In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Szczególne znaczenie ma poznanie sieci oddziaływań między cząsteczkami w żywych komórkach, aby zrozumieć mechanizmy regulujące metabolizm i funkcje komórkowe. Rosnąca liczba metod dostarczających informacji jakościowych i ilościowych stanowi siłę napędową w dążeniu do uzyskania holistycznego obrazu funkcji komórki. Testy Co ip, TAP tag lub fotousieciowania pozwalają na oczyszczanie kompleksów cząsteczkowych in vitro.

Dodatkowo opracowano kilka podejść do analizy oddziaływań białkowych w żywej komórce. Obejmują one dwa hybrydowe skryningi lub testy komplementacji białek fluorescencyjnych. Ponadto, w celu rozwiązania tego problemu, opracowano niektóre metody spektroskopowe, takie jak FRET lub FCS, a także metody niespektroskopowe.

Wspomniane techniki zostały opracowane z myślą o rejestracji dużych populacji komórek, jednak ich wadą jest to, że są one dość pośrednie, a co za tym idzie – niemal nieilościowe. W przeciwieństwie do nich, wprowadzono kilka zaawansowanych podejść ilościowych. Niemniej jednak, zwiększenie przepustowości utrudnia połączenie możliwości wysokiej przepustowości z możliwością pozyskiwania informacji ilościowych.

Niedawno opracowaliśmy nową koncepcję identyfikacji oddziaływań białko-białko. Technika mikrowzorowania przedstawiona tutaj to schematyczny rysunek sieci SA z mikrowzorowaniem BSA Sci five, które są naniesione na funkcjonalizowane szkiełka podstawowe, a przestrzenie między nimi wypełnione streptawidyną, a następnie ligandami biotynylowanymi. W większości przypadków stosuje się przeciwciała przeciwko błonie.

Białko przynęta w komórkach hodowanych na takich chipach mikrobiomowych. Przynęta zostanie rozmieszczona w błonie plazmatycznej zgodnie z mikro wzorem przeciwciał. Interakcje z drugim, znakowanym fluorescencyjnie białkiem ofiarą są badane poprzez pomiar stopnia współwzorowania, wykorzystując krzemową matrycę i stempel PDMS z macierzą kwadratów o określonym rozmiarze i głębokości cech.

Trzy mikrometry są wytwarzane z żelu, a następnie wycinane. Stemple są płukane 100% etanolem oraz podwójnie destylowaną wodą, a przed użyciem suszone azotem. Następnie są one inkubowane z 0,67 mg/mL sci-fi.

Roztwór BSA z etykietą przez 30 minut w temperaturze pokojowej podczas inkubacji; szkiełka nakrywki modyfikowane epoksydowo są czyszczone w ten sam sposób. W ten sam sposób po nakładaniu tuszu stempla są płukane PBS i wodą. W przypadku BSA sci five transfer.

Stempel jest suszony azotem, a następnie bezzwłocznie umieszczany pod własnym ciężarem pod szkiełkiem nakrywkowe na 30 minut. Położenie pola mikrowzoru zostaje zaznaczone na tylnej stronie szkiełka. Po zdjęciu stempli, szkiełka nakrywkowe są uszczelniane za pomocą silikonowych masek adhezyjnych.

Komory wypełnia się roztworem streptawidyny o stężeniu 50 µg/mL, który inkubuje się przez jedną godzinę, a następnie płucze 1 mL PBS. Następnie wzory streptawidyny inkubuje się z biotynilowanym przeciwciałem o stężeniu 10 µg/mL przez jedną godzinę, a po przemyciu PBS do komory wprowadza się komórki. Po przytwierdzeniu się komórek do powierzchni próbka jest gotowa do pomiarów.

Jedynym wymogiem dotyczącym odczytu jest zastosowanie mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do oświetlenia próbki w konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia. Takie systemy są dostępne komercyjnie u różnych dostawców i w ostatnich latach stały się łatwe w obsłudze dla użytkownika. Nasz system detekcji został skonfigurowany na mikroskopie fluorescencyjnym epifluorescencyjnym.

Lasery jonowe argonowe i kryptonowe są wykorzystywane do selektywnego wzbudzania fluorescencji użytych fluoroforów; próbki są oświetlane w konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia w obiektywie, przy użyciu obiektywu imersyjnego olejowego o dużym NA i 100-krotnym powiększeniu. Po odpowiedniej filtracji z zastosowaniem standardowych zestawów filtrów, obraz fluorescencji jest rejestrowany przez kamerę CCD z podświetleniem tylnym. Odczyt odbywa się w trybie opóźnienia czasowego i integracji (TDI), co umożliwia skanowanie dużych obszarów próbki. W tym celu próbki są przesuwane za pomocą zmotoryzowanego stolika XY zsynchronizowanego z przesunięciem linii kamery.

Odbita wiązka laserowa jest obrazowana na fotodiodzie dwusegmentowej, a sygnał różnicowy służy do sterowania piezoelektrykiem w osi Z w celu szybkiego ponownego ustawienia ostrości. Czytnik jest wyposażony w zautomatyzowany system utrzymywania ostrości działający podczas procesu skanowania: pierwszy skan odbywa się przy 488 nanometr, aby selektywnie wzbudzić GFP, a drugi przy 647 nanometr w celu selektywnego wzbudzenia PS Five. Do analizy danych wykorzystujemy program do obliczania kontrastu napisany w MATLAB, oparty na intensywności fluorescencji wewnątrz i na zewnątrz obszaru uchwyconych przeciwciał.

Poziom kontrastu, a tym samym stopień oddziaływania białek, jest analizowany w celu szybkiej oceny dużej liczby komórek. Można również wykorzystać dostępne komercyjnie oprogramowanie zautomatyzowane. Przykładowo, oprogramowanie do obrazowania scan R oferowane przez firmę Olympus zostało z powodzeniem przetestowane pod kątem oceny kontrastu w eksperymentach z mikrowzorowaniem.

Analizujemy dobrze znaną interakcję białek CD4 i LCK w wczesnym sygnałowaniu komórek T, jak pokazano tutaj. Fluorescencyjne LCK wyraźnie redystrybuuje się w obszarach pokrytych przeciwciałami przeciwko CD4. Zaburzenie struktury klamry cynkowej, która jest głównym miejscem interakcji tych dwóch białek, poprzez dodanie chelatora cynku, zmniejsza później kontrast mikrowzorów LCK.

Podsumowując, głównymi zaletami techniki mikrowzorowania są: ilościowe określanie lokalnych, rozdzielczo przestrzennych oddziaływań białkowych. Ponadto metoda ta umożliwia wykrywanie słabych oddziaływań również w błonie plazmatycznej żywych komórek, wykrywanie modulowanych oddziaływań typu bait-prey, analizę stanu spoczynkowego oraz możliwość zastosowania podejścia w badaniach wysokoprzepustowych.