Osadzanie dorosłych głów Drosophila w parafinie: przygotowanie tkanki do histologii

- Aby unieruchomić muchy do osadzania parafiny, ostrożnie wepchnij znieczuloną Drosophilę przez szczelinę w kołnierzu przeciw owadom, tak aby ich głowy były równomiernie umieszczone na górze urządzenia, jednocześnie przylegając do reszty ciała. W celu utrwalenia tkanek umieść obroże w roztworze Carnoya. Carnoy's to denaturujący środek utrwalający składający się z etanolu, chloroformu i kwasu octowego.

Aby przygotować próbkę do infiltracji parafiny, należy odwodnić tkankę, przenosząc kołnierz przez stopniowane stężenia etanolu. Następnie przenieś obrożę do benzoesanu metylu, rozpuszczalnika organicznego. Następnie umieść go w benozoinie metylu i stopionym roztworze parafiny podczas podgrzewania, aby upewnić się, że parafina pozostanie stopiona. Przejdź do skomplikowanej serii etapów mycia za pomocą wstępnie podgrzanej parafiny w celu usunięcia benzoesanu metylu.

Następnie szybko umieść obrożę w foremce i wlej roztopioną parafinę, aby całkowicie ją pokryła. Gdy parafina stwardnieje, wyjmij blok z formy i użyj żyletki, aby przyciąć nadmiar parafiny. Oderwij kołnierz, pozostawiając rząd głów osadzonych w bloku parafinowym. W przykładowym protokole zobaczymy procedurę zademonstrowaną do analizy fenotypów neurodegeneracyjnych.

- Na początek najpierw użyj kleszczy, aby nawlec muchy przedmiotowe za szyję do obroży. Ustaw wszystkie głowice w tej samej orientacji i upewnij się, że nie dojdzie do uszkodzenia głowy lub oczu. Uwzględnij bezokie muchy sinus oculis w losowo znanych pozycjach, aby kolejność much można było łatwo zidentyfikować w sekcjach. Dodatkowo, jeśli interesujący szczep muchy ma jasne lub białe oczy, nawlecz muchy o czerwonych oczach w odstępach wzdłuż paska, aby upewnić się, że obecna jest wystarczająca ilość pigmentu do zabarwienia szkiełka.

Zapisz kolejność much wraz z numerem obroży, jeśli używana jest więcej niż jedna. Gdy obroża jest gotowa, umieść ją w roztworze Carnoya na 3,5 do 4 godzin. Wykonaj serię płukań etanolem, benzoesanem metylu i parafiną, aby przygotować tkankę muchy do osadzenia. Następnie umieść obroże w gumowej tacce na kostki lodu po jednej na sekcję.

Delikatnie wlej stopioną parafinę na kołnierze, unikając pęcherzyków powietrza i pozwól jej stwardnieć przez noc. Wyjmij bloki parafiny zawierające kołnierze z tacy. Oddziel blok parafiny od obroży za pomocą żyletki, delikatnie odrywając kołnierz. Ciała pozostaną w kołnierzu, podczas gdy głowy pozostaną w bloku parafinowym.