$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Kiedy wstrzyknięte zarodki rozwijają się w dorosłe osobniki G0, należy skrzyżować wszystkie pojedyncze muszki z odpowiednimi stadami równoważącymi, aby rozszerzyć potencjalne linie edytowane przez F1 CRISPR i być w stanie śledzić dziedziczenie modyfikacji genomu. Następnie, skrzyżuj losowo wybrane pojedyncze samce F1 z odpowiednimi samicami równoważącymi, aby móc odzyskać potomstwo, jeśli samiec F1 jest pozytywny dla mutacji. Po przeprowadzeniu krzyżówki przenieś samca F1 do rurki w celu przebadania.
Aby wyekstrahować genomowe DNA, zgnieć muchę za pomocą końcówki pipety zawierającej bufor ekstrakcyjny. Gdy tkanka zostanie rozbita, wyrzuć płyn. Bufor ekstrakcyjny zawiera proteinazę K, enzym, który trawi białka w próbce i jest inaktywowany przez wysoką temperaturę.
Teraz, gdy DNA jest dostępne, przejdź do badań przesiewowych PCR. Na przykład użyj starterów zaprojektowanych do amplifikacji regionu, który zawiera nową sekwencję. Tylko w obecności modyfikacji drugie wiązanie startera i produkt PCR zostaną amplifikowane. W tym przykładzie zobaczymy muchy hodowane i badane przesiewowo metodą PCR w celu wprowadzenia sekwencji transaktywacyjnej zastępującej pierwszy ekson genu bezgałęziowego.
- Gdy zarodki nos-Cas9, którym wcześniej wstrzyknięto zarówno plazmid ekspresyjny przewodnika RNA, jak i dawcę zastępczego, rozwijają się w dorosłe osobniki, muchy krzyżowe G0 indywidualnie z muchami równoważącymi z linii odpowiedniej dla docelowego allelu. Znieczulij potomstwo F1 z każdej krzyżówki G0 na podkładce z dwutlenkiem węgla i losowo wybierz od 10 do 20 samców pod mikroskopem stereoskopowym. Indywidualnie skrzyżuj każdego wybranego samca z samicą równoważącą z linią odpowiednią dla docelowego allelu.
Kiedy wykluwają się larwy F2, wybierz ojca F1 z każdej krzyżówki. Ekstrahuj genomowe DNA, zgniatając każdą muchę przez 10 do 15 sekund za pomocą końcówki pipety zawierającej 50 mikrolitrów buforu do zgniatania bez dozowania buforu. Następnie wlej pozostały bufor do probówki i dobrze wymieszaj.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Po inkubacji umieść probówki w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza na 1 do 2 minut, aby dezaktywować proteinazę K. Po odwirowaniu przez 5 minut w temperaturze 10 000 razy g, przechowuj preparat w temperaturze 4 stopni Celsjusza do dalszej analizy PCR.
Wykonaj trzyetapowe badania przesiewowe oparte na PCR, używając starterów do przodu 1 i do tyłu 1 do badania przesiewowego pod kątem istnienia insercji lub wymiany. Wykonaj PCR przy użyciu starterów do przodu 2 i do tyłu 2, aby zweryfikować wstawienie lub zamianę z trzech głównych regionów. Wykonaj PCR przy użyciu starterów M13F i odwróconego 3, aby sprawdzić końcówki HDR.
- Zachowaj linki muchowe z potwierdzonym HDR na końcu i ustal zapasy bilansowe od generacji F2. Na zewnątrz wylatuje równoważnik ponownie, aby usunąć wszelkie niezamierzone mutacje na innych chromosomach.