Name: In-vivo Wykrywanie oddziaływań białko-białko na powierzchniach o mikrowzorach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj technikę mikrowzorcowania do analizy interakcji białko-białko w żywych komórkach. Ta metoda umożliwia ilościową detekcję słabych oddziaływań w błonie komórkowej z wysoką przepustowością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Quentinie Beatty z Uniwersytetu w Linzu w Austrii za uprzejmą pomoc, Katharinie Strub z Uniwersytetu Genewskiego w Szwajcarii za konstrukt hCD71-GFP oraz Danielowi Leglerowi z Uniwersytetu w Konstancji w Szwajcarii za konstrukt GPI-GFP-DAF. Praca ta była wspierana przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF; projekt Y250-B03) oraz projekt GEN-AU Austriackiego Federalnego Ministerstwa Nauki i Badań.

Drukowanie mikrokontaktowe:
<ol>
	<li>Wytnij obszar mikrowzoru ze stempla PDMS za pomocą skalpela.</li>
 <li>Przemyj obszar zawierający mikrowzór, płucząc go etanolem (100%) i wodą destylowaną.</li>
 <li>Osusz stempel PDMS strumieniem azotu lub argonu.</li>
 <li>Nanieś pipetą 50 μl roztworu roboczego BSA-Cy5 (0,67 mg/ml) na stempel PDMS w taki sposób, aby cały obszar mikrowzoru został pokryty roztworem. Inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyj obszar mikrowzoru, płucząc go roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i wodą destylowaną.</li>
 <li>Osusz PDMS strumieniem azotu lub argonu.</li>
 <li>Połóż stempel PDMS pod własnym ciężarem na środku jednej laminki pokrywowej powlekanej epoksydem i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej w szalce Petriego.</li>
 <li>Oznacz pozycję stempla PDMS na tylnej stronie laminki i usuń stempel z laminki za pomocą pęsety.</li>
 <li>Przyklej komorę hybrydyzacyjną Secure Seal nad obszarem naniesionym metodą mikrodościsku na lamince. Oznaczenie pomaga zlokalizować środek obszaru.</li>
 <li>Nanieś pipetą 60 μl roztworu roboczego streptawidyny (50 μg/ml) do komory reakcyjnej i inkubuj próbkę przez 60 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyj próbkę 1 ml PBS, wprowadzając bufor przez jeden otwór komory i jednocześnie usuwając go z drugiego otworu za pomocą pompy.</li>
 <li>Nanieś pipetą 60 μl roztworu roboczego biotynilowanego przeciwciała (10 μg/ml w PBS uzupełnionym o 0,1% Tween 20; „PBST”) do komory reakcyjnej i inkubuj przez 60 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyj próbkę 1 ml PBST, a następnie 1 ml PBS, wprowadzając bufor przez jeden otwór komory i ponownie usuwając go z drugiego otworu za pomocą pompy.</li>
 <li>Przechowuj powierzchnie z mikrowzorami w PBS w ciemności w temperaturze pokojowej do momentu przygotowania komórek do wysiewu.</li>
</ol>
Inkubacja komórek na powierzchni z mikrowzorami:
<ol>
 <li>Hodować komórki adherentne do osiągnięcia 50% konfluencji w płytce do hodowli tkanek o średnicy 3 cm.</li>
 <li>Odjąć komórki wykazujące ekspresję białek przynęty (bait) i ofiary (prey) za pomocą roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), a następnie wirować przez 5 min przy 1 000 rpm.</li>
 <li>Odlać nadsącz i rozpuścić osad komórkowy w odpowiedniej pożywce wzrostowej.</li>
 <li>Wirować przez 5 min przy 1 000 rpm.</li>
 <li>Odlać nadsącz i rozpuścić osad komórkowy w odpowiedniej pożywce wzrostowej.</li>
 <li>Wymienić PBS w komorze reakcyjnej na mikrowzorcowanym szkiełku podstawowym na 60 μl zawiesiny komórkowej.</li>
 <li>Utworzyć komorę wilgotną, nasączając sterylną gąbkę wodą destylowaną i umieszczając ją w szalce Petriego, aby zapobiec wysychaniu próbki.</li>
 <li>Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 na powierzchniach mikrowzorcowanych.</li>
 <li>Przed analizą komórek pod mikroskopem wymienić pożywkę na zbuforowany roztwór soli Hanksa zawierający Ca2+ i Mg2+.</li>
</ol>
Mikroskopia:
<ol>
 <li>Okładkę szkiełkiem umieszcza się na odpowiednim uchwycie i sprawdza morfologię komórek w świetle białym.</li>
 <li>Jakość wzorów BSA-Cy5 jest sprawdzana poprzez wzbudzenie przy 647 nm.</li>
 <li>Mikrowzory fluorescencyjnego białka ofiary (GFP lub YFP) są rejestrowane przy 488 lub 514 nm przy zastosowaniu wzbudzenia w całkowitym wewnętrznym odbiciu (TIR).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Jeśli między białkami docelowymi w komórkach hodowanych na powierzchni mikrowzorowanej zachodzi interakcja, białko prey będzie podążać za redystrybucją białka bait. Powstały mikrowzór można zwizualizować za pomocą znacznika fluorescencyjnego białka prey. Co ważne, uzyskany kontrast stanowi bezpośrednią miarę siły interakcji (patrz Rysunek 1). Dzięki temu możliwa jest prosta ocena interakcji dwóch białek – bez konieczności dalszego przetwarzania zmierzonych danych pierwotnych.
<img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="Obrazy mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające struktury komórkowe do analizy lokalizacji białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Przegrupowanie przynęty w błonie plazmatycznej żywej komórki przy różnych siłach oddziaływania. Przedstawiono obrazy TIR komórek T24 transfekowanych (a) CD71-GFP na mikrobioczipach z przeciwciałem anty-CD71, (b) CD4 i cytozolowym YFP na mikrobioczipach z przeciwciałem anty-CD4 oraz (c) GPI-GFP-DAF na mikrobioczipach z przeciwciałem anty-CD59. Dane są charakterystyczne dla silnego (a), braku (b) lub słabego (c) oddziaływania. Obraz (a) został powielony z (Weghuber et al., w druku), (b) z (Schwarzenbacher et al., 2008).

<ol><li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+%22Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li>
<li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li>
<li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+screening%3A+a+technology+in+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li>
<li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

Film zawiera obrazy dostarczone przez firmę Olympus, pobrane ze strony głównej Visualization Research Lab na Uniwersytecie Brown lub powielone z publikacji (Kim et al., 2003).

Towarzyszące wideo demonstruje metodę wykrywania oddziaływań białko-białko w błonie plazmatycznej żywych komórek (Schwarzenbacher et al., 2008; Brameshuber et al., 2009; Weghuber et al., in press). W zasadzie każda platforma mikroskopowa oparta na TIRF może być wykorzystana jako system odczytu. Zaawansowane mikroskopy będą wymagane jedynie w przypadku potrzeby uzyskania wysokiej czułości (np. do detekcji pojedynczych cząsteczek). Aby osiągnąć najlepsze wyniki, podczas procesu przygotowania szczególną uwagę należy zwrócić na następujące krytyczne punkty:
<ol class="lroman">
 <li>Roztwór zapasowy Cy5 należy przechowywać w ciemności, aby uniknąć blaknięcia fluoroforu, a roztwór roboczy BSA-Cy5 przygotować bezpośrednio przed drukiem mikrokontaktowym.</li>
 <li>Należy uważać, aby nie porysować końcówką pipety mikrowzorca na PDMS i inkubować próbkę w ciemności, aby uniknąć blaknięcia fluoroforu.</li>
 <li>Przykrywo szkiełko należy położyć na sterylnym podkładzie, aby zapobiec przyklejeniu się szkiełka do szalki Petriego. Po przylegnięciu stempla PDMS do szkiełka nie wolno go przesuwać.</li>
 <li>Należy unikać pęcherzyków powietrza w komorze reakcyjnej i inkubować próbkę w ciemności, aby uniknąć blaknięcia fluoroforu.</li>
 <li>Nie należy dopuścić do wysychania próbki przez więcej niż 2 minuty, aby uniknąć tworzenia się kryształów soli.</li>
 <li>Do odrywania komórek nie należy używać trypsyny, ponieważ spowoduje ona rozcięcie domeny zewnątrzkomórkowej wcześniej wyekspresowanych białek błonowych. Unikanie trypsyny będzie pomocne w przypadku białek o niskim współczynniku obrotu w celu utworzenia mikrowzorców bezpośrednio po przyкрепieniu komórek do powierzchni.</li>
 <li>Liczbę inkubowanych komórek należy kontrolować pod mikroskopem i upewnić się, że konfluencja komórek nie przekracza 30-50%. Należy zadbać o natychmiastowe usunięcie nadmiaru komórek ze względu na ich szybkie przywieranie do powierzchni pokrytej przeciwciałami.</li>
 <li>Do dalszych analiz można wykorzystać wyłącznie szkiełka z wysokiej jakości wzorami BSA-Cy5.</li>
 <li>Preferowana jest stabilna ekspresja fluorescencyjnego białka prey ze względu na większą liczbę komórek, które można przeanalizować podczas jednego skanowania.</li>
 <li>Odpowiednie dostrojenie TIRF jest niezbędne do wizualizacji wzorów ze względu na tło cytozolowe.</li>
</ol>
Technika mikro-wzorowania oferuje kilka możliwości analizy oddziaływań białko-białko. Po pierwsze, obok ilościowego oznaczenia lokalnych, rozdzielonych przestrzennie oddziaływań białko-białko, możliwe jest również wykrywanie oddziaływań słabych lub pośrednich, bez ryzyka uzyskania dużej liczby wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. Po drugie, metoda ta umożliwia badaczowi analizę oddziaływań białko-białko w błonie plazmatycznej żywych komórek, co jest trudne do osiągnięcia za pomocą metod biochemicznych, takich jak test dwuhybrydowy. Po trzecie, podejście to pozwala na wykrywanie oddziaływań typu bait-prey, które są modulowane przez zmiany środowiskowe, takie jak temperatura, obecność różnych białek lub innych cząsteczek, a także modyfikacje potranslacyjne. W ten sposób test umożliwia przesiewanie modulatorów danej pary oddziaływań w kontekście żywych komórek. Ponadto, poprzez zmniejszenie gęstości powierzchniowej ligandu wychwytującego lub zastosowanie ligandów monowalentnych, możliwa staje się analiza stanu spoczynkowego. Wreszcie, przy zastosowaniu odpowiednich platform skanujących, liczba analizowanych komórek jest wystarczająco wysoka, aby sprostać wymogom wysokoprzepustowości stawianym przez firmy farmaceutyczne w procesie przesiewania leków (Ramm, 2005).

in-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Odszyfrowywanie sieci oddziaływań cząsteczekin vivojest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów regulujących funkcje i metabolizm komórek. Opracowano wiele opcji metodologicznych do badania oddziaływań molekularnych w komórkach, jednak większość z tych metod jest dość pośrednia, a w związku z tym trudno mierzalna ilościowo. W przeciwieństwie do nich, wprowadzono kilka zaawansowanych podejść ilościowych, które jednak trudno jest rozszerzyć na analizy wysokoprzepustowe. Aby połączyć możliwości wysokoprzepustowe z możliwością wyodrębnienia informacji ilościowych, opracowaliśmy niedawno nową koncepcję identyfikacji oddziaływań białko-białko (Schwarzenbacheret al.., 2008). W niniejszej pracy opisujemy szczegółowy protokół projektowania i konstrukcji tego systemu, który umożliwia analizę oddziaływań pomiędzy białkiem znakowanym fluoroforem („ofiarą”) a białkiem błonowym („przynętą”)in vivoKomórki wysiewa się na mikrowzorowane powierzchnie funkcjonalizowane przeciwciałami przeciwko egzoplazmatycznej domenie białka przynęty. Interakcje przynęta-ofiara analizuje się poprzez redystrybucję fluorescencyjnej ofiary. Metoda ta charakteryzuje się wysoką czułością, sięgającą poziomu pojedynczych cząsteczek, zdolnością do wykrywania słabych interakcji oraz wysoką przepustowością, co sprawia, że nadaje się ona jako narzędzie przesiewowe.

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Odczytanie sieci oddziaływań między cząsteczkami in vivo jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów regulujących funkcje i metabolizm komórki. Liczne...

Szczególne znaczenie ma poznanie sieci oddziaływań między cząsteczkami w żywych komórkach, aby zrozumieć mechanizmy regulujące metabolizm i funkcje komórkowe. Rosnąca liczba metod dostarczających informacji jakościowych i ilościowych stanowi siłę napędową w dążeniu do uzyskania holistycznego obrazu funkcji komórki. Testy Co ip, TAP tag lub fotousieciowania pozwalają na oczyszczanie kompleksów cząsteczkowych in vitro.Dodatkowo opracowano kilka podejść do analizy oddziaływań białkowych w żywej komórce. Obejmują one dwa hybrydowe skryningi lub testy komplementacji białek fluorescencyjnych. Ponadto, w celu rozwiązania tego problemu, opracowano niektóre metody spektroskopowe, takie jak FRET lub FCS, a także metody niespektroskopowe.Wspomniane techniki zostały opracowane z myślą o rejestracji dużych populacji komórek, jednak ich wadą jest to, że są one dość pośrednie, a co za tym idzie – niemal nieilościowe. W przeciwieństwie do nich, wprowadzono kilka zaawansowanych podejść ilościowych. Niemniej jednak, zwiększenie przepustowości utrudnia połączenie możliwości wysokiej przepustowości z możliwością pozyskiwania informacji ilościowych.Niedawno opracowaliśmy nową koncepcję identyfikacji oddziaływań białko-białko. Technika mikrowzorowania przedstawiona tutaj to schematyczny rysunek sieci SA z mikrowzorowaniem BSA Sci five, które są naniesione na funkcjonalizowane szkiełka podstawowe, a przestrzenie między nimi wypełnione streptawidyną, a następnie ligandami biotynylowanymi. W większości przypadków stosuje się przeciwciała przeciwko błonie.Białko przynęta w komórkach hodowanych na takich chipach mikrobiomowych. Przynęta zostanie rozmieszczona w błonie plazmatycznej zgodnie z mikro wzorem przeciwciał. Interakcje z drugim, znakowanym fluorescencyjnie białkiem ofiarą są badane poprzez pomiar stopnia współwzorowania, wykorzystując krzemową matrycę i stempel PDMS z macierzą kwadratów o określonym rozmiarze i głębokości cech.Trzy mikrometry są wytwarzane z żelu, a następnie wycinane. Stemple są płukane 100% etanolem oraz podwójnie destylowaną wodą, a przed użyciem suszone azotem. Następnie są one inkubowane z 0,67 mg/mL sci-fi.Roztwór BSA z etykietą przez 30 minut w temperaturze pokojowej podczas inkubacji; szkiełka nakrywki modyfikowane epoksydowo są czyszczone w ten sam sposób. W ten sam sposób po nakładaniu tuszu stempla są płukane PBS i wodą. W przypadku BSA sci five transfer.Stempel jest suszony azotem, a następnie bezzwłocznie umieszczany pod własnym ciężarem pod szkiełkiem nakrywkowe na 30 minut. Położenie pola mikrowzoru zostaje zaznaczone na tylnej stronie szkiełka. Po zdjęciu stempli, szkiełka nakrywkowe są uszczelniane za pomocą silikonowych masek adhezyjnych.Komory wypełnia się roztworem streptawidyny o stężeniu 50 µg/mL, który inkubuje się przez jedną godzinę, a następnie płucze 1 mL PBS. Następnie wzory streptawidyny inkubuje się z biotynilowanym przeciwciałem o stężeniu 10 µg/mL przez jedną godzinę, a po przemyciu PBS do komory wprowadza się komórki. Po przytwierdzeniu się komórek do powierzchni próbka jest gotowa do pomiarów.Jedynym wymogiem dotyczącym odczytu jest zastosowanie mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do oświetlenia próbki w konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia. Takie systemy są dostępne komercyjnie u różnych dostawców i w ostatnich latach stały się łatwe w obsłudze dla użytkownika. Nasz system detekcji został skonfigurowany na mikroskopie fluorescencyjnym epifluorescencyjnym.Lasery jonowe argonowe i kryptonowe są wykorzystywane do selektywnego wzbudzania fluorescencji użytych fluoroforów; próbki są oświetlane w konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia w obiektywie, przy użyciu obiektywu imersyjnego olejowego o dużym NA i 100-krotnym powiększeniu. Po odpowiedniej filtracji z zastosowaniem standardowych zestawów filtrów, obraz fluorescencji jest rejestrowany przez kamerę CCD z podświetleniem tylnym. Odczyt odbywa się w trybie opóźnienia czasowego i integracji (TDI), co umożliwia skanowanie dużych obszarów próbki. W tym celu próbki są przesuwane za pomocą zmotoryzowanego stolika XY zsynchronizowanego z przesunięciem linii kamery.Odbita wiązka laserowa jest obrazowana na fotodiodzie dwusegmentowej, a sygnał różnicowy służy do sterowania piezoelektrykiem w osi Z w celu szybkiego ponownego ustawienia ostrości. Czytnik jest wyposażony w zautomatyzowany system utrzymywania ostrości działający podczas procesu skanowania: pierwszy skan odbywa się przy 488 nanometr, aby selektywnie wzbudzić GFP, a drugi przy 647 nanometr w celu selektywnego wzbudzenia PS Five. Do analizy danych wykorzystujemy program do obliczania kontrastu napisany w MATLAB, oparty na intensywności fluorescencji wewnątrz i na zewnątrz obszaru uchwyconych przeciwciał.Poziom kontrastu, a tym samym stopień oddziaływania białek, jest analizowany w celu szybkiej oceny dużej liczby komórek. Można również wykorzystać dostępne komercyjnie oprogramowanie zautomatyzowane. Przykładowo, oprogramowanie do obrazowania scan R oferowane przez firmę Olympus zostało z powodzeniem przetestowane pod kątem oceny kontrastu w eksperymentach z mikrowzorowaniem.Analizujemy dobrze znaną interakcję białek CD4 i LCK w wczesnym sygnałowaniu komórek T, jak pokazano tutaj. Fluorescencyjne LCK wyraźnie redystrybuuje się w obszarach pokrytych przeciwciałami przeciwko CD4. Zaburzenie struktury klamry cynkowej, która jest głównym miejscem interakcji tych dwóch białek, poprzez dodanie chelatora cynku, zmniejsza później kontrast mikrowzorów LCK.Podsumowując, głównymi zaletami techniki mikrowzorowania są: ilościowe określanie lokalnych, rozdzielczo przestrzennych oddziaływań białkowych. Ponadto metoda ta umożliwia wykrywanie słabych oddziaływań również w błonie plazmatycznej żywych komórek, wykrywanie modulowanych oddziaływań typu bait-prey, analizę stanu spoczynkowego oraz możliwość zastosowania podejścia w badaniach wysokoprzepustowych.

in-vivo-detection-protein-protein-interactions-on-micro-patterned

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In-vivo Wykrywanie interakcji białko-białko na mikro-wzorcowanych powierzchniach

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Naszym ogólnym celem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki wyczuwają sygnały zewnątrzkomórkowe, które prowadzą do ukierunkowanego wzrostu aksonów. W tym miejscu opisujemy metodologię indukowanej światłem adsorpcji molekularnej białek, używaną do wytwarzania zdefiniowanych mikrowzorów składników macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zbadania określonych zdarzeń, które rządzą wzrostem aksonów i odnajdywaniem ścieżki.

Indukowana światłem adsorpcja molekularna białek z wykorzystaniem systemu PRIMO do mikrowzorcowania w celu zbadania odpowiedzi komórek na białka macierzy zewnątrzkomórkowej

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj technikę mikrowzorcowania do analizy interakcji białko-białko w żywych komórkach. Ta metoda umożliwia ilościową detekcję słabych oddziaływań w błonie komórkowej z wysoką przepustowością.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Przeglądaj więcej filmów