JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 4:49 min • April 30th, 2023
- Zacznij od zamontowania czystej, znieczulonej larwy pod szklaną szkiełkiem nakrywkową z głową do góry. Następnie odsłoń obszar zainteresowania, delikatnie naciskając szkiełko nakrywkowe, aby zwinąć larwę i dostosować jej położenie. Użyj obrazowania konfokalnego, aby zlokalizować larwy komórek nerwowych. Zidentyfikuj określony akson na jednej z docelowych komórek nerwowych jako miejsce urazu.
Następnie wystaw akson docelowy na działanie lasera dwufotonowego o mocy wyższej niż używana do obrazowania w celu wywołania uszkodzenia. Laser dwufotonowy jest stosowany ze względu na jego zdolność do penetracji i precyzyjnego lokalizowania uszkodzeń w żywej tkance przy minimalnym uszkodzeniu otaczającej tkanki.
Przerwij ekspozycję na laser natychmiast, gdy dojdzie do uszkodzenia docelowego neuronu, co spowoduje aksotomię lub odcięcie aksonu. Na koniec zobrazuj uszkodzony neuron, aby zobaczyć jego degenerację i późniejszą regenerację w pożądanych punktach czasowych.
W przykładowym protokole zamontujemy larwę do mikroskopii, wywołamy uszkodzenie neuronów czuciowych larw i będziemy śledzić regenerację neuronów.
- Zacznij od znieczulenia larw. W dygestorium umieść 60-milimetrowe szklane naczynie w 15-centymetrowej plastikowej szalce Petriego. Następnie złóż kawałek bibuły i umieść go w szklanym naczyniu. Umieść płytkę z agarem winogronowym na tkance po dodaniu eteru dietylowego.
Następnie na szkiełku umieść jedną kroplę oleju halocarbon 27 na środku i umieść plamę smaru próżniowego na każdym z czterech rogów. Następnie za pomocą kleszczy przenieś jedną larwę na płytkę agarową i przykryj szklane naczynie, aby znieczulić larwę. Gdy tylko lawa przestanie się poruszać, ostrożnie przenieś ją do oleju halowęglowego z pionową głową. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku i delikatnie dociśnij, aż dotknie larwy.
Następnie użyj delikatnej siły, aby przesunąć szkiełko nakrywkowe, aby przetoczyć komórki, które mają zostać poddane ablacji, do miejsca, w którym laser dwufotonowy najłatwiej w nie uderzy. Lokalizacja będzie się różnić w zależności od tego, jakie neurony są celowane. Teraz zabezpiecz zespół na stoliku mikroskopu dwufotonowego i skup się na interesujących nas komórkach za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzeniowego w olejku.
W oprogramowaniu przełącz się w tryb skanowania i załaduj zapisany protokół. Upewnij się, że otwór jest całkowicie otwarty. Następnie, w trybie na żywo, uzyskaj dobry obraz interesującego Cię regionu.
Następnie zatrzymaj skanowanie na żywo, aby przycisk przycinania stał się dostępny. Korzystając z funkcji przycinania, dostosuj okno skanowania, aby ustawić ostrość obszaru docelowego tylko na potencjalnym miejscu urazu. Następnie otwórz nowe okno obrazowania. Teraz zmniejsz prędkość skanowania i zwiększ intensywność lasera. Następnie przełącz przycisk ciągły, aby rozpocząć i zatrzymać skanowanie. Obserwuj uważnie. Gdy tylko nastąpi drastyczny wzrost fluorescencji, zakończ skanowanie.
Następnie wróć do oryginalnego okna obrazowania i wybierz tryb na żywo, a następnie znajdź obszar, który był właśnie celem, dostosowując ostrość.
- Dobrym wskaźnikiem udanego urazu jest pojawienie się małego krateru, struktury przypominającej pierścień lub zlokalizowanych odłamków bezpośrednio w miejscu urazu. Gdyby moc lasera była zbyt wysoka, widoczny byłby duży uszkodzony obszar, co może być śmiertelne.
- Teraz ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe i przenieś zranioną larwę na nową płytkę z pastą drożdżową. Umieść płytkę w 60 milimetrowym naczyniu wraz z chusteczką nasączoną kwasem propionowym. Następnie przywróć płytkę do temperatury hodowli.
Do późniejszego obrazowania larwy należy skorzystać z zapisanej konfiguracji konfokalnej i zebrać obrazy stosu za pomocą obiektywu 25x. Pamiętaj, aby podać punkt normalizacji, aby można było określić ilościowo regenerację.