Wykorzystanie automatycznego licznika komórkowego w celu uproszczenia badań ekspresji genów: knockdown siRNA ekspresji genu zależnej od IL-4 w komórkach Namalwa

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie elektroporacji do wprowadzenia siRNA do trudnych do transfekcji komórek w celu zbadania ekspresji genów. Osiąga się to poprzez określenie najpierw ilości potrzebnej zawiesiny komórek awa za pomocą TC 10. Zautomatyzowany licznik komórek irna jest następnie dodawany do zawiesiny komórki, a komórki są tworzone elektroelektrycznie.

Za pomocą systemu elektroporacji MXL komórki są inkubowane przez 24 godziny po elektroporacji. Następnie dodaje się IL 4 w celu indukowania transkrypcji genów w komórkach eksperymentalnych. Na koniec ekstrahuje się RNA, a do pomiaru poziomów ekspresji genów wykorzystuje się PCR w czasie rzeczywistym.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wpływ określonych siRNA na szlaki ekspresji genów. Cześć, nazywam się Adam McCoy, jestem starszym naukowcem w dziale ekspresji genów w Bio Rad Laboratories. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wprowadzania RNA do trudnych do transfekcji linii komórkowych za pomocą elektroporacji, a następnie przyjrzymy się wpływowi na ekspresję genów.

Używamy tej procedury w naszym laboratorium do analizy ekspresji pojedynczych genów lub badania szlaków genowych poprzez wyeliminowanie jednego genu i poszukiwanie dalszych efektów. Więc zacznijmy. Pracując pod kapturem do hodowli komórkowych, wyjmij komórki z kolby hodowlanej.

Komórki użyte w tym protokole są komórkami zawiesinowymi. Jeśli używasz komórek przylegających, będziesz musiał wytrypsynować oczy przed ich usunięciem. Odwiruj komórki, aby je otulić.

Po odwirowaniu komórek należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w PBS. Aby określić liczbę żywych komórek, należy pobrać porcję zawiesiny komórek i dodać barwnik trian blue w stosunku jeden do jednego, aby wybarwić martwe komórki. Kolor niebieski Trian jest wymagany do oceny żywych martwych komórek, ale nie do całkowitej liczby komórek.

Mieszaninę należy wyciskać wyłącznie na otwór jednorazowego szkiełka liczącego i wkładać do automatycznego licznika komórek TC 10. TC 10 najpierw automatycznie ustawi ostrość, aby zapewnić najdokładniejsze zliczanie, a następnie zaczniemy liczyć komórki. Wyświetlana jest liczba żywych i całkowita liczba komórek na mililitr w próbce.

Wybierz opcję wyświetl obraz, aby wyświetlić komórki na ekranie widoku. Następnie użyj strzałek w górę lub w dół. Powiększ lub pomniejsz w razie potrzeby, aby obliczyć ilość zawiesiny komórek potrzebną do eksperymentów, wybierz kalkulator rozcieńczenia.

Wprowadź żądane wartości stężenia i końcowej objętości dla tego eksperymentu. Przygotowanych zostanie łącznie 16 próbek, w tym duplikaty dla każdego zabiegu. Tak więc w sumie potrzebne będzie 3,6 mililitra pięć razy 10 z sześciu komórek na mililitr zawiesiny.

Licznik komórek będzie następnie informował o potrzebnej objętości zawiesiny komórek na podstawie liczby żywych komórek i wprowadzonych wartości docelowych. Jeśli użyto TRIAM blue, licznik automatycznie dostosuje się do zastosowanego rozcieńczenia jeden do jednego. Teraz pod maską przenieś obliczoną objętość zawiesiny komórek do nowej probówki.

Następnie odwiruj mieszaniny komórek, aby osadzać komórki, podczas gdy komórki obracają się w dół. Przygotuj mikroprobówki do elektroporacji, dodając SIR A do każdej probówki. W tym eksperymencie zostanie przygotowany jeden kontrolny irna dwa stat sześć specyficznych siRNA i niewycięte kontrole Po odwirowaniu usuń PBS i ponownie zawieś komórki w 3,6 mililitrach genu Pulser bufor elektroporacyjny przenieś 800 mikrolitrów podwielokrotności do probówek zawierających odpowiedni IRNA i delikatnie wymieszaj.

Ogniwa są teraz gotowe do elektroporacji, aby zjeść wszystkie próbki jednocześnie. Za pomocą systemu elektroporacji MXL przenieś 150 mikrolitrów zawiesiny każdego ogniwa do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki do elektroporacji. Następnie umieść płytkę w komorze płytek systemu elektroporacji MXL i zamknij pokrywę.

Wybierz żądany protokół elektroporacji i naciśnij impuls, aby zjeść komórki po zakończeniu elektroporacji, wyjmij płytkę z instrumentu i przenieś komórki na nową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą wstępne podgrzanie do pożywki. Następnie przenieś 150 mikrolitrów nieznamionowych komórek kontrolnych dla każdej próbki do nowego naczynia. Następnie umieść komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla na noc.

Po 24 godzinach użyj IL 4 do indukowania transkrypcji genów w jednym zestawie komórek i dodaj pożywkę tylko do drugiego zestawu. Do komórek dodaje się jedną IL cztery. Inkubuj dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla po łącznie 48 godzinach wzrostu.

Mogą występować duże różnice w gęstości komórek, jeśli eksperymentalne leczenie wpływa na podział komórek. Dlatego dobrym pomysłem jest użycie automatycznego licznika komórek TC 10, aby szybko ponownie policzyć komórki na podstawie liczby komórek. Przenieść jedną podwielokrotność z każdej studzienki do mikroprobówki do fuge w celu ekstrakcji RNA i zamrożenia.

Druga podwielokrotność do western blotting lub innej analizy białek. Dzisiaj pokazany zostanie tylko przepływ pracy RNA. Odwirować próbki w celu osadzenia komórek.

Następnie wyjmij i wyrzuć natynkę SUP z każdej tuby. Kontynuuj ekstrakcję RNA za pomocą zestawu całkowitego RNA orum. Po ekstrakcji RNA natychmiast przystąp do analizy, trzymając próbki na lodzie.

Aby zweryfikować jakość i ilość RNA w jednym kroku, użyj zautomatyzowanej stacji elektroforezy Experian do denaturacji termicznej próbek oraz drabinki Experian RNA i umieść ją na lodzie. Dodaj przygotowaną mieszaninę żelu i bejcy do gruntowania. Cóż, na chipie RNA ustaw kod primingu na stacji priming.

Umieść wiór w automatycznej stacji zasysania i naciśnij start. Wyjmij chip ze stacji zasysania i załaduj chip. Wiruj chip, aby wymieszać próbki z buforem ładującym.

Umieść chip w stacji elektroforezy i rozpocznij bieg. Oprogramowanie Experian automatycznie wyświetli wyniki w postaci elektroferogramu, tabeli wyników, która wyświetla stosunek rybosomalny stężenia RNA oraz numer wskaźnika jakości RNA i wirtualny żel, który wygląda podobnie do tradycyjnego żelu RNA. Próbki całkowitego RNA wysokiej jakości będą zazwyczaj miały RQI od ośmiu do 10.

Po sprawdzeniu jakości RNA należy przygotować tutaj reakcje CD NA. Skrypt IS ONEstep R-T-P-C-R mix służy do łączenia syntezy CD NA i PCR w czasie rzeczywistym. W jednej reakcji należy sporządzić mieszankę wzorcową zawierającą wszystkie składniki reakcji z wyjątkiem matryc RNA dla każdego zestawu starterów.

Następnie rozprowadź mieszaninę w dołkach płytki PCR. Po rozcieńczeniu RNA do jednolitego stężenia dodać próbki do odpowiednich studzienek i wykonać trzy próbki. Zapieczętuj płytkę, umieść ją w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym, a następnie wybierz odpowiedni protokół i rozpocznij przebieg po zakończeniu cyklu, użyj śladów w czasie rzeczywistym, aby określić poziomy ekspresji.

Oprogramowanie oblicza znormalizowaną ekspresję genów na podstawie danych na podstawie względnej ekspresji genów eksperymentalnych i referencyjnych w komórkach leczonych i kontrolowanych. Ten rysunek przedstawia przegląd wiązania szlaku sygnałowego IL four IL cztery z jego receptorem. Prowadzi do diaryzacji i aktywacji STAT sześć, aktywowany STAT szósty przemieszcza się do jądra i aktywuje transkrypcję swojego celu.

Geny takie jak CCL 17 bez transkrypcji indukcyjnej IL 4 CCL 17 pozostaną na niskich poziomach konstytutywnych po wyciszeniu genu STAT 6 za pośrednictwem irna. Leczenie IL 4 powinno prowadzić do niewielkiego lub żadnego wzrostu ekspresji CCL 17. Indukcję CCL 17 przez IL 4 mierzono w różnych warunkach za pomocą ilościowego czasu rzeczywistego.

Próbki PCR wyhodowane bez IL 4 miały niski konstytutywny poziom ekspresji. Niezależnie od tego, czy Pan/Pani dostarczył, jak pokazano w zielonych i niebieskich próbkach kontrolnych, zareagował normalnie na leczenie IL 4 z ośmio- do dziesięciokrotną indukcją CCL 17. Jednak komórki transfekowane siRNA ukierunkowane na STAT 6 pokazane na czerwono i różowo miały zmniejszoną ekspresję CCL L 17 w odpowiedzi na IL 4, co potwierdza ideę, że STAT 6 odgrywa rolę w indukowanej przez IL 4 ekspresji CCL 17.

Właśnie pokazaliśmy, jak wprowadzić siRNA do trudnej do transfekcji zawiesinowej linii komórkowej i jak śledzić ekspresję genów w tych komórkach. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, aby zachować jak największą spójność we wszystkich próbkach. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.