaj.

Komórki są teraz gotowe do elektroporacji, aby poddać procesowi wszystkie próbki jednocześnie. Używając systemu do elektroporacji MXL, przenieś 150 µL każdej zawiesiny komórkowej do odpowiednich dołków płytki do elektroporacji o 96 dołkach. Następnie umieść płytkę w komorze systemu do elektroporacji MXL i zamknij pokrywę.

Wybierz odpowiedni protokół elektroporacji i naciśnij przycisk impulsu. Po zakończeniu elektroporacji wyjmij płytkę z urządzenia i przenieś komórki na nową płytkę do hodowli tkanek zawierającą podgrzane wcześniej medium. Następnie przenieś 150 µL niepoddanych elektroporacji komórek kontrolnych dla każdej próbki do nowej płytki. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 przez noc.

Po 24 godzinach należy użyć IL four, aby zindukować transkrypcję genów w jednym zestawie komórek, a do drugiego zestawu dodać samą pożywkę. Do komórek dodaje się jeden IL four. Inkubować przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide po łącznie 48 godzinach wzrostu.

W przypadku, gdy traktowanie eksperymentalne wpływa na podziały komórkowe, mogą wystąpić znaczne różnice w gęstości komórek. Dlatego zaleca się ponowne, szybkie przeliczenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek TC 10 na podstawie uzyskanych wyników. Przenieś jedną aलिकwot z każdej dołki do probówki do wirówki typu micro fuge w celu ekstrakcji RNA, a następnie zamroź.

Druga alikwota do westernu lub innych analiz białek. Dzisiaj zaprezentowany zostanie jedynie schemat postępowania dla RNA. Wirować próbki, abyt scałować komórki w pellet.

Następnie należy usunąć i odrzucić nadsącz z każdej probówki. Kontynuować ekstrakcję RNA przy użyciu zestawu orum total RNA. Po wyekstrahowaniu RNA należy niezwłocznie przystąpić do analizy, przechowując próbki w lodzie.

Aby w jednym kroku zweryfikować jakość i ilość RNA, należy użyć zautomatyzowanej stacji elektroforezy Experian, poddać próbki oraz drabinę RNA Experian denaturacji termicznej, a następnie umieścić je na lodzie. Do otworu startowego na chipie RNA należy dodać przygotowaną mieszaninę żelu i barwnika, a następnie wprowadzić kod startowy w stacji startowej.

Umieść chip w zautomatyzowanej stacji przygotowawczej (priming station) i naciśnij start. Wyjmij chip ze stacji i dokonaj załadunku. Wymieszaj chip w wstrząsarce typu vortex, aby zmieszać próbki z buforem do załadunku.

Umieść chip w stacji elektroforezy i rozpocznij przebieg. Oprogramowanie Experian automatycznie wyświetli wyniki w formie elektroferogramu, tabeli wyników zawierającej stężenie RNA, stosunek rybosomalny oraz wskaźnik jakości RNA (RQI), a także wirtualny żel, który wygląda podobnie do tradycyjnego żelu RNA. Próbki całkowitego RNA wysokiej jakości będą zazwyczaj charakteryzować się wartością RQI od 8 do 10.

Po zweryfikowaniu jakości RNA przygotuj reakcje cDNA. Mieszanina IS script ONEstep R-T-P-C-R jest wykorzystywana do połączenia syntezy cDNA i PCR w czasie rzeczywistym. W jednej reakcji przygotuj master mix zawierający wszystkie składniki reakcji, z wyjątkiem matryc RNA dla każdego zestawu starterów.

Następnie rozdziel mieszaninę do dołków płyty PCR. Po rozcieńczeniu RNA do jednorodnego stężenia, nanieś próbki do odpowiednich dołków w trzech powtórzeniach. Zamknij płytę, umieść ją w urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym, wybierz odpowiedni protokół i rozpocznij pomiar; po zakończeniu analizy wykorzystaj krzywe kinetyczne czasu rzeczywistego do określenia poziomów ekspresji.

Oprogramowanie oblicza znormalizowany poziom ekspresji genów na podstawie danych dotyczących względnej ekspresji genów eksperymentalnych i referencyjnych w komórkach traktowanych oraz kontrolnych. Na tym schemacie przedstawiono ogólny widok szlaku sygnałowego IL four, w którym wiązanie IL four z jego receptorem prowadzi do dimeryzacji i aktywacji STAT six; aktywowany STAT six przemieszcza się do jądra komórkowego i aktywuje transkrypcję swojego genu docelowego.

W przypadku genów takich jak CCL 17, bez indukcji przez IL-4 transkrypcja CCL 17 pozostanie na niskim poziomie konstytutywnym po wyciszeniu genu STAT6 za pomocą siRNA. Leczenie IL-4 powinno prowadzić do niewielkiego lub żadnego wzrostu ekspresji CCL 17. Indukcja CCL 17 przez IL-4 była mierzona w różnych warunkach za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym.

Próbki PCR hodowane bez IL-4 wykazywały niski konstytutywny poziom ekspresji. Niezależnie od sir, próbki kontrolne A, przedstawione na zielono i niebiesko, reagowały prawidłowo na traktowanie IL-4, wykazując od ośmiokrotnej do dziesięciokrotnej indukcji CCL 17. Jednak komórki przetransfekowane siRNA skierowanymi przeciwko STAT6, zaznaczone na czerwono i różowo, wykazały obniżoną ekspresję CCL 17 w odpowiedzi na IL-4, co potwierdza tezę, że STAT6 odgrywa rolę w indukowanej przez IL-4 ekspresji CCL 17.

Właśnie pokazaliśmy, jak wprowadzać siRNAME do trudnej do transfekcji linii komórek w zawiesinie oraz jak monitorować ekspresję genów w tych komórkach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dbać o maksymalną spójność wszystkich próbek. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.