Name: Przygotowanie komórek Drosophila S2 do mikroskopii świetlnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj przygotowanie komórek Drosophila S2 do mikroskopii świetlnej. Metoda obejmuje powlekanie szkła lektyną, hodowlę, fiksację i immunobarwienie. Technika ta umożliwia badaczom wizualizację lokalizacji białek w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana przez National Cancer Institute P30 CA23074, American Cancer Society Institutional Research Grant 74-001-31 oraz Univ. of Arizona GI SPORE (NCI/NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W dziedzinie biologii komórki idealny system powinien być tani w utrzymaniu, łatwy w manipulacji i podatny na zastosowanie różnych technik. Komórki S2 Drosophila spełniają te wymagania, dlatego szybko stały się preferowanym systemem dla coraz większej liczby laboratoriów biologii komórki.
Przedstawiliśmy krótki przegląd metod przygotowania komórek S2 do mikroskopii. Wyjątkową zaletą komórek S2 jest fakt, że dobrze rosną w normalnej atmosferze i temperaturze pokojowej; dzięki temu mog...

<table><tbody><tr><td>Komórki S2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Komórki S2</td><td>DGRC</td><td>numer seryjny 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Komórki S2</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>podłoże bezsurowicze</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>podłoże bezsurowicze</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>podłoże bezsurowicze</td></tr><tr><td>Podłoże Schneider&amp;rsquo;s S2</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Dodać 10% (stężenie końcowe) inaktywowanego termicznie FBS, aby przygotować podłoże kompletne.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>100x roztwór antybiotyków</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>zawiera penicylinę (10000 U/mL),&lt;br/&gt;streptomycynę (10000 &amp;#x03BC;g/mL) oraz&lt;br/&gt;amfoterycynę B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Konkanawalina A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>roztwór 32%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>bezwodny, stopień czystości ACS</td></tr><tr><td>Sita molekularne</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>typ 3A</td></tr></tbody></table>

przygotowanie komórek s2 drosophila do mikroskopii świetlnej

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Idealny system eksperymentalny powinien być tani i łatwy w utrzymaniu, podatny na zastosowanie różnorodnych technik oraz wspierany przez obszerną literaturę i bazę danych sekwencji genomowych. Hodowane komórki Drosophila S2, będące produktem dysocjacji embrionów w wieku 20-24 godzin1, posiadają wszystkie te właściwości. W konsekwencji komórki S2 są niezwykle odpowiednie do analizy procesów komórkowych, w tym do odkrywania genów kodujących molekularne komponenty interesującego procesu lub mechanizmu. Cechami komórek S2, które w największym stopniu odpowiadają za ich użyteczność, są łatwość ich utrzymania, wyjątkowa wrażliwość na interferencję RNA (RNAi) opartą na dwuniciowym RNA (dsRNA) oraz podatność na badanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zarówno w formie komórek żywych, jak i utrwalonych.
Komórki S2 mogą być hodowane w różnych pożywkach, w tym w wielu niedrogich, dostępnych komercyjnie, w pełni zdefiniowanych pożywkach bezsurowiczych2. Ponadto rosną one optymalnie i szybko w temperaturze 21-24°C i mogą być hodowane w różnych naczyniach. W przeciwieństwie do komórek ssaków, komórki S2 nie wymagają regulowanej atmosfery; dobrze rosną w zwykłym powietrzu i mogą być nawet utrzymywane w szczelnie zamkniętych kolbach.
Uzupełnieniem łatwości stosowania RNAi w komórkach S2 jest możliwość sprawnej analizy indukowanych eksperymentalnie fenotypów za pomocą mikroskopii fazowej lub fluorescencyjnej utrwalonych lub żywych komórek. Komórki S2 rosną w hodowli jako pojedyncza warstwa, jednak nie wykazują hamowania kontaktowego. Zamiast tego, w gęstych hodowlach komórki mają tendencję do wzrostu w koloniach. Przy niskiej gęstości hodowle S2 hodowane na szkle lub plastiku traktowanym do hodowli tkankowej są okrągłe i słabo przytwierdzone. Niemniej jednak, cytologię komórek S2 można znacznie poprawić, indukując ich rozprzestrzenienie poprzez krótkotrwałą hodowlę na powierzchni pokrytej lektyną, konkanawaliną A (ConA)3. Komórki S2 mogą być również stabilnie transfekowane markerami znakowanymi fluorescencyjnie w celu oznakowania interesujących struktur lub organelli w żywych lub utrwalonych komórkach. Zatem typowy przebieg analizy mikroskopowej komórek wygląda następująco: najpierw komórki S2 (które mogą posiadać transgeny do ekspresji znaczników) są poddawane RNAi w celu eliminacji białka (białek) docelowych. Czas trwania zabiegu RNAi można dostosować do różnic w kinetyce wymiany białek oraz w celu zminimalizowania urazów i śmierci komórek, jeśli białko docelowe jest istotne dla ich żywotności. Następnie potraktowane komórki przenosi się do naczynia zawierającego szkiełko podstawowe pokryte wcześniej conA, aby zaindukować rozprzestrzenienie się komórek i ich silne przyleganie do szkła. Na koniec komórki obrazuje się wybranymi przez badacza trybami mikroskopii. Komórki S2 są szczególnie przydatne w badaniach wymagających długotrwałej wizualizacji żywych komórek, ponieważ zachowują one żywotność w temperaturze pokojowej i w normalnych warunkach atmosferycznych.

Drosophila Schneider (S2) są coraz popularniejszym systemem służącym do odkrywania i analizy funkcjonalnej genów. Naszym celem jest opisanie niektórych technik mikroskopowych, które sprawiają, że komórki S2 stają się tak istotnym systemem eksperymentalnym.

Przygotowanie komórek S2 Drosophila do mikroskopii świetlnej

Idealny układ eksperymentalny powinien być tani i łatwy w utrzymaniu, dostosowany do różnych technik oraz oparty na obszernym dorobku literatury...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opis przygotowania komórek Drosophila S2 do mikroskopii świetlnej. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie szalek hodowlanych z dna szklanego. Drugim krokiem procedury jest pokrycie szklanego dna lektyną Conval.A w celu promowania adhezji i spłaszczenia komórek S two. Trzecim krokiem procedury jest dodanie pożywki hodowlanej oraz komórek S two do naczynia hodowlanego. Końcowym etapem procedury jest utrwalenie i immunobarwienie komórek S two w naczyniu hodowlanym.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące lokalizację białek zainteresowania znakowanych fluoro-4 lub etykietowanych immunologicznie, odpowiednio poprzez mikroskopię fluorescencyjną żywych lub utrwalonych komórek S2. Cześć, jestem Joey Club z laboratorium Grega Rogersa w Katedrze Biologii Komórki i Anatomii na Uniwersytecie Arizony. Jestem John Nye, również z laboratorium Rogersa.A ja jestem Dan Buster, również z laboratorium Grega Rogersa. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przygotowania komórek Drosophila S2 do mikroskopii świetlnej.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania regulacji duplikacji centralnej u Drosophila poprzez analizę zmian w liczbie i struktu

preparation-of-drosophila-s2-cells-for-light-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie komórek Drosophila S2 do mikroskopii świetlnej

Przedstawiono prostą, niedrogą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy za pomocą obrazowania na żywo. Nasz protokół zapewnia wilgotność i wymianę gazową oraz nie powoduje kompresji embrionu Drosophila. Metoda ta jest odpowiednia do obrazowania na żywo embrionów Drosophila w oparciu o GFP z wykorzystaniem stereomikroskopu lub pionowego mikroskopu złożonego.

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Komórki S2 Drosophila i hodowane neurony są świetnymi systemami do obrazowania transportu organelli napędzanych motorycznie in vivo. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły hodowli obu typów komórek, ich obrazowania i analizy transportu.

Transport organelli w hodowanych komórkach Drosophila: linia komórkowa S2 i neurony pierwotne.

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Analiza SEM jest skuteczną metodą pomagającą w identyfikacji gatunków lub dyskryminacji fenotypowej. Protokół ten opisuje metody badania określonych szczegółów morfologicznych trzech reprezentatywnych typów organizmów i miałby szerokie zastosowanie do badania cech wielu typów organizmów i tkanek.

Otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Poznaj przygotowanie komórek Drosophila S2 do mikroskopii świetlnej. Metoda obejmuje powlekanie szkła lektyną, hodowlę, fiksację i immunobarwienie. Technika ta umożliwia badaczom wizualizację lokalizacji białek w komórkach.

Przygotowanie komórek S2 Drosophila do mikroskopii świetlnej

Przeglądaj więcej filmów