Drosophila Kwantyfikacja połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ): metoda oceny morfologii i funkcji synaps

- Po pierwsze, immunobarwią larwy Drosophila markerami, które podkreślają różne aspekty NMJ lub połączeń nerwowo-mięśniowych. Jest to obszar, w którym zakończenie aksonu neuronu ruchowego styka się z mięśniem, a jego morfologia jest wykorzystywana jako odczyt funkcji synaptycznej.

Akson kończy się kilkoma gałęziami, które tworzą wybrzuszenia zwane boutonami. Neuroprzekaźniki są uwalniane z butonów i powodują skurcz mięśni. Obszary uwalniania neuroprzekaźników nazywane są strefami aktywnymi. W tym przypadku jeden marker jest specyficzny dla białka synaptycznego, które określa NMJ, a drugi marker jest dla białka obecnego w strefach aktywnych.

Następnie pozyskaj obrazy NMJ za pomocą mikroskopii i oceń ilościowo ich morfologię za pomocą półautomatycznego oprogramowania do analizy obrazu. Zastosuj predefiniowaną serię poleceń programowych do obrazów. Pliki wyjściowe zawierają przeanalizowane obrazy NMJ i wyniki morfologii. Cechy, które można zmierzyć, obejmują liczbę i powierzchnię butonów, długość i liczbę rozgałęzień NMJ, liczbę niepołączonych przedziałów NMJ oraz liczbę aktywnych stref.

W poniższym przykładzie przeanalizujemy morfologię Drosophila NMJ barwionych DLG1, markerem postsynaptycznym i BRP, markerem strefy aktywnej.

- Dla tego protokołu wygeneruj stosy obrazów NMJ i zapisz je jako indywidualne pliki TIFF, gdzie kanał 1 pokazuje barwienie DLG1 lub podobny marker, a kanał 2 pokazuje barwienie BRP. Aby rozpocząć, utwórz projekcje Z i hiperstosy plików obrazów NMJ. Otwórz opcje wtyczki i wybierz morfometrię Drosophila NMJ.

Teraz zidentyfikuj unikatowy ciąg plików, który mikroskop przypisał do serii obrazów podczas zapisywania ich jako TIFF. Będzie to na końcu nazwy obrazu. Skopiuj i wklej ciąg podany najniższej płaszczyźnie i numerze kanału do unikalnego okna ustawień ciągu pliku. Następnie wybierz makro podrzędne "Konwertuj na stos" i wybierz katalog lub folder, w którym znajdują się obrazy.

Dla każdego pliku obrazu tworzone są dwa nowe pliki z domyślnymi nazwami stosu i płaskiego stosu, po których następuje oryginalna nazwa obrazu. Oryginalne pliki można następnie usunąć, aby zaoszczędzić miejsce na dysku. Następnie z interfejsu morfometrii Drosophila NMJ wybierz zdefiniowane makro podrzędne ROI i wybierz katalog plików obrazu.

Gdy otworzy się pierwsza projekcja, wybierz narzędzie do zaznaczania odręcznego, a następnie użyj myszy, aby zdefiniować region zawierający cały terminal NMJ, który Cię interesuje. Po wybraniu kliknij przycisk OK w oknie zdefiniowanego terminala. Kontynuuj tę czynność, aż zaciski NMJ zostaną zdefiniowane we wszystkich rzutach. Makro automatycznie przyspiesza proces. Dla każdego pliku obrazu tworzony jest jeden nowy plik z domyślnymi nazwami ROI, po których następuje oryginalna nazwa obrazu.

Aby określić ilościowo cechy NMJ, najpierw przejdź do interfejsu morfometrii Drosophila NMJ i ustaw skalę. Na przykład, jeśli jeden piksel obrazu odpowiada 0,72 mikrona, ustaw skalę pikseli na 1, a odległość skali na 0,072. Następnie wybierz makro podrzędne Analizuj, a jeśli istnieją dwa obrazy kanałów, przełącz również opcję Czekaj. Naciśnij OK, a po wyświetleniu monitu wybierz katalog z plikiem obrazu. Czas przetwarzania może wynosić kilka minut na synapsę.

Po analizie nowe pliki obrazów dla każdej analizowanej synapsy są przechowywane w folderze nadrzędnym, a pomiary ilościowe znajdują się w pliku results.txt. Sprawdź wszystkie obrazy i wyklucz zdjęcia z błędami segmentacji.

Na przykład części zakończenia synaptycznego mogą nie być uwzględnione w żółtym konturze. Części tła mogą być zawarte w terminalu synaptycznym. Niebieska linia szkieletu może wychodzić poza zakończenie synaptyczne. Może być zbyt wiele aktywnych stref lub niektóre aktywne strefy mogą pozostać niewykryte.