Przygotowanie filetów larwalnych: metoda wizualizacji nienaruszonych neuronów czuciowych i związanych z nimi komórek naskórka

- Aby ustawić larwę do rozbioru fileta, umieść ją w naczyniu pokrytym silikonem zawierającym zimną sól fizjologiczną i zidentyfikuj jej stronę grzbietową i brzuszną. Rurki tchawicze biegnące wzdłuż jego długości wyznaczają stronę grzbietową, natomiast pasy ząbkowe brzuszne identyfikują stronę brzuszną.

Następnie, brzuszną stroną do góry, delikatnie rozciągnij larwę i przypnij każdy koniec do dna naczynia. Ta pozycja utrzyma grzbietowe skupiska czuciowych neuronów wielodendrytycznych i związanych z nimi komórek naskórka w stanie nienaruszonym w miarę postępu sekcji.

Użyj nożyczek do preparowania, aby przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej larwy. Przypnij naskórek do płytki, aby spłaszczyć preparat i usunąć struktury wewnętrzne, aby odsłonić leżącą pod spodem tkankę mięśniową. Następnie należy ostrożnie usunąć odpowiedni mięsień, aby odsłonić naskórek i uzyskać dostęp do wcześniej zasłoniętych neuronów, zachowując jednocześnie ich dendrytyczną morfologię.

W przykładowym protokole zobaczymy szczegółową demonstrację przygotowania filetów larwalnych i usuwania mięśni w celu wyświetlenia neuronów czuciowych i komórek naskórka.

- Na początek dodaj tyle zimnej soli fizjologicznej do naczynia z elastomeru silikonowego, aby pokryć dolną powierzchnię. Dodaj badaną larwę do naczynia i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym, zapewniając prawidłowe rozmieszczenie światła. Ustaw larwę brzuszną stroną do góry, którą można rozpoznać po pasach zębatych brzucha.

Rozciągnij larwę w kierunku przednio-tylnym i za pomocą szpilek do owadów przypnij głowę i ogon do dna naczynia. Za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej larwy od jednego końca do drugiego. Rozłóż larwę i przypnij tkankę naskórka w czterech rogach tak, aby leżała płasko.

Za pomocą kleszczy usuń narządy wewnętrzne, w tym OUN, jelito i tchawicę. Wyreguluj szpilki owadów tak, aby filet był napięty, ale nie maksymalnie rozciągnięty.

Zlokalizuj grzbietową linię środkową larwy, gdzie nie ma tkanki mięśniowej, a następnie umieść ząb kleszczowy po wewnętrznej stronie tej granicy. Wsuń ząbek między mięsień a naskórek, uważając, aby zminimalizować kontakt z naskórkiem.

- Aby zminimalizować uszkodzenia naskórka, wypreparuj je możliwie najbardziej płaskimi zębami. I spróbuj przeprowadzić sekcję w soli fizjologicznej zawierającej wapń. To może pomóc w stworzeniu przestrzeni między mięśniem a naskórkiem.

- Następnie pociągnij kleszcze do góry, aby zerwać przyczep mięśnia do ściany ciała w jednym punkcie kotwiczenia. Powtórz ten proces dla pozostałych interesujących nas segmentów mięśni.

Ponownie wyreguluj pióra dla owadów, aby maksymalnie rozciągnąć filet larwalny we wszystkich kierunkach.