Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest scharakteryzowanie dużych zespołów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas. Osiąga się to poprzez przygotowanie pozłacanych kapilar do jonizacji elektronatryskowej nanoprzepływu. W drugim etapie przygotowuje się próbkę, a spektrometr mas jest kalibrowany do pomiarów o dużej masie.

Następnie optymalizuje się warunki eksperymentalne w celu utrzymania kompleksów białkowych w stanie nienaruszonym w fazie gazowej. Następnie nabywa się MS i tandem Ms.Spectra. Widma MS wykazywały stany ładunku odpowiadające masowo nienaruszonemu kompleksowi, podczas gdy tandemowe eksperymenty MS dostarczyły wzorca asocjacji monomerów i odroczonych kompleksów.

Cześć, nazywam się Naam Kiba z Laboratorium Mirona w Instytucie Naukowym Whitemana, nazywam się Isaac Ky. Również jestem z laboratorium Michelon. Dzisiaj chcielibyśmy pokazać Państwu podstawową procedurę analizy dużych kompleksów białkowych za pomocą spektrometrii strukturalnej, I używamy tej procedury w naszym laboratorium do charakteryzowania kompleksów białkowych w celu zdefiniowania geometrii wyjściowej, składu i sieci interakcji. Więc zacznijmy.

Analizę nieprądowo związanych kompleksów białkowych przeprowadza się techniką immunizacji w sprayu powietrznym przy użyciu jako emme plus lub qua kapilarne. Ta kapilara C może być pociągnięta do cienkiej końcówki o średnicy około jednego mikrona, a następnie pokryta materiałem przewodzącym, takim jak złoto. Te naczynia włosowate są dostępne w handlu, jak można zobaczyć tutaj.

Jest jednak o wiele bardziej opłacalny w użyciu. Szklane kapilary, eh, które mogą być następnie chłodzone i pokryte do gotowego do użycia chłodzenia, są wykonywane na tym urządzeniu do łączenia igieł i powlekanie na tym urządzeniu do powlekania eh. Aby rozpocząć tę procedurę, przymocuj dwa paski dwustronnej podkładki samoprzylepnej do dna szalki Petriego, utrzymując paski w odległości dwóch centymetrów od siebie.

Umieść szklany pręt na środku jednej z podkładek. Podkładka adhezyjna utrzymuje naczynia włosowate na miejscu, a szklany pręt podtrzymuje przygotowane naczynia włosowate i zapobiega pękaniu końcówek naczyń włosowatych. Zastosowano kapilary ze szkła krzemianowego Boris o średnicy zewnętrznej jednego milimetra i średnicy 0,78 milimetra.

Włóż jedną kapilę do igły, delikatnie zbij kapilarnę na miejscu i dostosuj jej położenie tak, aby leżała w środku filamentu grzewczego. Dokręć zaciski delikatnie, aż naczynia włosowate będą mocno przylegać na obu końcach. Pociągnij kapilarnę za pomocą predefiniowanego programu pokazanego tutaj.

Pamiętaj jednak, że proces programowania ściągacza to proces prób i błędów. Dopóki nie zostanie uzyskany akceptowalny kształt końcówki, każde pociągnięcie kapilary powoduje powstanie dwóch naczyń włosowatych o ostatecznym kształcie. Usuń wyciągnięte kapilary z instrumentu i sprawdź końcówki, odrzucając te, które są zdeformowane lub złamane.

Użyj pęsety pozycjonującej, aby umieścić naczynia włosowate na szalce Petriego. Podstawa naczyń włosowatych przymocowanych do podkładki samoprzylepnej i górnej części opiera się o szklany pręt końcówką skierowaną do góry. Kontynuuj ciągnięcie naczyń włosowatych, aż szalka Petriego będzie pełna.

Około 80 naczyń włosowatych mieści się w naczyniu o średnicy 10 centymetrów. Następnie pokryj naczynia włosowate złotem. Włóż płytkę do napylania złota.

Upewnij się, że zasilanie gazem jest wybrane zgodnie z instrukcjami producenta i aktywuj predefiniowany cykl powlekania. Powłokę powtarza się od trzech do sześciu razy, aż naczynia włosowate będą równomiernie złote. Gdy kapilary będą gotowe, przystąp do kalibracji spektrometru mas

Większość eksperymentów przeprowadzanych na kompleksach MultiPro jest wykonywana za pomocą spektrometru masowego al Electrospray o poczwórnym czasie przelotu, takiego jak ten. Pozyskiwany z wód, który jest modyfikowany do dużych mas. Przed załadowaniem próbki białka skalibrować spektrometr masowy za pomocą jodku cezu.

Najpierw przygotuj 100 miligramów na mililitr roztworu cezu w oczyszczonej wodzie, cez jest używany do kalibracji o dużej masie. Ponieważ pojedynczo naładowane skupiska soli rozciągają się w szerokim zakresie mas od 393 masztów do stosunku ładunków do znacznie ponad 10 000. Za pomocą pęsety weź pokrytą kapilę z szalki Petriego i załaduj dwa mikrolitry roztworu cezu do kapilary.

Za pomocą końcówki z żelem Einor. Przesuń roztwór w kierunku końcówki kapilary, ręcznie lub użyj adaptera do obracania. Włóż kapilę do uchwytu kapilary i wyreguluj kapilarę w taki sposób, aby końcówka znajdowała się w odległości około 10 milimetrów od krawędzi uchwytu.

Umieść kapilarnę pod mikroskopem optycznym i użyj ostrej pęsety typu AA, aby przyciąć końcówkę. Ważne jest, aby sprawdzić, czy w kapilarze nie ma pęcherzyków powietrza, które mogłyby blokować przepływ i czy kapilara nie jest zatkana. Ponadto upewnij się, że złota powłoka nie została usunięta z kapilary.

Jeśli tak, wymień kapilarę lub przytnij końcówkę i usuń niepowlekaną część. Następnie podłącz uchwyt kapilary do interfejsu nano flow ESI. Obróć stolik XY, Z do tyłu, aby uniknąć uszkodzenia kapilary i wepchnij stolik do pozycji aktywnej.

Kapilara powinna być umieszczona w odległości od jednego do 10 milimetrów od otworu stożka. Zastosuj napięcie kapilarne i niskie ciśnienie przepływu nano, aż do rozpoczęcia natryskiwania. Następnie spróbuj zmniejszyć ciśnienie przepływu nano do minimalnej wartości.

Zoptymalizuj intensywność sygnału, dostosowując położenie stolika XYZ, napięcie kapilarne, ciśnienie przepływu nano i przepływ gazu do solwatacji. Aby wykryć szeroki zakres mas serii szczytów sezonowych, należy zoptymalizować napięcia przyspieszające. Stosowane tutaj parametry to kapilarna stożek próbki o napięciu od 1,3 do 1,7 kilowolta, 80 do 150 woltów, stożek ekstrakcyjny, od jednego do trzech woltów w celu optymalizacji transmisji jonów o dużej masie, które wymagają delikatnych warunków odtłuszczania.

Ciśnienie dotłaczające jest podnoszone do pięciu do sześciu milibarów w początkowym etapie próżni między źródłem a analizatorem. Aby podnieść ciśnienie dotłaczające, należy ostrożnie zmniejszyć przewodność przewodu podciśnienia źródła do pompy spiralnej, częściowo zamykając zawór odcinający, jednocześnie monitorując wpływ na intensywność sygnału. Po zakończeniu konfiguracji spektrometrów mas zbierz około 30 skanów przy jednym skanowaniu na sekundę w zakresie współczynnika naładowania głównego od 1000 do 15 000 po akwizycji skalibruj czas przelotu przy użyciu odpowiedniej tabeli kalibracyjnej.

Teraz, po zakończeniu kalibracji, można załadować próbkę białka. Próbka jest przygotowywana przed kalibracją spektrometru mas wymagane są niskie stężenia mikromolowe. W razie potrzeby zagęścić próbkę za pomocą odśrodkowych urządzeń do ultrafiltracji.

Przed użyciem sprawdź, czy kompleks białkowy nie został wchłonięty przez błonę urządzenia. Sprawdzając objętość i absorbancję UV, do NESI można stosować tylko roztwory lotne, co często powoduje konieczność wymiany buforu. Kolumna filtracyjna z żelem do mikrowirówek może być użyta do usunięcia wszelkich śladów soli, cząsteczek buforowych lub innych nielotnych adduktów.

Zamiast tego zawieś próbkę. Wodny roztwór octanu amonu. Ten krytyczny krok decyduje o jakości widm.

Powtórz wymianę buforu do trzech razy przy minimalnym rozcieńczeniu, mniejszym niż współczynnik 1,3 na urządzenie, aż do osiągnięcia maksymalnej wymiany. Jeśli wymagana jest zarówno wymiana stężenia, jak i buforu, można je przeprowadzić razem za pomocą ultrafiltracji odśrodkowej, jak pokazano na początku tego rozdziału. Następnie załaduj próbkę, jak pokazano, do kalibracji jodku cezu i rozpocznij rozpylanie.

Zacznij od wstępnej optymalizacji strumienia, aż do momentu wykrycia sygnału. Użyj równania dla średniego stanu naładowania, pokazanego w którym M jest masą kompleksu. Jednak u daltonów dokładne położenie stanów ładunku jest zależne od białka.

Aby zapobiec złożonej dysocjacji, nie podgrzewaj źródła żelaza. Wyłącz grzejnik lub utrzymuj temperaturę poniżej 40 stopni Celsjusza. Zmieniaj położenie kapilary, stożek próbki i napięcia ekstraktora.

Aby zmaksymalizować transmisję żelaza, możliwym punktem wyjścia jest napięcie stożka, stożek ekstraktora 100 woltów, jeden wolt i napięcie kapilarne 1,5 kilowolta. Sprawdź wynikającą z tego zmianę widm. Zoptymalizuj te parametry w połączeniu z nano ciśnieniem przepływu, aby poprawić deifikację i usunąć resztki wody i składniki buforowe.

Zwiększ napięcie polaryzacji ciśnienia gazu w komórce zderzeniowej. Typowe napięcia polaryzacji mieszczą się w zakresie od 10 do 100 woltów, a przepływ gazu pułapki wynosi od jednego do 10 mililitrów na minutę. Zrób to ostrożnie, aby zapobiec asocjacji kompleksu, dostosuj energie zderzenia pułapki i transferu.

Często do przesyłu jonów o dużej masie wymagane są wyższe napięcia, zwykle w zakresie od 10 do 30 woltów. W tym momencie ważne jest, aby uniknąć dysocjacji kompleksu wywołanej kolizją, jak pokazano tutaj. Po osiągnięciu stabilnego sygnału zalecono obniżenie ciśnienia przepływu nano i napięcia kapilarnego do minimalnych wartości przy zachowaniu stabilnego rozpylania.

Po zebraniu kilku skanów przystąp do identyfikacji składników kompleksu za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Po uzyskaniu optymalnego i stabilnego sygnału dla kompleksu białkowego, należy wybrać jon prekursorowy, ustawić środek masy w szerokości izolacji. Ogólnie rzecz biorąc, niska rozdzielczość masy 12 i wysoka rozdzielczość masy od 13 do 15 wykorzystują szeroki zakres mas do wykrywania produktów dysocjacji o dużej masie i niskim ładunku, a następnie redukują je do pożądanych wartości Aby wykonać ms.

MS dysocjuje prekursor żelaza Zwiększając energię zderzenia, w skrócie CE, i ciśnienie na komórce zderzeniowej, stopniowo zwiększaj pułapkę lub przenoszenie CE w krokach od 10 do 20 woltów i podnieś ciśnienie gazu zderzeniowego do zera do pięciu mililitrów na minutę. Monitoruj zmiany widm aż do osiągnięcia optymalnych warunków aktywacji. Wysoka energia aktywacji może indukować dysocjację jednej lub więcej podjednostek od nienaruszonego kompleksu i wyjaśniać powinowactwa oddziaływań różnych podjednostek.

Wybierz więcej niż jedną opłatę do analizy ms MS. W przypadku nakładających się na siebie składników, uzyskanie zestawu tandemowych widm MS pomaga w rozdzieleniu serii ładunków różnych populacji. Co więcej, stany o wyższym ładunku łatwiej dysocjują w porównaniu ze stanami o niższym ładunku, które nakładają się na MS i ms.

widma ms w celu walidacji izolacji wybranego jonu prekursorowego. Oprócz scharakteryzowania nienaruszonego kompleksu przez MS i ms. MS generuje mniejsze podkompleksy i roztwór w łagodnych warunkach denaturacji i również je charakteryzuje.

Analiza MS i ms MS podkompleksów stanowi podstawę do zdefiniowania architektury podjednostki kompleksu w celu częściowego przerwania oddziaływań podjednostek podjednostkowych, stopniowo dodaje rozpuszczalniki organiczne do stężenia 50% lub zmienia pH roztworu poprzez dodanie amoniaku lub kwasu mrówkowego do stężenia 4%Wreszcie, Aby określić masy poszczególnych podjednostek składających się na kompleks, ważne jest pozyskanie widma w warunkach denaturacji. Można to przeprowadzić za pomocą końcówki zamka błyskawicznego C cztery o stosunku wody do nitrylu od 25 do 75 z 1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnikiem wyjaśniającym ze wszystkimi zebranymi danymi i analizować wyniki zgodnie z załączonym pisemnym protokołem. Przed załadowaniem próbki kompleksu białkowego spektrometry mas kalibrują się przy użyciu jodku cezu.

Seria równomiernie rozmieszczonych pików zaznaczonych na czerwono rozciąga się w szerokim zakresie od współczynnika ładunku głównego wynoszącego 393 do znacznie przekraczającego 10 000. Są one przypisane do pojedynczo naładowanych klastrów soli o ogólnym składzie cezu i kompleksu. Dodatkowe sygnały pomiędzy głównymi pikami zaznaczonymi na czarno są powodowane przez podwójne i potrójne ładunki z szeregu cezu dwa plus kompleks i cez trzy plus kompleks.

Zwiększenie ciśnienia w początkowym etapie próżni jest niezbędne do wykrycia klastrów o dużej masie. Wpływ ciśnienia na piki o dużej masie jest tutaj pokazany za pomocą odczytów ciśnienia zwrotnego 1,2 i 5,3 milibara. Widmo masowe dla wyższego ciśnienia jest pokazane w rozszerzonym zakresie.

Oto przykład spektrometrii mas kompleksu wariantu lektyny, który powoduje rozkład stanu ładunku między 3000 a 5 000 współczynnika ładunku głównego. Jednak ze względu na odpowiednie usunięcie jonów, piki są szerokie. Zwiększenie napięcia polaryzacji z czterech woltów do 15 woltów, co powoduje wzrost warunków przyspieszania, powoduje usuwanie resztkowych składników wody i bufora, dając widmo o wysokiej rozdzielczości, mierzona masa odpowiada kompleksowi pentamerycznemu.

Stan naładowania plus 15 został następnie wybrany do analizy MS w tandemie. Wzrost energii zderzenia powoduje uwolnienie wysoko naładowanego monomeru wyśrodkowanego przy stosunku ładunku głównego 1,664 i pozbawionego kompleksu tetramerycznego w zakresie stosunku ładunku masowego od 5,000 do 8,000. Kompleks wariantu lektyny badano również w warunkach denaturacji prowadzących do asocjacji kompleksu.

W ten sposób można określić dokładną masę poszczególnych podjednostek składających się na kompleks. Właśnie pokazaliśmy, jak uzyskać widma MS i tandemowe Ms jonów o dużej masie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby odpowiednio przygotować próbkę i używać wyłącznie lotności kompatybilnych ze spektrometrią mas.

Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.