Test CApillary FEeder (CAFE): metoda śledzenia spożycia i preferencji żywieniowych u Drosophila

- Aby przygotować się do testu kapilarnego lub testu CAFE, włóż stopniowane lub oznaczone szklane kapilary wypełnione kolorowym, płynnym pokarmem, dnem do przodu, przez końcówki pipet na wierzchu wstępnie zmontowanej eksperymentalnej fiolki. Upewnij się, że kapilary są bezpiecznie umieszczone na tej samej wysokości i nie stykają się z aparatem.

Zaznacz początkowy poziom łąkotki w każdej kapilarze. Następnie umieść fiolki w środowisku o kontrolowanej temperaturze, wilgotności i świetle na czas trwania eksperymentu, wymieniając naczynia włosowate w razie potrzeby. Podczas testu CAFE muchy ruchome są nieskrępowane i mają swobodny dostęp do dolnego, otwartego końca mikropipety. Muchy żerują dobrowolnie, gdy wysuwają trąbkę i pobierają płyn, zmniejszając pożywkę wewnątrz kapilary.

Aby śledzić spożycie żywności i preferencje w określonym czasie, zapisz zejście łąkotki od znaku początkowego do poziomu na końcu tego okresu od kwalifikujących się naczyń włosowatych. W przykładowym protokole zobaczymy test CAFE z zespołem zmodyfikowanym w celu uzyskania zmniejszonego parowania z kapilar wypełnionych cieczą.

- Ostrożnie wyjmij końcówkę pipety, która zamyka jeden z zewnętrznych otworów, i włóż wypełnioną szklaną kapilarnę dolnym końcem do przodu. Zabezpiecz kapilarę, umieszczając końcówkę pipety z powrotem obok kapilary. Powtórz ten krok dla wszystkich testowanych roztworów spożywczych.

Następnie umieść końce kapilar we wszystkich fiolkach na tym samym poziomie, 3 do 4 centymetrów od wieczka. Pozostaw pewną odległość między bibułą filtracyjną, aby zapobiec wyciekaniu kapilary. Użyj markera, aby oznaczyć górny koniec kolorowego płynu. Oznacz je indywidualnie za pomocą kodu paskowego, aby zapewnić identyfikację różnych naczyń włosowatych.

Przygotowane testy CAFE należy umieścić w plastikowym pudełku z wkładką z siatką. Użyj zatyczki z gąbką, aby nałożyć 100 mikrolitrów świeżej wody co 24 godziny, aby utrzymać stałą wilgotność wewnątrz testu. Użyj czterech oddzielnych fiolek wypełnionych 30 mililitrami podwójnie destylowanego H2O jako urządzeń nawilżających i umieść je obok testów CAFE w plastikowym pudełku.

Przykryj plastikowe pudełko, aby stworzyć środowisko o kontrolowanej wilgotności podczas eksperymentu. Przenieś pudełko do bezpiecznej pozycji w komorze klimatycznej o kontrolowanej temperaturze, świetle i wilgotności na okres eksperymentalny. Przed każdym 24-godzinnym interwałem zanotuj martwe muchy i użyj liczby żywych much do obliczenia zużycia na muchę w następnym okresie.

Pod koniec testu i przed wymianą kapilary należy utrzymać test CAFE w pozycji pionowej. Nie zdejmuj pokrywki i zaznacz dolną łąkotkę naczynia włosowatego. Odrzuć dane, jeśli koniec znaku nie znajduje się poniżej początkowego znaku. Zastąp zużyte naczynia włosowate świeżo wypełnionymi naczyniami włosowatymi do długotrwałych eksperymentów co 24 godziny.

Zmierz spadek łąkotki. Następnie wyrzuć stare naczynia włosowate. Następnie ostrożnie usuń naczynia włosowate z testu i przechowuj je w celu zebrania danych. Sprawdź, czy płyn wewnątrz kapilary osiągnął dolny koniec. Jeśli ciecz wewnątrz kapilary nie dotarła do dolnego końca, wyrzuć dane.

Po eksperymencie zdemontuj zestaw i umyj fiolki, pokrywki i korki z gąbki w kąpieli mydlanej. Następnie wysusz je przez noc w temperaturze pokojowej do dalszego wykorzystania. Powtórz eksperymenty z tymi samymi genotypami w co najmniej trzech różnych dniach. Za pomocą suwmiarki zmierz odległość między początkiem a końcem znaku na kapilarze. Na koniec wyrzuć naczynia włosowate po pomiarze.