Name: MISJA esiRNA do badań przesiewowych RNAi w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Poznaj metodologię badań przesiewowych esiRNA w komórkach ssaków w celu identyfikacji genów zaangażowanych w podział komórkowy. Technika ta umożliwia systematyczne badanie funkcji genów z wysoką specyficznością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować członkom laboratorium Buchholza oraz zespołowi RNAi z firmy Sigma-Aldrich za dyskusje. Dziękujemy Towarzystwu Maxa Plancka oraz Ministerstwu Federalnemu Edukacji i Badań (Bundesministerium für Bildung und Forschung) za wsparcie w ramach grantów Go-Bio [0315105].
MISSION ® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Sigma-Aldrich Biotechnology L.P.

1. Wysokiej jakości biblioteki MISSION esiRNA
<ol>
	<li>Dla każdego genu zainteresowania wybierany jest najbardziej podatny i specyficzny region docelowy dla RNAi z wykorzystaniem algorytmu DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html).4 DEQOR ocenia potencjał wyciszania wszystkich możliwych siRNA o długości 21 nukleotydów w docelowym mRNA w oparciu o najnowocześniejsze kryteria projektowe4. Dodatkowo każda potencjalna cząsteczka siRNA jest analizowana pod kątem możliwej reaktywności krzyżowej z innymi genami poprzez przeprowadzenie wyszukiwania BLAST w transkryptomie badanego organizmu. Program zapewnia tym samym analizę ogólnej jakości i zdolności do wyciszania krzyżowego potencjalnych esiRNA (o długości 300-600 bp).</li>
	<li>Wybrany region cDNA genu docelowego jest amplifikowany metodą PCR przy użyciu specyficznych dla genu starterów flankowanych sekwencjami promotora polimerazy RNA bakteriofaga.</li>
	<li>Każdy produkt PCR wykorzystany do produkcji MISSION esiRNA jest weryfikowany pod kątem tożsamości poprzez sekwencjonowanie oraz pod kątem czystości za pomocą analizy Caliper Labchip.</li>
	<li>Długie dwuniciowe RNA jest transkrybowane z produktu PCR przez polimerazę RNA, a następnie następuje hybrydyzacja transkrybowanych nici.</li>
	<li>esiRNA są przygotowywane poprzez ograniczone trawienie enzymatyczne długiego dwuniciowego RNA za pomocą RNaseIII, a następnie oczyszczane metodą chromatografii wymiany anionowej z wykorzystaniem kolumn spinowych Q-sepharose.</li>
	<li>esiRNA są wytrącane i resuspenderowane w buforze TE. Wydajność jest mierzona za pomocą pomiarów absorbancji UV, a stężenie jest korygowane poprzez rozpuszczenie w odpowiedniej objętości buforu TE. Ogólna jakość produktu końcowego jest sprawdzana za pomocą analizy Caliper Labchip.</li>
</ol>
2. Wybór linii komórkowej i optymalizacja transfekcji do badań przesiewowych
<ol>
	<li>Przeprowadzić miareczkowanie ilości esiRNA (stosując Eg5 jako kontrolę pozytywną oraz lucyferazę renilli jako kontrolę negatywną) oraz zwiększających się ilości odczynnika do transfekcji na płytce 384-dołkowej, dodać komórki i inkubować przez 48 godzin. Eg5 jest białkiem motorowym z rodziny kinezyn, niezbędnym do montażu dwubiegunowego wrzeciona podziałowego, a jego wyczerpanie prowadzi do zatrzymania mitozy. Powtórzyć tę procedurę dla różnych odczynników do transfekcji i linii komórkowych. W niniejszym protokole zastosowano komórki HeLa hodowane zgodnie ze standardowymi procedurami oraz oligofectamine (Invitrogen) jako odczynnik do transfekcji.</li>
	<li>W celu wyboru optymalnych warunków transfekcji, za pomocą mikroskopii świetlnej policzyć komórki transfekowane esiRNA przeciwko Eg5 wykazujące zatrzymanie mitozy (okrągły kształt) oraz całkowitą liczbę komórek transfekowanych esiRNA przeciwko lucyferazie renilli (RLUC). Wybrać warunki charakteryzujące się najniższą toksycznością dla RLUC i najbardziej wyraźnym fenotypem dla Eg5. Alternatywna metoda optymalizacji warunków transfekcji wykorzystuje stabilną linię komórkową wykazującą ekspresję EGFP (lub innego odpowiedniego genu reporterowego) pod kontrolą konstytutywnego promotora aktywnego. Po transfekcji esiRNA przeciwko EGFP (lub innemu genowi reporterowemu) oraz RLUC (lub innego odpowiedniego esiRNA kontroli negatywnej), zmierzyć wydajność wyciszania (knock-down) oraz toksyczność, np. za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Należy upewnić się, że zastosowane esiRNA dla EGFP jest w pełni komplementarne do docelowego mRNA.</li>
</ol>
3. Przygotowanie przesiewania pierwotnego5,6
<ol>
	<li>Zoptymalizuj dokładność pipetowania dla wszystkich użytych komponentów na zautomatyzowanej stacji pipetującej (np. Aquarius, Tecan i WellMate, Matrix). Ponieważ parametry pipetowania zmieniają się w zależności od rodzaju roztworu, objętości i typu płytki, optymalizację tę należy powtórzyć oddzielnie dla każdego etapu. Jeśli to możliwe, stację pipetującą należy umieścić pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji. Wszystkie użyte komponenty powinny zostać zdezynfekowane przed użyciem poprzez autoklawowanie, jeśli jest to możliwe, lub spryskanie 75% etanolem. Zoptymalizuj protokoły płukania tak, aby wykluczyć kontaminację krzyżową między dołkami. Szczegółowe informacje dotyczące optymalizacji automatycznego pipetowania nie mogą zostać podane ze względu na ograniczenia miejsca i zależą w dużej mierze od wykorzystywanej stacji pipetującej. W celu uzyskania dalszych informacji należy zapoznać się z protokołem producenta.</li>
	<li>Przeprowadź transfekcję komórek w formacie 384-dołkowym, stosując zoptymalizowane warunki opisane powyżej, z użyciem esiRNA dla Eg5 oraz RLUC. Zastosuj naprzemienny wzór dla esiRNA Eg5 i RLUC, obejmujący całą płytkę.</li>
	<li>Po 48-godzinnej inkubacji utrwal komórki zimnym 100% etanolem, rehydratuj w PBS przez 15 minut, a następnie barw przez 25 minut w PBS zawierającym 1 μg/ml DAPI i 100 μg/ml RNazy A (Qiagen). Na koniec przepłucz PBS i przechowuj w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Zmierz intensywność fluorescencji DAPI za pomocą mikroskopii, np. w systemie Olympus ScanR. Wygeneruj histogram, nanosząc intensywność DAPI względem liczby komórek, i oceń rozkład cyklu komórkowego, obliczając procent komórek o zawartości DNA 2N dla fazy G1; &lt; 2N &gt; 4N dla fazy S; 4N dla fazy G2/M oraz &gt; 4N dla aneuploidii/poliploidii.</li>
	<li>Oceń homogeniczność wyników na całej płytce. Jeśli wyniki różnią się znacząco, konieczna jest dalsza optymalizacja w celu wykluczenia efektów pozycyjnych. Częstym problemem przy stosowaniu płytek wielodołkowych jest zwiększone parowanie w dołkach brzeżnych podczas czasu inkubacji. Prowadzi to do powstania różnych warunków eksperymentalnych w różnych dołkach, co często przekłada się na efekty specyficzne dla pozycji na płytce. Z tego powodu w przypadku screeningu zalecamy pozostawienie wszystkich dołków brzeżnych pustymi. Aby dodatkowo zminimalizować parowanie, należy upewnić się, że w inkubatorach utrzymywana jest wysoka wilgotność. Rutynowo stosujemy również bariery przeciwwparowe, takie jak przepuszczalna taśma uszczelniająca Corning (Corning Breathable Sealing Tape), która blokuje parowanie. Należy również wziąć pod uwagę inne źródła efektów pozycyjnych, np. zmienność techniczną systemu odczytu (mikroskop, czytnik płytek itp.) lub zmienność w obsłudze cieczy (gradienty, niejednorodność roztworów itp.).</li>
	<li>Różnice statystyczne między kontrolami pozytywnymi i negatywnymi stanowią miarę istotności zastosowanego testu. Przed rozpoczęciem właściwego screeningu należy ustanowić dużą różnicę między kontrolą negatywną (lub szumem tła; kontrolą mock) a próbką. Dobrą miarą istotności statystycznej jest czynnik Z (Z-factor). Czynnik Z oblicza się zgodnie z równaniem: 
 Z = 1- (3 SD[próbka] + 3 SD[mock]) * (|Av[próbka] - Av[mock]|)-1; gdzie SD: odchylenie standardowe; Av: średnia. Wartość czynnika Z w zakresie 1 &gt; Z &gt; 0,5 wskazuje na statystycznie istotne oddzielenie kontroli negatywnych (i szumu) od kontroli pozytywnych7.</li>
</ol>
4. Przesiewanie pierwotne
<ol>
	<li>Przygotować płytki hodowlane z 384 dołkami do transfekcji esiRNA, wykorzystując zoptymalizowane warunki opisane powyżej. W tym przypadku stosuje się 15ng esiRNA na dołek, rozpuszczone w 5μl buforu TE. Co najmniej osiem pozycji kontrolnych na płytce należy wypełnić odpowiednimi kontrolami pozytywnymi i negatywnymi dla badanego procesu biologicznego (tutaj: Eg5 i RLUC). Aby uniknąć efektów brzeżnych, dołki krawędziowe wypełnia się wyłącznie 5μl buforu TE.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 5μl OptiMEM (Invitrogen) zawierającego 0,2μl Oligofectamine, wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórkową do mieszaniny transfekcyjnej (tutaj: 40μl zawiesiny komórek HeLa o stężeniu 25 komórek/μl; co odpowiada 1000 komórek na dołek) i inkubować przez 72 godziny.</li>
	<li>Zmierzyć zawartość DNA za pomocą mikroskopu automatycznego (Olympus ScanR, patrz wyżej). Ocenić wyniki za pomocą statystyki Z-score w celu wyłonienia trafień (hitów): wartości Z-score oblicza się dla wszystkich badanych esiRNA, przyjmując sygnał z kontroli negatywnej jako punkt odniesienia. Należy zauważyć, że Z-score nie jest tym samym, co Z-factor. Z-score stanowi statystyczną miarę istotności wartości próbek w porównaniu z kontrolą (mock). Oblicza się go zgodnie z równaniem: 
 Z = (value[Sample] - average[mock]) * standard-deviation[mock]-1. 
 Do wyłonienia trafień należy zastosować próg odcięcia. Typowo stosuje się kryterium istotności takie jak: 2 &lt; Z &lt; -2, jednak w zależności od jakości zbioru danych, badanego procesu biologicznego lub po prostu zakresu przesiewu, mogą być stosowane różne progi. Oprócz dość prostej statystyki Z-score można stosować również bardziej rozbudowane metody oceny matematycznej (wstęp do szerokiej dziedziny statystycznej oceny danych z przesiewów można znaleźć w pracy Malo et al.8).</li>
</ol>
5. Przesiew sekundarny i walidacja trafień
<ol>
	<li>Po przesiewaniu pierwotnym przeprowadza się przesiewanie wtórne, aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie wynikające z błędów eksperymentalnych lub efektów pozacelowych. W przypadku wybranych trafień należy powtórzyć tę samą procedurę, która była stosowana w przesiewaniu pierwotnym, zwiększając liczbę powtórzeń (3-5), co pozwoli na lepszą ocenę statystyczną.</li>
	<li>W przypadku zweryfikowanych trafień należy zastosować wtórne, niezakładające się esiRNA (lub inny niezakładający się wyzwalacz wyciszania) przeciwko celom zidentyfikowanym w przesiewaniach wstępnych. Należy zastosować ten sam test i sposób odczytu wyników, co w przesiewaniu pierwotnym.</li>
	<li>Ostatecznie wybrane geny można zwalidować za pomocą międzygatunkowego ratunku RNAi (cross-species RNAi rescue)9. W tym celu do komórek stabilnie transfekuje się bakteryjny sztuczny chromosom (BAC) kodujący np. ortolog genu mysiego. Konstrukcje BAC zachowują gen w jego kontekście genomicznym i umożliwiają ekspresję bliską fizjologicznej. RNAi przeciwko endogennemu ludzkiemu genowi nie zmieni ekspresji transgenu mysiego, co doprowadzi do odwrócenia (ratunku) fenotypu RNAi. Ratunek RNAi stanowi obecnie złoty standard weryfikacji fenotypów RNAi.</li>
	<li>Na koniec zwalidowane kandydaty bada się bardziej szczegółowo, aby ostatecznie uzyskać zrozumienie mechanistyczne. W wielu przypadkach w tych eksperymentach można wykorzystać RNAi, np. w wtórnych, bardziej rozbudowanych testach.</li>
</ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
<li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEQOR%3A+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li>
<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują relacje finansowe z podmiotami komercyjnymi, które mogą być zainteresowane przedłożoną pracą.

Interferencja RNA stała się standardową techniką badania fenotypów utraty funkcji. Wielkoskalowe kolekcje mediatorów RNAi są dostępne u różnych dostawców i stanowią łatwą, kosztowo efektywną oraz szybką metodę wyciszania genów. Otworzyło to drogę do systematycznego screeningu kluczowych czynników w wielu procesach biologicznych, umożliwiając spojrzenie w skali całego genomu na szeroki zakres różnych gatunków i typów komórek.
Wysokie wskaźniki wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych stanowią powszechny problem w badaniach przesiewowych RNAi. Aby rozwiązać ten problem, podjęto znaczne wysiłki w celu poprawy skuteczności, a w szczególności specyficzności czynników wyzwalających wyciszanie. Ważnym odkryciem było to, że pula różnych siRNA celujących w ten sam transkrypt znacznie zwiększa specyficzność względem celu. Ponieważ endoribonukleaza wytwarza bardzo złożoną pulę różnych siRNA, esiRNA są czynnikami wyzwalającymi o wysokiej specyficzności względem celu, co zmniejsza odsetek wyników fałszywie dodatnich w badaniach przesiewowych RNAi. Wykazano również, że esiRNA pozwalają na efektywne wyciszenie ekspresji genów (knockdown), co redukuje także wskaźnik wyników fałszywie ujemnych.
Ponieważ przesiewy RNAi są wymagające pod względem technicznym, ich rutynowe przeprowadzanie prawdopodobnie pozostanie przez pewien czas wyzwaniem. Jednakże, wraz z udoskonalaniem odczynników i aparatury oraz dzieleniem się doświadczeniem przez coraz więcej laboratoriów, przewiduje się, że zastosowanie przesiewów RNAi w nowoczesnej biologii wzrośnie w przyszłości.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Aby uzyskać dodatkowe informacje, prosimy o kontakt: rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przepuszczalna taśma uszczelniająca</td><td>Corning</td><td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Produkt nr 3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Etanol&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof (bezwodny), do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>BioReagent, koncentrat 10x, odpowiedni do hodowli komórkowych, do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&amp;#8242;,6-Diamidyno-2-fenyloindol dihydrochlorowodorek&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Proszek, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych, &amp;gt;98% (HPLC i TLC)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Do biologii molekularnej, &amp;#8805;70 jednostek Kunitza/mg białka, proszek liofilizowany</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Roztwór buforu Tris-EDTA&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100 x, do biologii molekularnej</td></tr></tbody></table>

mission esirna do przesiewania rnai w komórkach ssaków

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Interferencja RNA (RNAi) jest podstawowym mechanizmem komórkowym służącym do kontroli ekspresji genów. RNAi jest indukowana przez krótkie dwuniciowe cząsteczki RNA, znane również jako małe interferujące RNA (siRNA). Krótkie dwuniciowe RNA powstają z dłuższych dwuniciowych prekursorów w wyniku aktywności Dicera, białka z rodziny endonukleaz RNazy III. Powstałe fragmenty są komponentami kompleksu wyciszającego indukowanego przez RNA (RISC), który kierują one do komplementarnego docelowego mRNA. RISC przecina docelowe mRNA, redukując tym samym ekspresję kodowanego białka1,2,3. RNAi stała się potężną i powszechnie stosowaną metodą badawczą w studiach nad utratą funkcji genów w komórkach ssaków z wykorzystaniem małych interferujących RNA.
Obecnie dostępne są dwie główne metody produkcji małych interferujących RNA. Jedna z nich opiera się na syntezie chemicznej, natomiast metoda alternatywna wykorzystuje endonukleolityczne cięcie specyficznych dla celu długich dwuniciowych RNA przez RNazę III in vitro. W ten sposób powstaje zróżnicowana pula oligonukleotydów typu siRNA, znana również jako siRNA przygotowane przez endorybonukleazę lub esiRNA. Porównanie skuteczności siRNA pochodzenia chemicznego oraz esiRNA wykazuje, że oba te wyzwalacze są skuteczne w wyciszaniu genów docelowych. Różnice można jednak zauważyć przy porównaniu specyficzności. Wiele pojedynczych, syntetyzowanych chemicznie siRNA wywołuje wyraźne efekty poza celem (off-target), podczas gdy złożona mieszanina właściwa dla esiRNA prowadzi do bardziej specyficznego knockdownu10.
W niniejszym badaniu przedstawiamy projekt bibliotek esiRNA MISSION w skali całego genomu oraz ich zastosowanie w przesiewaniu RNAi, zilustrowane screeningiem zawartości DNA w celu identyfikacji genów zaangażowanych w progresję cyklu komórkowego. Pokazujemy, jak zoptymalizować protokół transfekcji oraz test w celu przeprowadzenia przesiewania wysokoprzepustowego. Demonstrujemy również, w jaki sposób można statystycznie ocenić duże zestawy danych, oraz przedstawiamy metody walidacji głównych wyników (primary hits). Na koniec wskazujemy potencjalne punkty wyjścia do dalszej charakterystyki funkcjonalnej zwalidowanych genów.

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę esiRNA w badaniu wysokoprzepustowym w celu identyfikacji genów zaangażowanych w podział komórki. Przedstawiamy sposób przygotowania i przeprowadzenia przesiewu esiRNA, a także metodę analizy i walidacji uzyskanych wyników.

MISSION esiRNA do przesiewania RNAi w komórkach ssaków

Interferencja RNA (RNAi) to podstawowy mechanizm komórkowy służący do kontroli ekspresji genów. RNAi jest indukowana przez krótkie dwuniciowe cząsteczki RNA, znane również jako ...

Przesiewowe poszukiwanie genów powiązanych z cyklem komórkowym za pomocą siRNA rozpoczyna się od wyboru odpowiedniej technologii knockdownu. Biblioteki siRNA firmy Sigma Aldridge wykorzystują wysoką wydajność i specyficzność syntetycznych siRNA. Biblioteki siRNA to złożone pule pojedynczych siRNA, otrzymywane poprzez enzymatyczne trawienie długich dwuniciowych cząsteczek RNA komplementarnych do docelowego mRNA. Łączenie w pule siRNA nakierowanych na ten sam transkrypcję zwiększa specyficzność i pozwala uniknąć żmudnego poszukiwania wydajnych i specyficznych pojedynczych siRNA.Dzięki temu RNA łatwo dostępny jest szczególnie odpowiedni do przesiewów utraty funkcji na dużą i średnią skalę. Przedstawiamy tutaj kroki niezbędne do przeprowadzenia zakrojonego na szeroką skalę przesiewu RNA, począwszy od konfiguracji wysokoprzepustowej transfekcji, aż po opracowanie odpowiedniego testu. Zostało to zilustrowane poprzez przygotowanie przesiewu genów zaangażowanych w progresję cyklu komórkowego ssaków.W pierwszej kolejności przedstawiamy zoptymalizowaną metodę transfekcji komórek wnęki, a następnie przeprowadzamy statystyczną ocenę jakości testu. Na koniec wykonano przesiew na skalę całego genomu, mierząc rozkład cyklu komórkowego po wyciszeniu genu docelowego. Wyniki dodatnie wyselekcjonowano za pomocą statystyki zco i zweryfikowano przy użyciu wtórnych, niezależnych łatwo dostępnych RNA.Ponadto opisujemy potencjalne procedury eksperymentalne, które mogą zostać wykorzystane do kontynuacji przesiewu RNA w oku. Cześć, jestem Ty z Instytutu Biologii Komórkowej i Genetyki Molekularnej im. Maxa Plancka. A ja Tristan.Jestem Frank Al, również z Instytutu Maxa Plancka w Dreźnie. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przygotowania przesiewu utraty funkcji w komórkach ssaków z wykorzystaniem zestawu Mission Easy RNAi firmy Sigma Aldridge. Jako przykład posłuży nam test pomiaru rozkładu cyklu komórkowego w populacji hodowlanych komórek tkankowych, aby zademonstrować, w jaki sposób za pomocą przesiewu RNAi można powiązać geny z procesami biologicznymi.Zacznijmy zatem. Każdy projekt przesiewowy RNAi rozpoczyna się od wyboru wyzwalaczy wyciszania; stosowane siRNAs przygotowane przez endonukleazę RNA, lub w skrócie esiRNAs, są generowane poprzez ograniczoną trawienie enzymatyczne długich dwuniciowych RNA przy użyciu RNase III. Tożsamość każdego esiRNA jest weryfikowana poprzez sekwencjonowanie, a czystość za pomocą analizy Caliper LabChip.Łączenie poszczególnych siRNAs celujących w ten sam transkrypt zwiększa swoistość, ponieważ każdy siRNA w puli ma ten sam cel główny, podczas gdy efekty poza-celowe ulegają rozcieńczeniu. Dzięki temu easy RNAs wykazują dobrą skuteczność wyciszania i wysoką swoistość wobec celu, unikając efektów poza-celowych. Easy w skali genomu.Biblioteki RNA są dostarczane przez firmę Sigma Aldrich. W płytkach 384-dołkowych dołki brzegowe pozostają puste. Dodatkowo, osiem pozycji w centrum płytki zostaje pozostawionych pustych na potrzeby kontroli.Podbiblioteki easy RNA są dostarczane w płytkach 96-dołkowych z zajętymi wszystkimi dołkami; klienci mogą zdecydować o sposobie rozmieszczenia easy RNA w tych płytkach. Pojedyncze easy RNA są dostarczane w osobnych probówkach. Transfekcja easy RNA wymaga optymalizacji dla różnych odczynników do transfekcji i linii komórkowych.Tutaj wykorzystujemy nasze komórki hodowane zgodnie ze standardowymi procedurami, a jako odczynnik do transfekcji stosujemy oligo. W ramach kontroli pozytywnej używamy białka motorowego kinezyny EEG five E-Z-R-N-A-A, niezbędnego do montażu wrzeciona dwubiegunowego, natomiast jako kontroli negatywnej używamy ran luciferase easy RNA. Na płytce 384-dołkowej mianujemy różne ilości easy RNA, na przykład od 1 ng do 56 ng z przyrostem 5 ng oraz zwiększające się ilości odczynnika do transfekcji od 0,1 µL do 0,9 µL z przyrostem 0,05 µL.Po wymieszaniu RNA z odczynnikiem do transfekcji dodać komórki i inkubować przez 48 godzin. Po zakończeniu okresu inkubacji sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym. Policzyć komórki przetransfekowane eeg.Pięć łatwych RNA wykazujących okrągły kształt charakterystyczny dla mitozy. Należy również policzyć całkowitą liczbę komórek transfekowanych kontrolą negatywną. Gran vanilla lucyferaza easy RNA.Optymalne warunki transfekcji wykazują najmniejszą toksyczność dla lucyferazy waniliowej oraz najbardziej wyraźny fenotyp dla EEG five. Po zoptymalizowaniu parametrów transfekcji można przystąpić do przygotowania i przeprowadzenia przesiewu pierwotnego. Automatyczne stacje pipetujące, takie jak Matrix Wellm Mate lub Tecan Aquarius, wykorzystywane do przygotowania przesiewów pierwotnych, powinny być umieszczone w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji.Wszystkie użyte komponenty należy zdezynfekować przed użyciem, albo poprzez autoklawowanie, jeśli jest to możliwe, albo poprzez spryskanie 75% etanolem przed przeprowadzeniem przesiewu. Instrumenty te powinny zostać zoptymalizowane zgodnie z protokołami producenta. Należy zoptymalizować dokładność pipetowania dla wszystkich użytych komponentów na zautomatyzowanej stacji pipetującej, ponieważ parametry pipetowania zmieniają się w zależności od rodzaju, objętości roztworu i typu płytki.Tę optymalizację należy powtórzyć oddzielnie dla każdego etapu. Ponadto należy zoptymalizować protokoły płukania, aby wykluczyć kontaminację krzyżową między dołkami po przygotowaniu zautomatyzowanych stacji pipetujących. Przeprowadź transfekcję komórek w formacie 384-dołkowym, stosując wcześniej określone optymalne warunki, aby upewnić się, że nie występują efekty położenia.Użyj easy RNAs dla EEG five oraz waniliowej lucyferazy, stosując naprzemienny wzór obejmujący całą płytkę. Pozostaw wszystkie studzienki brzegowe puste, ponieważ częstym problemem przy stosowaniu płytek wielodołkowych jest zwiększone parowanie w studzienkach brzegowych podczas inkubacji. Prowadzi to do różnych warunków eksperymentalnych w poszczególnych studzienkach, co często przekłada się na tzw. efekt położenia na płytce; aby dodatkowo zminimalizować parowanie, zastosuj bariery przeciwparowaniowe, takie jak przepuszczalna taśma uszczelniająca firmy Corning.Należy również upewnić się, że w inkubatorach utrzymywana jest wysoka wilgotność. Należy jednak pamiętać o możliwych źródłach efektów pozycyjnych, takich jak zmienność w dozowaniu cieczy lub w systemie odczytu, na przykład w czytniku płytek. Po 48-godzinnej inkubacji utrwalić komórki lodowatym, 100% etanolem przez dwie godziny, a następnie rehydratować w PBS przez 15 minut.Barwić utrwalone komórki przez 25 minut w PBS zawierającym 1 µg/mL DPI oraz 100 µg/mL RNase. Następnie przemyć trzykrotnie PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C. W kolejnym kroku zmierzyć intensywność fluorescencji DPI za pomocą mikroskopii.W każdym przypadku zastosowano system skanera Olympus. Przeanalizujemy komórki i określimy względną intensywność DPI. Na podstawie histogramu wygenerujemy wykres, przedstawiając intensywność DPI w funkcji liczby komórek.Oceń rozkład cyklu komórkowego, obliczając procent komórek o zawartości DNA równej 2N dla fazy G1/G0, pomiędzy 2N a 4N dla fazy S, równej 4N dla fazy G2/M oraz większej niż 4N dla aneuploidii lub poliploidii. Aby ocenić homogeniczność wyników na płytce, porównaj rozkład cyklu komórkowego pomiędzy poszczególnymi studzienkami, analizując procent komórek w fazie G2/M dla prób EEG5 oraz transfekcji lucyferazą; jeśli wyniki różnią się znacząco w obrębie płytki, wymagana jest dalsza optymalizacja w celu wyeliminowania efektów położenia. Po uzyskaniu satysfakcjonującej spójności wyników, oblicz różnice statystyczne pomiędzy kontrolą pozytywną a negatywną.Użyj przedstawionego tutaj równania współczynnika Z, aby określić istotność statystyczną wyników. SD oznacza odchylenie standardowe, a AV oznacza średnią. Wartość współczynnika Z między 1 a 0,5 wskazuje na statystycznie istotne oddzielenie kontroli negatywnych i szumu od kontroli pozytywnych.Jeśli ustalono taką różnicę statystyczną, można przejść do przesiewania pierwotnego. Przygotować płytki do hodowli tkankowej z 384 dołkami do transfekcji easy RNA, wykorzystując określone wcześniej zoptymalizowane warunki.15 nanogramów easy RNA na dołek rozpuszcza się w pięciu mikrolitrach buforu TE. Co najmniej osiem pozycji kontrolnych na płytkę wypełnia się odpowiednimi kontrolami pozytywnymi i negatywnymi dla badanego procesu biologicznego: EEG five oraz ranil luciferase.W celu uniknięcia efektów brzegowych stosuje się tzw. Easy RNAs. Studzienki brzegowe wypełnia się jedynie 5 µL buforu TE. Następnie do każdej studzienki dodaje się 5 µL medium Opti-MEM zawierającego 0,2 µL mieszaniny oligosów i inkubuje przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po wymieszaniu RNA z odczynnikiem do transfekcji, dodać tutaj zawiesinę komórkową. Dodaje się 40 µL zawiesiny komórek He R w stężeniu 25 komórek na µL, co odpowiada 1000 komórkom na studzienkę; inkubować przez 72 godziny. Po 72-godzinnej inkubacji.Zmierz zawartość DNA za pomocą mikroskopu automatycznego, takiego jak Olympus scan R, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Powtórz tę procedurę dla wszystkich płytek biblioteki w celu wyłonienia hitów. Oceń wartości zawartości DNA, stosując statystykę Z-score.Należy zauważyć, że wynik Z (Z-score) nie jest tym samym, co współczynnik Z (Z factor). Stanowi on miarę statystyczną istotności wartości próbki w porównaniu do kontroli negatywnej lub pozorowanej (mock). Jest on obliczany zgodnie z przedstawionym tutaj równaniem.Oblicz zco dla wszystkich próbek RNA easy, wykorzystując sygnał dla negatywnej kontroli lucyferazy waniliowej jako punkt odniesienia do wyboru hitów. Należy zastosować próg odcięcia. Typowo jako kryterium istotności przyjmuje się wartość Z większą niż dwa lub mniejszą niż minus dwa. Jednak w zależności od badanego procesu biologicznego lub zakresu przesiewu można zastosować inne progi.Do wyboru trafień można wykorzystać również bardziej złożone metody oceny matematycznej, takie jak Q. Następnie wybrane trafienia poddawane są przesiewowi wtórnemu i walidacji HIIT. Po przesiewie pierwotnym następuje przesiew wtórny wybranych genów HIIT, aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie wynikające z wariancji eksperymentalnej.W pierwszej kolejności należy zweryfikować wybrane trafienia, stosując tę samą procedurę co w badaniu przesiewowym podstawowym, z wyjątkiem zastosowania większej liczby powtórzeń (od trzech do pięciu) w celu umożliwienia dokładniejszej oceny statystycznej. W przypadku zweryfikowanych trafień należy zastosować ten sam test i odczyt co w badaniu przesiewowym podstawowym, ale z wykorzystaniem drugiego, niepokrywającego się easy RNA lub innego niepokrywającego się wyzwalacza wyciszania, takiego jak chemicznie syntetyzowane si. RNA. Ostatecznie należy zwalidować wybrane geny metodą międzygatunkową.Ratowanie fenotypu RNAi (RNAi rescue) stanowi obecnie złoty standard weryfikacji fenotypów indukowanych przez RNAi. W skrócie, do komórek stabilnie transfektuje się bakteryjny sztuczny chromosom (BAC) kodujący ortolog wybranego genu z innego gatunku. Konstrukcje BAC zachowują gen w jego kontekście genomicznym, co umożliwia ekspresję zbliżoną do fizjologicznej.RNAi skierowane przeciwko genowi endogennemu nie wpłynie na ekspresję transgenu ortologicznego, co zniesie fenotyp wywołany przez RNAi. Ostatecznie zwalidowane kandydaty zostały poddane bardziej szczegółowym badaniom w celu uzyskania wglądu w mechanizmy ich działania. W wielu przypadkach RNAi może być wykorzystywane również w tych wtórnych, bardziej rozbudowanych analizach.Na przykład mikroskopia poklatkowa fenotypów RNAi. Poniżej przedstawiono przykład przesiewu cyklu komórkowego, w którym zmierzono zawartość DNA w komórkach HeLa po wyciszeniu ponad 16 000 genów z ludzkiego genomu. Zidentyfikowano 1 351 głównych trafień niezbędnych do podziału komórek.W badaniu wtórnym zweryfikowano 743 trafienia za pomocą niezależnego, wtórnego wyzwalacza RNA w ramach dodatkowego testu. Wyciszenia prowadzące do zatrzymania cyklu w fazie G2 oddzielono od wyciszeń skutkujących zatrzymaniem w fazie mitozy. Na koniec, w celu potwierdzenia roli genu Lin 54 w prawidłowym podziale komórki, przeprowadzono międzygatunkowy eksperyment ratunkowy z wykorzystaniem RNAi.Dalsze eksperymenty wykazały, że uszczuplenie poziomu Lin 54 zmieniło ekspresję wielu genów cyklu komórkowego. Przedstawiliśmy właśnie sposób przygotowania wysokoprzepustowej transfekcji mission easyRNAs oraz analizy rozkładu cyklu komórkowego w ludzkiej linii komórkowej hodowlanej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że warunki transfekcji i testy muszą być optymalizowane oddzielnie dla każdego systemu komórkowego i każdego procesu biologicznego.Zaleca się stosowanie zautomatyzowanych systemów dozowania cieczy, choć nie są one niezbędne, zwłaszcza w przypadku przesiewów na małą skalę. Możliwa jest również obsługa manualna. To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

MISSION esiRNA do selektywnego wyciszania genów w komórkach ssaków

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę pulową LentiPlex oraz tradycyjne metody sekwencjonowania w celu identyfikacji genów docelowych sprzyjających przeżyciu komórek. Przedstawiamy sposób przygotowania i dekonwolucji screeningu LentiPlex oraz walidacji uzyskanych wyników.

Przesiewanie biblioteki połączonej shRNA MISSION LentiPlex w komórkach ssaków

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Tutaj opisujemy metodologię przeprowadzania ukierunkowanego badania przesiewowego "ubikwitom" siRNA w celu zidentyfikowania nowych regulatorów ubikwityny i podobnych do ubikwityny odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie, w której pośredniczy HIF1A. Można to dostosować do dowolnej ścieżki biologicznej, gdzie dostępny jest solidny odczyt aktywności reporterowej.

Badania przesiewowe siRNA w celu identyfikacji ubikwityny i regulatorów systemów podobnych do ubikwityny szlaków biologicznych w hodowanych komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

SINEUPs to syntetyczne, antysensowne, niekodujące RNA, które zawierają domenę wiążącą (BD) i domenę efektorową (ED) oraz regulują w górę translację docelowego mRNA. W tym miejscu opisujemy metody wykrywania SINEUP w hodowanych liniach komórkowych, analizę ich aktywności promującej translację za pomocą Western-blot oraz półautomatyczny system obrazowania o wysokiej przepustowości.

Testy komórkowe niekodujących RNA SINEUP, które mogą specyficznie poprawić translację mRNA

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Poznaj metodologię badań przesiewowych esiRNA w komórkach ssaków w celu identyfikacji genów zaangażowanych w podział komórkowy. Technika ta umożliwia systematyczne badanie funkcji genów z wysoką specyficznością.

MISSION esiRNA do przesiewania RNAi w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów