Name: Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Poznaj analizę dużych kompleksów białkowych za pomocą spektrometrii masowej. Ta metoda pozwala na charakteryzację makromolekularnych struktur i zapewnia wgląd w ich skład oraz architekturę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom grupy Sharon za krytyczną recenzję oraz wkład w przygotowanie rękopisu. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie programów Morasha i Bikura, Izraelskiej Fundacji Naukowej (granty nr 1823/07 i 378/08), Centrum Badań nad Biomembranami im. Josefa Cohna Minerva, programu stypendialnego Chais Family Fellows for New Scientists, Fundacji Abrahama i Sonii Rochlin, charytatywnego funduszu Wolfson Family Charitable Trust, Centrum Struktury i Montażu Biomolekularnego im. Helen i Miltona A. Kimmelmana, spadkobiercom Shlomo i Sabine Beirzwinsky, Meil de Botton Aynsley oraz Karen Siem z Wielkiej Brytanii. Dziękujemy Danowi Tawfikowi i Itamarowi Yadidowi za udostępnienie próbki wariantu lektyny.

Część 1: Przygotowanie kapilar powlekanych złotem do nanoflowowej jonizacji przez rozpylanie elektrostatyczne
Analizę kompleksów niekowalencyjnych przeprowadza się zazwyczaj za pomocą jonizacji z elektrorysu w przepływie nanoflow (nESI)6, wykorzystując kapilary szklane lub kwarcowe, które zostały wyciągnięte do cienkiej końcówki (~1 μm średnicy wewnętrznej) i pokryte materiałem przewodzącym (zazwyczaj złotem). Takie kapilary są dostępne w formie gotowej do użycia z komercyjnych źródeł (New Objective lub Proxeon); jednak bardziej ekonomiczne może być ich samodzielne przygotowanie w laboratorium:
<ol>
	<li>Przyklej dwa paski dwustronnej taśmy klejącej do dna szalki Petriego w odstępie 2 cm. W centrum jednego z pasków umieść pręcik szklany (8 cm x 5 mm). Taśma klejąca utrzyma kapilary na miejscu, a pręcik szklany będzie podtrzymywał przygotowane kapilary, zapobiegając złamaniu ich końcówek (Rysunek 1).</li>
	<li>Użyj kapilar z borokrzemianu szkła o średnicy zewnętrznej 1,0 mm i wewnętrznej 0,78 mm (stosujemy opakowania po 500 cienkościennych kapilar borokrzemianowych firmy Warner Instruments, nr kat. G100TF- 4). Wsuń jedną kapilarę do wyciągacza igieł (stosujemy model P-97 firmy Sutter Instrument Co.). Delikatnie zaciśnij kapilarę w uchwycie i dostosuj jej położenie tak, aby znajdowała się w centrum włókna grzejnego wyciągacza. Delikatnie dokręć zaciski, aż kapilara zostanie stabilnie unieruchomiona z obu końców.</li>
	<li>Wyciągnij kapilarę, korzystając z zdefiniowanego programu. Z każdej wyciągniętej kapilary powstaną dwie końcowe kapilary o odpowiednim kształcie. Programowanie wyciągacza odbywa się metodą prób i błędów, aż do uzyskania akceptowalnego kształtu końcówki. Stosujemy następujący program:
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td>Krok</td>
				<td>Grzanie</td>
				<td>Wyciąganie</td>
				<td>Prędkość</td>
				<td>Czas</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>1</td>
				<td>750</td>
				<td>-</td>
				<td>15</td>
				<td>80</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>2</td>
				<td>700</td>
				<td>-</td>
				<td>15</td>
				<td>50</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>3</td>
				<td>750</td>
				<td>200</td>
				<td>20</td>
				<td>80</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Wyjmij wyciągnięte kapilary z urządzenia i sprawdź końcówki, odrzucając wszystkie zdeformowane lub złamane. Użyj tępych pęset (stosujemy pęsety pozycjonujące firmy C.K. Precision), aby umieścić kapilary w szalce Petriego. Podstawa kapilary powinna być przytwierdzona do taśmy klejącej, a górna część powinna opierać się o pręcik szklany, z końcówką skierowaną do góry.</li>
	<li>Po zapełnieniu szalki Petriego (do szalki o średnicy 10 cm mieści się około 80 kapilar), włóż ją do napylacza złota (stosujemy model nr EMS550 firmy EMS). Upewnij się, że dopływ gazu został wybrany zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie uruchom zdefiniowany cykl napylania (stosujemy ciśnienie argonu 4 psi, ciśnienie próżni 5 x 10-2 mbar, natężenie prądu 45 mA i czas napylania 1 min, przez 3-6 cykli, aż kapilary będą równomiernie złote).</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Wymagane są niskie mikromolarne stężenia próbki (1 - 20 μM). W razie potrzeby należy zagęścić próbkę przy użyciu urządzeń do ultrafiltracji odśrodkowej (np., Vivaspin firmy Sartorius lub NanoSep firmy Pall Corporation). Przed użyciem zaleca się zweryfikowanie adsorpcji kompleksu białkowego do membrany urządzenia.</li>
	<li>Często bufory oczyszczające lub roztwory do przechowywania kompleksu białkowego nie są kompatybilne z nESI, w której można stosować wyłącznie roztwory lotne. W związku z tym konieczna jest wymiana buforu. Ten krytyczny etap, podczas którego usuwane są wszelkie ślady soli, cząsteczek buforu lub innych nielotnych adductów, takich jak glicerol, DTT lub EDTA, determinuje jakość widm. Zazwyczaj stosuje się wodny roztwór octanu amonu o stężeniu od 5 mM do 1 M i pH w zakresie 6–8. Wymianę buforu można przeprowadzić przy użyciu mikrocentryfużkowej kolumny do filtracji żelowej (np., kolumny chromatograficzne Micro Bio-Spin 6 firmy Bio-Rad). Krok ten można powtórzyć 1–3 razy przy minimalnym rozcieńczeniu (poniżej współczynnika 1,3 na urządzenie5), aż do uzyskania maksymalnej wymiany. Jeśli wymagana jest zarówno wymiana stężenia, jak i buforu, można przeprowadzić te procesy jednocześnie, stosując ultrafiltrację odśrodkową (np. Vivaspin firmy Sartorius lub NanoSep firmy Pall Corporation).</li>
</ol>
Część 3: Kalibracja spektrometru mas do pomiarów wysokich mas
Większość eksperymentów prowadzonych na kompleksach wielobiałkowych wykonuje się przy użyciu instrumentu nano elektrospray quadrupole-time-of-flight (Q-ToF). Zaleca się stosowanie quadrupole mass filter ustawionego na niskie częstotliwości, aby umożliwić transmisję i analizę masy jonów o wysokich wartościach m/z 7,8. Rekomenduje się również dodanie do instrumentu wlotów gazu7,8 lub tulei9 w pierwszym przewodniku jonów, co pozwala na kontrolę ciśnienia w pierwszym stopniu próżni. To drugie umożliwia optymalizację transmisji oraz desolwatację bardzo dużych jonów7-9. Obecnie komercyjne instrumenty ESI-ToF i Q-ToF są dostępne od kilku producentów (np. Waters, SCIEX, Bruker lub Agilent), które można stosunkowo łatwo i tanio zmodyfikować do zastosowań w native MS7,8. Możliwe jest jednak wykorzystanie standardowych konfiguracji ToF lub QToF w instrumentach takich jak LCT lub QToF1 (Waters) do pozyskiwania widm mas dla kompleksów o masie do 1 MDa, bez konieczności wprowadzania modyfikacji sprzętowych5.
Protokół opisany poniżej został przeprowadzony na urządzeniu Synapt (Waters).
<ol>
	<li>Przygotować roztwór CsI o stężeniu 100 mg/ml w wodzie oczyszczonej. CsI jest wykorzystywany do kalibracji wysokich mas, ponieważ jednokrotnie naładowane klastry soli, (CsI)nCs+, obejmują szeroki zakres mas, od 393 m/z do wartości znacznie przekraczających 10 000 (Rysunek 2).</li>
	<li>Za pomocą pęsety o zaokrąglonych końcach wyjąć powlekaną kapilarę z szalki Petriego i nanieść 2μL roztworu CsI do kapilary, używając końcówki Eppendorf GeLoader.</li>
	<li>Włożyć kapilarę do uchwytu kapilarnego i ustawić ją w taki sposób, aby końcówka znajdowała się w odległości około 10 mm od krawędzi uchwytu.</li>
	<li>Przesunąć roztwór w stronę końcówki kapilary ręcznie lub za pomocą adaptera do wirowania (spin down).</li>
	<li>Umieścić kapilarę pod mikroskopem optycznym i przyciąć końcówkę, używając ostrej pęsety typu AA.</li>
	<li>Podłączyć uchwyt kapilarny do interfejsu nanoflow ES. Obrócić stół x-y-z do tyłu, aby uniknąć uszkodzenia kapilary, a następnie przesunąć stół do pozycji aktywnej. Kapilara powinna znajdować się w odległości 1 - 10 mm od otworu stożka.</li>
	<li>Przyłożyć napięcie kapilarne (1,050-1,400 V) i niskie ciśnienie nanoflow (0.00-0.03 bar) aż do zainicjowania rozpylania, a następnie spróbować zredukować ciśnienie nanoflow do wartości minimalnej.</li>
	<li>Zoptymalizować intensywność sygnału poprzez regulację położenia stołu x-y-z, napięcia kapilarnego, ciśnienia nanoflow oraz przepływu gazu desolwatacyjnego.</li>
	<li>Aby wykryć szeroki zakres mas serii piku CsI, należy zoptymalizować napięcia przyspieszające (stosujemy następujące parametry: kapilara 1.3-1.7 kV, stożek próbkowy 80-150 V, stożek ekstrakcyjny 1-3 V).</li>
	<li>W celu optymalizacji transmisji jonów o wysokiej masie, które wymagają łagodnych warunków desolwatacji, należy zwiększyć ciśnienie podtrzymujące w początkowym stopniu próżni, między źródłem a analizatorem. Można to osiągnąć poprzez ostrożne zmniejszenie przewodności linii próżni źródła do pompy scroll poprzez częściowe zamknięcie zaworu izolacyjnego (SpeediValve). Aby wyznaczyć punkt optymalny, czynność tę należy wykonywać monitorując wpływ na intensywność sygnału (zazwyczaj stosujemy 3.0-6.5 mBar).</li>
	<li>Zebrać około 30 skanów z prędkością 1 skan/sek, w zakresie m/z od 1,000 do 15,000 m/z.</li>
	<li>Po akwizycji skalibrować TOF, korzystając z odpowiedniej tabeli kalibracyjnej.</li>
</ol>
Część 4: Analiza MS nienaruszonych kompleksów białkowych
<ol>
	<li>Wprowadź próbkę zgodnie z opisem (Część 3, sekcje 2-5) i zainicjuj rozpylanie.</li>
	<li>Rozpocznij od wstępnej optymalizacji rozpylania (Część 3, sekcje 6-9), aż do momentu wykrycia sygnału. Dokładne położenie stanów ładunku zależy od białka; można je jednak przewidzieć, korzystając z zależności między masą jonu a średnim stanem ładunku, zgodnie z wzorem: (Zav)10: Zav = 0.0778√(m), gdzie m jest masą kompleksu w daltonach. Aby zapobiec dysocjacji kompleksu, nie należy podgrzewać źródła jonów: należy wyłączyć grzałkę lub utrzymywać temperaturę poniżej 40 °C.</li>
	<li>Zmieniaj położenie kapilary oraz napięcia stożka próbkowego (sample cone) i ekstraktora w celu maksymalizacji transmisji jonów, kontrolując wynikowe zmiany w widmach. Możliwym punktem wyjścia może być napięcie stożka 100 V, stożek ekstraktora: 1 V i napięcie kapilary 1,5 kV. Zoptymalizuj te parametry w połączeniu z ciśnieniem nanoflow.</li>
	<li>Aby poprawić desolwatację i usunąć resztkową wodę oraz składniki buforu, zwiększ napięcie polaryzujące (bias voltage) oraz ciśnienie gazu w komórce kolizyjnej. Krok ten należy przeprowadzić ostrożnie, aby zapobiec dysocjacji kompleksu. Typowe napięcia polaryzujące mieszczą się w zakresie 10-100 V, przy przepływie gazu w pułapce 1-10 ml/min (Rysunek 3). Ręczna regulacja ustawień RF i profilu kwadrupola może poprawić transmisję jonów o wysokiej masie.</li>
	<li>Dostrój energie kolizyjne pułapki (Trap) i transferu (Transfer). Często do transmisji jonów o wysokiej masie wymagane są wyższe napięcia (zazwyczaj w zakresie 10-30 V). Na tym etapie ważne jest unikanie dysocjacji kompleksu indukowanej kolizyjnie.</li>
	<li>Po uzyskaniu stabilnego sygnału zaleca się zmniejszenie ciśnienia nanoflow i napięcia kapilary do minimalnych wartości, przy jednoczesnym zachowaniu stabilnego rozpylania.</li>
</ol>
Część 5: Tandemowa spektrometria mas: dysocjacja kompleksów białkowych
<ol>
	<li>Po uzyskaniu optymalnego i stabilnego sygnału należy wybrać jon prekursorowy. Ustaw centrum masy oraz szerokość izolacji (zazwyczaj stosujemy rozdzielczość LM na poziomie 12 oraz rozdzielczość HM w zakresie od 13 do 15). Aby wykryć produkty dysocjacji o wysokiej masie i niskim ładunku, należy zastosować szeroki zakres mas. Zaleca się ustawienie zakresu m/z na poziomie maksymalnym, a następnie zredukowanie go do pożądanych wartości. Sugerujemy również nałożenie na siebie widm MS i MS/MS w celu walidacji izolacji wybranego jonu prekursorowego.</li>
	<li>Aby przeprowadzić analizę MS/MS, należy zdysocjować jon prekursorowy poprzez zwiększenie energii kolizyjnej (CE) oraz ciśnienia w komorze kolizyjnej. Zwiększaj stopniowo energię CE w pułapce (Trap) lub w komorze transferowej (Transfer) w krokach 10-20 V i podnieś ciśnienie gazu kolizyjnego do poziomu 0-5 ml/min (wartości typowe). Monitoruj zmiany w widmach, aż do osiągnięcia optymalnych warunków aktywacji. Wysoka energia aktywacji może indukować dysocjację jednej lub więcej podjednostek z nienaruszonego kompleksu, co pozwala wyjaśnić powinowactwa oddziaływań różnych podjednostek. Zazwyczaj stosujemy argon jako gaz kolizyjny w komorach Trap/Transfer, choć zgłaszano korzyści z użycia cięższych gazów (np. Xe lub SF6); są one jednak znacznie droższe11 (Rycina 3).</li>
	<li>Zaleca się wybór więcej niż jednego stanu ładunku do analizy MS/MS. W przypadku nakładania się komponentów, pozyskanie zestawu widm tandemowych MS pomoże w rozdzieleniu serii ładunków różnych populacji. Ponadto stany o wyższym ładunku dysocjują łatwiej w porównaniu do stanów o niższym ładunku12.</li>
	<li>Oprócz charakteryzacji nienaruszonego kompleksu sugeruje się, że w łagodnych warunkach denaturujących powstaną mniejsze subkompleksy w roztworze. Analizy MS i MS/MS subkompleksów stanowią podstawę do zdefiniowania architektury podjednostek kompleksu13. Aby uzyskać częściową dysrupcję oddziaływań podjednostka-podjednostka, należy stopniowo dodawać rozpuszczalniki organiczne (np. metanol, izopropanol lub acetonitryl) do stężenia 50% lub zmienić pH roztworu poprzez dodanie amoniaku lub kwasu mrówkowego (do stężenia 4%).</li>
	<li>Aby wyznaczyć masy poszczególnych podjednostek tworzących kompleks, ważne jest pozyskanie widma w warunkach denaturujących. Można to przeprowadzić przy użyciu Zip-Tip C4 (Millipore) z zastosowaniem stosunku wody do acetonitrylu 25:75 oraz 1% kwasu mrówkowego jako rozpuszczalnika do elucji.</li>
</ol>
Część 6: Przetwarzanie i analiza danych
<ol>
	<li>Dane są analizowane offline za pomocą programów do analizy widmowej widm MS. Zazwyczaj korzystamy z programu MassLynx (Waters).</li>
	<li>W przypadku widm obejmujących szeroki zakres m/z zalecamy stosowanie różnych schematów wygładzania i parametrów centroidowania dla regionów wysokich i niskich m/z, aby odzwierciedlić różnice w rozdzielczości pików w tych obszarach.</li>
	<li>Do identyfikacji serii ładunków oraz obliczania stanów ładunku i mas można zastosować funkcję „manual find” w programie MassLynx. W przypadku złożonych widm masowych z nakładającymi się komponentami łatwiejsze może okazać się ręczne obliczanie mas.</li>
	<li>Aby ułatwić procesy przypisywania, można użyć dodatkowego oprogramowania; na przykład: MaxEnt do dekonwolucji widm14, SOMMS do dopasowania i symulacji pików15 oraz SUMMIT do określania składu i stechiometrii subkompleksów białkowych oraz generowania sieci oddziaływań białkowych13,16,17.</li>
</ol>
Część 7: Reprezentatywne wyniki
<img alt="Metoda chromatografii TLC; konfiguracja komory wywoławczej pokazująca rozmieszczenie płytek; rozdzielenie związków." src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przygotowywanie kapilar do nano-elektronadzezowania pokrytych złotem. 
A. Przytwierdź dwa dwustronne paski samoprzylepne do szalki Petriego w odstępie 2 cm. Aby podeprzeć przygotowane kapilary, umieść pręcik szklany (8 cm x 5 mm) w centrum jednego z pasków. B. Przyklej tępe końce przygotowanych kapilar do paska samoprzylepnego, opierając ich końcówki o pręcik szklany. C. Po wypełnieniu szalki Petriego przygotowanymi kapilarami, pokryj je złotem, aż na zewnętrznej powierzchni kapilar zostanie równomiernie osadzona cienka warstwa złota.
<img alt="Wyniki spektrometrii mas, wykres widma m/z, analiza klastrów cezu, detekcja wzorców jonowych." src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Kalibracja wysokich mas przy użyciu jonów jodku cezu. 
Duże i monizotopowe klastry CsI sprawiły, że związek ten stał się preferowanym wyborem do kalibracji spektrometrów mas w analizach wysokich mas. Seria równomiernie rozmieszczonych pików rozciąga się w szerokim zakresie, od m/z 393 do wartości znacznie przekraczających 10 000. Są one przypisane do jednokrotnie naładowanych klastrów soli o ogólnym składzie (CsI)nCs+. Dodatkowe sygnały pomiędzy głównymi pikami są powodowane przez dwu- i trzykrotnie naładowane gatunki z tej serii; odpowiednio [(CsI)nCs2]2+ oraz [(CsI)nCs3]3+. Zwiększenie ciśnienia na wstępnym etapie próżni jest niezbędne do detekcji klastrów o wysokiej masie. Wpływ ciśnienia na piki wysokich mas przedstawiono na panelach A. i B przy odczytach ciśnienia wynoszących odpowiednio 1,2 i 5,3. C. Powiększenie widma mas pokazanego na panelu B.
<img alt="Chromatografia spektrometrii mas, stany ładunku, wyniki elektroforezy, schemat analizy białek." src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Widma masowe nanoprądowej elektrorozpylnej spektrometrii mas pentamerycznej lektyny. 
A. Spektrometria mas kompleksu wariantu lektyny (pochodzącego z Lib1-B7 w wyniku ewolucji kierowanej18) daje rozkłady stanów ładunku między 3 000 a 5 000 m/z; jednak ze względu na niewystarczającą desolwatację jonów piki są szerokie. Porównanie paneli A. i B. pokazuje wpływ zwiększenia napięcia polaryzującego z 4 V (A.) do 15 V (B.) na szerokość piku. Ten wzrost warunków przyspieszania powoduje usunięcie resztkowej wody i składników buforu, co daje widmo o wysokiej rozdzielczości. Zmierzona masa (60 240 ± 38 Da) odpowiada kompleksowi pentamerycznemu. C. Do analizy tandemowej MS wybrano następnie stan ładunku +15 (zaznaczony na szaro w panelu B.) D. Zwiększenie energii kolizyjnej powoduje uwolnienie silnie naładowanego monomeru, z centrum przy 1 664 m/z, oraz pozbawionego części składników kompleksu tetramerycznego w zakresie 5 000–8 000 m/z. Wszystkie widma uzyskano z próbki zawierającej 20 μM roztworu w 0,5 M octanie amonu.

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+collection+of+protein+machines%3A+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+complexes+in+the+gas+phase%3A+technology+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li>
<li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+mass+spectrometry%3A+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li>
<li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li>
<li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li>
<li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li>
<li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li>
<li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li>
<li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li>
<li>Mora, dela, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li>
<li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li>
<li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li>
<li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li>
<li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li>
<li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li>
<li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li>
<li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li>
<li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li>
<li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies%3A+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li>
<li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li>
<li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li>
<li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li>
<li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li>
<li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid%3A+insights+from+MS+of+intact+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li>
<li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Aby uzyskać widma wysokiej jakości, należy zwrócić uwagę na etapy przygotowania próbek, które obejmują ich zagęszczanie oraz wymianę buforu. Próbki zbyt rozcieńczone spowodują niski sygnał, natomiast próbki o wysokim stężeniu mogą być dość lepkie i blokować igłę elektrosprayu. Co więcej, dodatki do roztworów, takie jak sole, glicerol, detergenty, jony metali i środki redukujące (DTT lub β-merkaptoetanol), mają tendencję do przylegania do zewnętrznej powierzchni białek, co powoduje poszerzenie pików. Dlatego też, aby uzyskać dobrze rozdzielone piki, składniki te należy dodawać w możliwie najniższych stężeniach.
Kolejnym kluczowym parametrem jest położenie kapilary nanofprzepływowej względem otworu spektrometru mas. Znalezienie &#34;sweet spot&#34; może być trudne dla niewprawnych użytkowników, niemniej jednak ma ono znaczący wpływ na jakość widm. Przed rozpoczęciem rozpylania należy również sprawdzić kapilarę nanofprzepływową. Wielkość kropli zależy od średnicy końcówki, która powinna wynosić ~1 μm. Małe krople prowadzą do bardziej wydajnej jonizacji, co jest zatem korzystne. Ważne jest również upewnienie się, że w kapilarze nie ma pęcherzyków powietrza, które mogłyby zablokować przepływ, oraz że powłoka złota nie została zerwana z kapilary podczas pomiaru; w takim przypadku należy dodatkowo przyciąć końcówkę. Należy pamiętać, że zbyt duża ilość próbki zwiększy możliwości optymalizacji warunków MS, takich jak napięcie kapilary, napięcia przyspieszające, ciśnienie i energia kolizyjna.
Ogólnie rzecz biorąc, procedury wyjaśnione w protokole były wykorzystywane do określania składu, stechiometrii i architektury licznych kompleksów białkowych (patrz przeglądy 2,3,4). Przykłady wartości tego podejścia obejmują analizę dużych kompleksów o masie rzędu MDa, takich jak rybosom19 i wysoce uporządkowane kapsydy wirusowe20-22, określanie wiązania substratów w maszynach molekularnych23-25 oraz charakteryzację sieci oddziaływań podjednostek26,17,16,17,27,28.

<table><tbody><tr><td>Objętość 1-2 &amp;mu;L</td><td></td><td></td><td>Na kapilarę</td></tr><tr><td>Stężenie 1-20 &amp;mu;M</td><td></td><td></td><td>Na kompleks</td></tr><tr><td>Wodny bufor lotny, taki jak octan amonu przy pH= 6- 8</td><td></td><td></td><td>Zazwyczaj 5 mM-1 M</td></tr><tr><td>Detergent (Minimalny)</td><td></td><td></td><td>Klastry cząsteczek detergentu powodują powstawanie szerokich i nierozdzielonych pików</td></tr><tr><td>Glicerol (Minimalny, do 5%)</td><td></td><td></td><td>Wiąże się niespecyficznie z białkami, co w konsekwencji prowadzi do obserwacji szerokich pików</td></tr><tr><td>Rozpuszczalniki organiczne (Do 50%)</td><td></td><td></td><td>Mogą denaturować kompleksy białkowe</td></tr><tr><td>Kwasy (Do 4%)</td><td></td><td></td><td>Denaturują kompleksy białkowe</td></tr><tr><td>Sole (Minimalne)</td><td></td><td></td><td>Addukty solne prowadzą do powstawania szerokich i nierozdzielonych pików</td></tr><tr><td>DTT (Minimalny)</td><td></td><td></td><td>Może występować w stężeniu 1-2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Czynniki chelatujące (Minimalne)</td><td></td><td></td><td>Stężenia powyżej 250 &amp;mu;M prowadzą do intensywnego tworzenia adduktów</td></tr></tbody></table>

analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Żywe komórki kontrolują i regulują swoje procesy biologiczne poprzez skoordynowane działanie licznych białek, które łączą się w szereg dynamicznych, wielobiałkowych kompleksów1. Aby uzyskać mechanistyczne zrozumienie różnych procesów komórkowych, kluczowe jest określenie struktury takich kompleksów białkowych oraz ujawnienie, w jaki sposób ich organizacja strukturalna determinuje ich funkcję. Wiele aspektów kompleksów wielobiałkowych jest jednak trudnych do scharakteryzowania ze względu na ich heterogeniczną naturę, asymetryczną strukturę i dynamikę. W związku z tym konieczne jest opracowanie nowych podejść do badania trzeciego poziomu organizacji białek.
Jednym z rozwijających się narzędzi biologii strukturalnej do analizy kompleksów makromolekularnych jest spektrometria mas (MS)2-5. Metoda ta dostarcza informacji o złożonym składzie białkowym, stechiometrii podjednostek oraz topologii strukturalnej. Potencjał MS wynika z wysokiej czułości, a w konsekwencji z niewielkiego zapotrzebowania na próbkę, co umożliwia badanie kompleksów białkowych ekspresowanych na poziomach endogennych. Kolejną zaletą jest szybkość analizy, która pozwala na monitorowanie reakcji w czasie rzeczywistym. Ponadto technika ta umożliwia jednoczesny pomiar charakterystyk oddzielnych populacji współistniejących w mieszaninie.
W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół zastosowania strukturalnej spektrometrii mas (MS) do analizy dużych kompleksów białkowych. Procedura rozpoczyna się od przygotowania kapilar powlekanych złotem do nanoprzepływowej jonizacji przez rozpylanie elektrospray (nESI). Następnie przechodzimy do przygotowania próbek, kładąc nacisk na warunki buforowe, które z jednej strony powinny być kompatybilne z nESI, a z drugiej umożliwiać zachowanie nienaruszonej struktury kompleksów. Następnie wyjaśniamy krok po kroku, jak optymalizować warunki eksperymentalne dla pomiarów wysokich mas oraz jak pozyskiwać widma MS i tandemowej spektrometrii mas (MS/MS). Na koniec przedstawiamy przebieg przetwarzania i analizy danych. Zamiast próbować scharakteryzować każdy aspekt kompleksów białkowych, niniejszy protokół wprowadza podstawowe procedury MS, umożliwiając przeprowadzanie eksperymentów MS i MS/MS na kompleksach niekowalencyjnych. Naszym ogólnym celem jest dostarczenie badaczom nieznającym dziedziny strukturalnej spektrometrii mas wiedzy o głównych narzędziach eksperymentalnych.

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Żywe komórki kontrolują i regulują swoje procesy biologiczne poprzez skoordynowane działanie ogromnej liczby białek, które łączą się w...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest charakterystyka dużych kompleksów białkowych przy użyciu strukturalnej spektrometrii mas. Jest to osiągane poprzez przygotowanie kapilar powlekanych złotem do nanprzepływowej jonizacji elektronicznej (ESI). W drugim kroku przygotowywana jest próbka, a spektrometr mas jest kalibrowany do pomiarów wysokich mas.Następnie optymalizuje się warunki eksperymentalne, aby zachować kompleksy białkowe w stanie nienaruszonym w fazie gazowej. Następnie rejestrowane są widma MS oraz tandemowe MS. Widma MS wykazały stany ładunku odpowiadające masie nienaruszonego kompleksu, natomiast eksperymenty tandemowego MS pozwoliły określić wzorzec asocjacji monomerów i kompleksów pozbawionych ligandów.Cześć, jestem Naam Kiba z Laboratorium Mirona w Instytucie Nauki Whitemana, a ja jestem Isaac Ky. Ja również pochodzę z laboratorium michelon. Dzisiaj chcielibyśmy zaprezentować podstawową procedurę analizy dużych kompleksów białkowych z zastosowaniem spektrometrii strukturalnej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do charakteryzacji kompleksów białkowych w celu określenia ich geometrii, składu oraz sieci oddziaływań. Zapraszam do oglądania.Analiza kompleksów białkowych związanych w sposób nieprądowy jest przeprowadzana techniką immunizacji przez rozpylanie powietrzne z wykorzystaniem kapilar as emme plus lub a qua. Kapilarę C można wyciągnąć do uzyskania cienkiej końcówki o średnicy około 1 µm, a następnie pokryć materiałem przewodzącym, takim jak złoto. Kapilary te są dostępne w sprzedaży, co można zobaczyć tutaj.Jest to jednak rozwiązanie znacznie bardziej opłacalne. Kapilary szklane, które mogą zostać schłodzone i pokryte warstwą w celu przygotowania do użycia, są schładzane za pomocą tego urządzenia do chłodzenia igieł oraz pokrywane za pomocą tego urządzenia do powlekania. Aby rozpocząć procedurę, przyklej dwa paski dwustronnej taśmy klejącej do dna szalki Petriego, zachowując odstęp 2 cm między paskami.Umieść pręcik szklany na środku jednej z podkładek. Podkładka adhezyjna utrzymuje kapilary w miejscu, a pręcik szklany podtrzymuje przygotowane kapilary i chroni ich końcówki przed złamaniem. Użyto kapilar z borokrzemianowego szkła o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,78 mm.Włóż jedną kapilarę do igły, delikatnie przymocuj ją zaciskiem i wyreguluj jej położenie tak, aby znajdowała się w centrum drucika grzejnego. Delikatnie dokręć zaciski, aż kapilara zostanie stabilnie unieruchomiona z obu końców. Wyciągnij kapilarę, korzystając z zdefiniowanego programu przedstawionego tutaj.Należy jednak pamiętać, że proces programowania wyciągarki opiera się na metodzie prób i błędów. Do momentu uzyskania odpowiedniego kształtu końcówki, każda wyciągnięta kapilara daje dwie gotowe kapilary o określonym kształcie. Wyjmij wyciągnięte kapilary z urządzenia i sprawdź końcówki, odrzucając wszystkie zdeformowane lub uszkodzone.Użyj pęsety pozycjonującej z tępymi końcami, aby umieścić kapilary w szalce Petriego. Podstawa kapilar powinna być przytwierdzona do podkładki adhezyjnej, a górna część powinna opierać się o prętek szklany, z końcem skierowanym do góry. Kontynuuj układanie kapilar, aż szalka Petriego zostanie całkowicie wypełniona.W naczyniu o średnicy 10 centymetrów mieści się około 80 kapilar. Następnie pokryj kapilary złotem. Włóż płytkę do napylacza złota.Należy upewnić się, że zasilanie gazem zostało wybrane zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie uruchomić zdefiniowany cykl powlekania. Proces powlekania powtarza się od trzech do sześciu razy, aż kapilary uzyskają równomierny złoty kolor. Po przygotowaniu kapilar należy przystąpić do kalibracji spektrometru mas.Większość eksperymentów przeprowadzanych na kompleksach MultiPro wykonuje się przy użyciu spektrometru mas czasu przelotu z kwadruplem i jonizacją rozpylną (Electrospray quadruple time of flight mass spectrometer), takiego jak ten. Wprowadzenie próbek odbywa się za pomocą układu firmy Waters, który został zmodyfikowany dla wysokich mas. Przed załadowaniem próbki białka należy skalibrować spektrometr mas przy użyciu jodku cezu.W pierwszej kolejności należy przygotować roztwór cezu o stężeniu 100 mg/mL w wodzie oczyszczonej. Cez służy do kalibracji wysokich mas, ponieważ jednowartościowe klastry soli obejmują szeroki zakres stosunku masy do ładunku, od 393 do ponad 10 000. Używając pęsety o tępym zakończeniu, należy wyjąć powlekaną kapilarę z szalki Petriego i nabić do niej 2 µL roztworu cezu.Używając końcówki załadowanej żelem einor. Przesuń roztwór w stronę końcówki kapilary, ręcznie lub za pomocą adaptera do wirowania. Włóż kapilarę do uchwytu kapilarnego i ustaw ją w taki sposób, aby końcówka znajdowała się około 10 milimetrów od krawędzi uchwytu.Umieść kapilarę pod mikroskopem optycznym i za pomocą ostrych pęsety typu AA przytnij jej końcówkę. Należy upewnić się, że wewnątrz kapilary nie znajdują się pęcherzyki powietrza, które mogłyby zablokować przepływ, oraz że kapilara nie jest zapchana. Ponadto upewnij się, że powłoka złota nie została zdjęta z kapilary.Jeśli tak, należy wymienić kapilarę lub przyciąć jej końcówkę i usunąć niepowlekaną sekcję. Następnie podłącz uchwyt kapilary do interfejsu nano flow ESI. Przesuń stół XY, Z do tyłu, aby uniknąć uszkodzenia kapilary, a następnie wprowadź stół do pozycji aktywnej.Kapilarę należy umieścić w odległości od 1 do 10 milimetrów od otworu stożka. Należy przyłożyć napięcie kapilarne i niskie ciśnienie przepływu nano do momentu zainicjowania rozpylania. Następnie należy spróbować zredukować ciśnienie przepływu nano do wartości minimalnej.Zoptymalizuj intensywność sygnału poprzez dostrojenie położenia stolika XYZ, napięcia kapilarnego, ciśnienia nanostrumienia oraz przepływu gazu desolwatacyjnego. Aby wykryć szeroki zakres mas serii pików sezonowych, należy zoptymalizować napięcia przyspieszające. Parametry zastosowane w tym przypadku to: kapilara 1,3 do 1,7 kilowolta, stożek próbkowy 80 do 150 wolta oraz stożek ekstrakcyjny 1 do 3 wolta w celu optymalizacji transmisji jonów o wysokiej masie, które wymagają łagodnych warunków desolwatacji.W początkowej fazie próżni pomiędzy źródłem a analizatorem ciśnienie podtrzymujące jest podnoszone do poziomu od pięciu do sześciu milibarów. Aby zwiększyć ciśnienie podtrzymujące, należy ostrożnie zmniejszyć przewodność linii próżniowej źródła do pompy spiralnej poprzez częściowe zamknięcie zaworu odcinającego, monitorując jednocześnie wpływ tego działania na intensywność sygnału. Po zakończeniu konfiguracji spektrometrów mas należy zebrać około 30 skanów z częstotliwością jednego skanu na sekundę w zakresie stosunku masy do ładunku od 1000 do 15 000; po akwizycji należy skalibrować czas przelotu, korzystając z odpowiedniej tabeli kalibracyjnej.Po zakończeniu kalibracji można wprowadzić próbkę białka. Próbka jest przygotowywana przed kalibracją spektrometru mas; wymagane są niskie stężenia mikromolarne. W razie potrzeby zagęść próbkę, korzystając z urządzeń do ultrafiltracji odśrodkowej.Przed użyciem należy zweryfikować, czy kompleks białkowy nie uległ adsorpcji do membrany urządzenia. Ze względu na sprawdzanie objętości i absorbancji UV, w technice NESI można stosować wyłącznie roztwory lotne, co często sprawia, że niezbędna jest wymiana buforu. W celu usunięcia wszelkich śladów soli, cząsteczek buforu lub innych nielotnych adduktów można zastosować mikrocentryfużową kolumnę do filtracji żelowej.Zamiast tego zawiesić próbkę w wodnym roztworze octanu amonu. Ten krytyczny krok determinuje jakość widm.Powtórz wymianę buforu do trzech razy przy minimalnym rozcieńczeniu, poniżej współczynnika 1,3 na urządzenie, aż do osiągnięcia maksymalnej wymiany. Jeśli wymagana jest zarówno koncentracja, jak i wymiana buforu, można je przeprowadzić jednocześnie, stosując ultrafiltrację odśrodkową, jak pokazano na początku tej sekcji. Następnie załaduj próbkę zgodnie z opisem dla kalibracji jodkiem cezu i uruchom rozpylanie.Rozpocznij od wstępnej optymalizacji rozpylania do momentu wykrycia sygnału. Skorzystaj z przedstawionego równania na średni stan naładowania, w którym M oznacza masę kompleksu. Wartości w Daltonach, a dokładniej precyzyjna pozycja stanów naładowania, są jednak zależne od białka.Aby zapobiec dysocjacji kompleksu, nie należy podgrzewać źródła żelaza. Należy wyłączyć grzałkę lub utrzymywać temperaturę poniżej 40 °C. Należy zmieniać położenie kapilary oraz napięcia stożka próbkowania i ekstraktora.Aby zmaksymalizować transmisję jonów żelaza, możliwym punktem wyjścia jest napięcie stożka (cone voltage) 100 V, napięcie stożka ekstrakcyjnego (extractor cone) 1 V oraz napięcie kapilary 1,5 kV. Należy sprawdzić wynikową zmianę w widmach. Parametry te należy zoptymalizować w połączeniu z ciśnieniem nanostrumienia, aby poprawić desolwatację i usunąć pozostałości wody oraz składników buforu.Zwiększ napięcie polaryzujące i ciśnienie gazu w komórce kolizyjnej. Typowe napięcia polaryzujące mieszczą się w zakresie od 10 do 100 V przy przepływie gazu w pułapce od 1 do 10 mL/min. Należy przeprowadzić tę czynność ostrożnie, aby zapobiec dysocjacji kompleksu, a następnie dostosować energie kolizyjne pułapki i transferu.Do transmisji jonów o wysokiej masie często wymagane są wyższe napięcia, zazwyczaj w zakresie od 10 do 30 V. W tym punkcie ważne jest unikanie dysocjacji kompleksu indukowanej kolizyjnie, jak pokazano tutaj. Po uzyskaniu stabilnego sygnału zaleca się zmniejszenie ciśnienia nanostrumienia oraz napięcia kapilary do wartości minimalnych, przy jednoczesnym zachowaniu stabilnego rozpylania.Po zgromadzeniu kilku skanów należy przystąpić do identyfikacji składników kompleksu za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Po uzyskaniu optymalnego i stabilnego sygnału dla kompleksu białkowego, należy wybrać jon prekursor i ustawić środek masy w szerokości izolacji. Zazwyczaj w przypadku niskiej rozdzielczości masy 12 oraz wysokiej rozdzielczości masy między 13 a 15 stosuje się szeroki zakres masy w celu wykrycia produktów dysocjacji o wysokiej masie i niskim ładunku, a następnie redukuje się go do wartości pożądanych w celu przeprowadzenia analizy ms.Metoda MS dysocjuje prekursor żelaza. Poprzez zwiększenie energii kolizyjnej (w skrócie CE) oraz ciśnienia w komórce kolizyjnej, należy stopniowo zwiększać CE pułapki lub transferu w krokach od 10 do 20 V oraz podnieść ciśnienie gazu kolizyjnego do wartości od 0 do 5 ml/min. Należy monitorować zmiany w widmach aż do osiągnięcia optymalnych warunków aktywacji. Wysoka energia aktywacji może indukować dysocjację jednej lub większej liczby podjednostek z nienaruszonego kompleksu i pozwolić na wyjaśnienie powinowactw oddziaływań różnych podjednostek.Wybierz więcej niż jeden ładunek do analizy ms MS. W przypadku nakładających się komponentów pozyskanie zestawu widm MS tandemowych pomaga w rozdzieleniu serii ładunków różnych populacji. Ponadto stany o wyższym ładunku dysocjują łatwiej niż stany o niższym ładunku; nałóż na siebie widma MS i ms.Widma MS w celu walidacji izolacji wybranego jonu prekursorowego. Oprócz charakterystyki nienaruszonego kompleksu za pomocą MS i ms/MS, w łagodnych warunkach denaturujących w roztworze powstają mniejsze podkompleksy, które również poddano charakterystyce.Analiza MS i ms MS podzespołów stanowi podstawę do zdefiniowania architektury podjednostek kompleksu. W celu częściowego zaburzenia oddziaływań między podjednostkami należy stopniowo dodawać rozpuszczalniki organiczne do stężenia 50% lub zmienić pH roztworu, dodając amoniak lub kwas mrówkowy do stężenia 4%. W końcu, aby określić masy poszczególnych podjednostek tworzących kompleks, ważne jest zarejestrowanie widma w warunkach denaturujących. Można to przeprowadzić przy użyciu zip tip C4 w stosunku wody do acetonitrylu od 25 do 75, stosując 1% kwas mrówkowy jako rozpuszczalnik elucyjny. Wszystkie zebrane dane należy przetworzyć i przeanalizować zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Przed wprowadzeniem próbki kompleksu białkowego spektrometry mas zostają skalibrowane przy użyciu jodku cezu.Seria równomiernie rozmieszczonych piku zaznaczonych na czerwono rozciąga się w szerokim zakresie od głównego stosunku ładunku 393 do wartości znacznie przekraczającej 10 000. Przypisano je jednokrotnie naładowanym klastrom soli o ogólnym składzie kompleksu cezu na plus. Dodatkowe sygnały pomiędzy głównymi pikami, zaznaczone na czarno, są spowodowane obecnością gatunków dwu- i trzykrotnie naładowanych z serii kompleksów cezu na dwa plus oraz kompleksów cezu na trzy plus.Zwiększenie ciśnienia na początkowym stopniu próżni jest niezbędne do wykrywania klastrów o wysokiej masie. Wpływ ciśnienia na piki wysokich mas zademonstrowano tutaj przy wartościach ciśnienia odczytanych jako 1,2 oraz 5,3 millibar. Widok powiększony widma masowego dla wyższego ciśnienia przedstawiono tutaj.Poniżej przedstawiono przykład spektrometrii mas kompleksu wariantu lektyny, w której rozkład stanów ładunku mieści się w zakresie od 3000 do 5 000 m/z. Jednakże ze względu na niewystarczającą desolwatację jonów piki są szerokie. Zwiększenie napięcia polaryzującego z 4 V do 15 V, co prowadzi do nasilenia warunków przyspieszania, powoduje usunięcie pozostałych cząsteczek wody i składników buforu, co skutkuje uzyskaniem widma o wysokiej rozdzielczości; zmierzona masa odpowiada kompleksowi pentamerycznemu.Następnie do analizy tandemowej MS wybrano stan naładowania +15. Zwiększenie energii kolizyjnej powoduje uwolnienie wysoko naładowanego monomeru z centrum przy stosunku masy do ładunku 1 664 oraz pozbawionego ligandów kompleksu tetramerycznego w zakresie stosunku masy do ładunku od 5 000 do 8 000. Kompleks wariantu lektyny zbadano również w warunkach denaturujących, co doprowadziło do asocjacji kompleksów.W ten sposób można określić dokładną masę poszczególnych podjednostek tworzących kompleks. Przedstawiliśmy właśnie sposób pozyskiwania widm MS i MS/MS dla jonów o wysokiej masie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest prawidłowe przygotowanie próbki oraz stosowanie wyłącznie buforów lotnych, które są kompatybilne ze spektrometrią mas.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

analyzing-large-protein-complexes-by-structural-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą spektrometrii mas z otoczenia strukturalnego

Spektrometria mas sprzężona z mobilnością jonów to rozwijająca się technologia fazy gazowej, która rozdziela jony na podstawie ich przekroju czynnego zderzeń oraz masy. Metoda ta dostarcza trójwymiarowych informacji o ogólnej topologii i kształcie kompleksów białkowych. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy podstawową procedurę konfiguracji i optymalizacji instrumentu, kalibracji czasów dryfu oraz interpretacji danych.

Spektrometria mas z mobilnością jonów w polu falowym T: podstawowe procedury eksperymentalne w analizie kompleksów białkowych

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Opisano eksperymentalne procedury znakowania kowalencyjnego na bazie dietylopirowęglanów z detekcją spektrometryczną mas. Wodorowęglan dietylu jest po prostu mieszany z białkiem lub kompleksem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania, co prowadzi do modyfikacji reszt aminokwasowych dostępnych w rozpuszczalniku. Zmodyfikowane pozostałości można zidentyfikować po mineralizacji proteolitycznej i analizie metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas.

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Poznaj analizę dużych kompleksów białkowych za pomocą spektrometrii masowej. Ta metoda pozwala na charakteryzację makromolekularnych struktur i zapewnia wgląd w ich skład oraz architekturę.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów