Drosophila Rozwarstwienie męskiego gruczołu dodatkowego: metoda izolowania komórek wtórnych

- Pod mikroskopem preparacyjnym i w pożywkach z surowicą uzupełnioną usuńmy układ rozrodczy z każdej muchy za pomocą kleszczy. Najpierw usuń części przewodu pokarmowego, które mogły towarzyszyć układowi rozrodczemu. Aby odizolować gruczoły dodatkowe i przewód ejakulacyjny, usuń jądra, bańkę wytryskową i terminale. Myj chusteczkę przez jedną do dwóch minut w PBS, aby usunąć surowicę. Następnie przenieś go do roztworu dysocjacyjnego.

Aby wystawić komórki wewnątrz gruczołów na działanie roztworu dysocjacyjnego, przytrzymaj środek każdego gruczołu kleszczami i przetnij gruczoł parą ostrych kleszczyków. Usuń proksymalną część gruczołu i przewód wytryskowy, aby pozostawić dystalny koniec gruczołów zawierających rzadką populację komórek wtórnych odpowiedzialnych za wydzielanie białek biorących udział w kojarzeniu. Na koniec przenieś końcówki dławika pomocniczego do probówki z mikrowirówką, przygotowując się do trawienia. W poniższym protokole przeanalizujemy gruczoły pomocnicze, aby wyizolować komórki wtórne do analizy transkryptomu.

- Przed rozpoczęciem zabiegu przeciąć i wypalić okrągłe, szerokie końcówki o pojemności 200 mikrolitrów do obsługi gruczołów i przeciągnąć otwór końcówki wielu końcówek o pojemności 1000 mikrolitrów w pobliżu płomienia na mniej niż jedną sekundę, aby zwęzić otwory. Następnie posortuj zmodyfikowane końcówki od węższych do szerszych w zależności od ich szybkości aspiracji. W celu dodatkowego wypreparowania gruczołów umieść od 20 do 25 samców Drosophila w szklanym naczyniu na lodzie i użyj kleszczy i mikroskopu preparacyjnego, aby usunąć układ rozrodczy jednego samca muchy.

Usunąć parę gruczołów dodatkowych ze wszystkich innych tkanek, w tym jąder i bańki wytrysku, i przenieść gruczoły dodatkowe na szklaną płytkę zawierającą pożywkę uzupełnioną surowicą w temperaturze pokojowej. Po zebraniu 20 par gruczołów dodatkowych umyj gruczoły w naczyniu z PBS przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec płukania przenieś gruczoły do świeżo przygotowanego roztworu dysocjacyjnego i użyj ostrych kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym, aby mocno uszczypnąć środek płata gruczołowego.

Za pomocą drugiej pary kleszczy przetnij tkankę ostrą końcówką, aby oddzielić proksymalny obszar gruczołu dodatkowego i przewodu wytryskowego od części gruczołu zawierającej komórki wtórne. Następnie użyj wstępnie zwilżonej płomienia, zaokrąglonej, szerokiej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby przenieść gruczoły do rurki o pojemności 1,5 mililitra.