Dlaczego analiza krzywej przeżywalności jest istotna dla walidacji szlaków endokrynnych?

Krzywe przeżywalności ilościowo określają reakcje organizmów na ekspozycję chemiczną, umożliwiając wykrycie efektów modulujących długość życia, które odzwierciedlają zaburzenia szlaków endokrynnych. Zapewnia to funkcjonalny odczyt pozwalający na priorytetyzację celów do dalszych badań mechanistycznych.

W jaki sposób izolacja kohorty poprawia spójność potoku odkryć?

Synchronizacja wykluwania się much poprzez kontrolowane składanie jaj oraz usuwanie osobników dorosłych minimalizuje zmienność rozwojową, zapewniając, że obserwowane różnice w długości życia wynikają z warunków eksperymentalnych, a nie z heterogeniczności wieku. Zwiększa to powtarzalność testów w ramach kampanii przesiewowych.

Co umożliwia ilościowe porównanie grup narażonych na działanie substancji chemicznych?

Rejestrowanie martwych much w regularnych odstępach czasu pozwala na obliczenie procentów przeżywalności, które są naniesione na wykres w celu wygenerowania średnich krzywych przeżywalności dla każdego stanu. Krzywe te umożliwiają statystyczne porównanie mediany długości życia oraz współczynników śmiertelności.

Dlaczego powtórzenia eksperymentalne są niezbędne dla współpracy międzyfunkcyjnej?

Przeprowadzenie co najmniej trzech powtórzeń eksperymentu zapewnia, że trendy przeżywalności są wiarygodne i nie wynikają z przypadkowej zmienności, co daje zespołom toksykologicznym pewność przy udostępnianiu danych grupom patomorfologicznym i organom regulacyjnym. Replikacja wspiera uzgodnienie profili bezpieczeństwa związków.

Jakie wyniki statystyczne są wymagane przed przeprowadzeniem screeningu długości życia?

Generowanie krzywej przeżywalności wymaga obliczenia średnich procentów przeżywalności w powtórzeniach, co umożliwia przeprowadzenie testów statystycznych, takich jak analiza log-rank, w celu określenia istotnych różnic między grupą kontrolną a grupami badanymi. Dostarcza to informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnej ocenie bezpieczeństwa.

Protokół długości życia dla Drosophila melanogaster: generowanie krzywych przeżycia w celu identyfikacji różnic w długości życia much

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologia

0 wyświetleń • 3:28 min • April 30th, 2023

- Zacznij od wspólnego zakwaterowania określonej liczby samców i samic muszek owocowych Drosophila melanogaster w fiolce zawierającej podłoże z mąki kukurydzianej. Pozwala to na stałe zagęszczenie potomstwa.

Pozwól samicom much złożyć jaja. Następnie usuń dorosłe muchy. Jaja staną się larwami, poczwarkami, a w końcu dorosłymi muchami w ciągu 10 dni. Nowe muchy pojawiające się wcześniej niż ich kohorta powinny zostać usunięte przed 9 dniem. Podziel teraz zsynchronizowane muchy na grupy dla warunków kontrolnych i eksperymentalnych. Cohousing samców i samic much umożliwia krycie, usuwając zmienną, która wpływa na długość życia.

Po kilku dniach podziel muchy według płci na grupy. Umieść równą liczbę much w odpowiednich warunkach doświadczalnych. Co trzy dni przenieś żywe muchy do nowej fiolki i zapisz liczbę martwych much. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie muchy umrą.

Po co najmniej trzech powtórzonych eksperymentach wykreśl średni odsetek muszek, które przeżyły w ciągu dnia, aby wygenerować średnie krzywe przeżycia dla każdego stanu. W tym przykładzie zobaczymy, jak wygenerować krzywe przeżycia dla kohort leczonych substancjami chemicznymi zaburzającymi funkcjonowanie układu hormonalnego.

- W protokole długości życia najpierw ustaw 20 fiolek z ośmioma samicami i czterema mężczyznami, z których każda jest wypełniona 10 mililitrami mąki kukurydzianej i umieść je w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po czterech dniach należy wyrzucić muchy i umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze. Późnym popołudniem dnia 9 należy usunąć wszystkie nowo pojawiające się muchy z fiolek i umieścić je z powrotem w inkubatorze.

Po 16 do 24 godzinach podzielić na 250 jednodniowych dorosłych much obu płci na cztery grupy pod lekkim znieczuleniem dwutlenkiem węgla i przenieść je do 250 mililitrowych butelek zawierających pokarm dla dorosłych, trzy uzupełnione różnymi stężeniami EDC i jedną z samym rozpuszczalnikiem EE2. Utrzymuj muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, aby umożliwić im łączenie się w pary. Następnie posortuj każdą kohortę much według płci na dwie grupy. W ramach każdego warunku leczenia dla obu płci, losowo podzielić każdą grupę na pięć równoległych fiolek o gęstości 20 osobników na fiolkę. Przygotuj arkusz kalkulacyjny długości życia, w którym liczba martwych much jest odejmowana od liczby much, które przeżyły z poprzedniego transferu, tak aby automatycznie uzyskiwana była liczba ocalałych przy każdym transferze.

Po trzech dniach przenieś muszki bez znieczulenia do nowych fiolek zawierających odpowiedni pokarm w tym samym czasie i sprawdź, czy nie padły. Zapisz wiek much i liczbę martwych much. Powtarzaj transfer co trzy dni, aż wszystkie muchy umrą.