Mechaniczne usuwanie kosmówki i błony witeliny: metoda przygotowania oocytów Drosophila do bezpośredniej obserwacji

- Zacznij od dojrzałych oocytów z ustalonych jajników w roztworze soli fizjologicznej. Dojrzałe oocyty mają skorupki jaj składające się z zewnętrznej kosmówki i wewnętrznej błony witelinowej.

Aby mechanicznie usunąć błonę kosmówkową i błonę witelinową, umieść oocyty między oszronionymi częściami dwóch wstępnie przygotowanych szkiełek. Przesuwaj górny suwak prostymi ruchami w przód iw tył, aby wytworzyć tarcie, które toczy oocyty.

Teraz przesuń górny suwak pod niewielkim kątem, aby przetoczyć oocyty w innym kierunku. Unikając ruchu okrężnego, zwiększaj ten kąt w krótkich odstępach, aż górny suwak przesunie się prostopadle do dolnego suwaka. Ruch ten mechanicznie usuwa kosmówkę i błony witelinowe, umożliwiając dostęp sond lub barwników do oocytu.

Oocyty bez kosmówki będą wyglądały na długie i cienkie, a te bez błon witelinowych będą miały spiczaste końce. Aby oddzielić oczyszczone oocyty od otaczających je szczątków, przenieś mieszaninę próbek do probówki i pozwól oocytom osiąść na dnie, podczas gdy zanieczyszczenia unoszą się na górze i można je usunąć.

W tym protokole usuniemy błony kosmówkowe i błony żółciowe z dojrzałych oocytów Drosophila.

- Aby oddzielić oocyty w późnym stadium, najpierw dodaj 1 mililitr PBSBTx do płytkiego naczynia preparacyjnego. Następnie użyj P200 z końcówką pokrytą BSA, aby przenieść nieruchome jajniki do płytkiego naczynia. Pipetować jajniki w górę i w dół za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA, aby usunąć dojrzałe oocyty ze mniej dojrzałych oocytów.

Gdy oocyty w późnym stadium zostaną wystarczająco oddzielone, przenieś całą tkankę do probówki do mikrofuge o pojemności 500 mikrolitrów. Usuń nadmiar płynu za pomocą ciągniętej pipety Pasteura, pozostawiając około 150 do 200 mikrolitrów w probówce.

Aby przygotować się do zwijania oocytów, należy wstępnie zwilżyć naczynie z głęboką studnią za pomocą 200 mikrolitrów PBSBTx. Przykryj naczynie i odłóż je na bok.

Zaopatrz się w trzy szkiełka z matowego szkła i odłóż trzy szkiełka na bok. Następnie delikatnie przetrzyj ze sobą obszary matowego szkła szkiełka pierwszego i drugiego. Opłucz je w wodzie dejonizowanej, aby usunąć wszelkie odłamki szkła i osusz jednorazową chusteczką. Pokryj oszronione obszary szkiełek podstawowych i drugich PBSBTx, dodając 50 mikrolitrów PBSBTx do jednego szkiełka i pocierając ten obszar drugim szkiełkiem. Usuń płyn jednorazową chusteczką i umieść szkiełka pod mikroskopem preparacyjnym. Utrzymuj oszronione obszary szkiełek pierwszego i drugiego w kontakcie ze szkiełkiem trzecim podtrzymującym slajd drugi.

Aby zwinąć oocyty, najpierw zwilż końcówkę pipety P200 w PBSBTx i rozproszyj oocyty w probówce do mikrofuge, pipetując w górę iw dół. Przenieś 50 mikrolitrów płynu zawierającego oocyty do środka części z matowego szkła szkiełka pierwszego. Podnieś slajd drugi, aby to zrobić.

Powoli opuść suwak drugi, aż napięcie powierzchniowe cieczy utworzy uszczelnienie między dwoma obszarami matowego szkła. Powinno być wystarczająco dużo płynu, aby pokryć oszroniony obszar, ale żaden nie powinien wyciekać. Następnie przytrzymaj dolny suwak jedną ręką na miejscu, a drugą ręką przesuń górny suwak do przodu iz powrotem w kierunku poziomym, utrzymując suwak drugi poziomo i podparty na slajdzie trzecim.

Wykonuj pod mikroskopem, aby łatwo zobrazować ruchy oocytów i postępy. Po kilku ruchach w kierunku poziomym nieznacznie zmień kąt ruchu. W wielu krokach stopniowo zwiększaj ten kąt do 90 stopni, aż ruch górnego suwaka dwa będzie prostopadły do kierunku początkowego. Należy pamiętać, że puste kosmówki będą widoczne w płynie, a oocyty pozbawione kosmówki będą wydawać się dłuższe i cieńsze.

- Podczas zwijania oocytów upewnij się, że kierunek toczenia jest zawsze w linii prostej, a nigdy ruchem okrężnym.

- Powtórz zwijanie około 7 do 10 razy, aż roztwór stanie się lekko mętny. Przestań się toczyć, gdy wydaje się, że większość oocytów straciła błony żółciowe.

Delikatnie podnieś górny slajd drugi, przeciągając jeden z jego rogów do środka oszronionego obszaru na dolnym slajdzie pierwszym, tak aby zwinięte oocyty zgromadziły się w środku oszronionego obszaru. Wypłukać oocyty z obu szkiełek za pomocą PBSBTx do naczynia głębinowego zawierającego PBSBTx.

Wyczyść szkiełka pierwsze i drugie ultraczystą wodą. Osuszyć jednorazową chusteczką i zresetować. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie oocyty o tym samym genotypie zostaną zrolowane. Zwykle wymaga to od trzech do czterech rund walcowania na genotyp.

Aby usunąć zanieczyszczenia po walcowaniu, dodaj 1 mililitr PBSBTx do 15-mililitrowej stożkowej tuby. Zakręć płynem, aby pokryć boki tuby. Za pomocą końcówki do pipety P1000 pokrytej PBSBTx, przenieś zwinięte oocyty z naczynia głębinowego do stożkowej probówki zawierającej 1 mililitr PBSBTx. Dodaj dodatkowe 2 mililitry PBSBTx do stożkowej probówki zawierającej oocyty.

Przytrzymaj stożkową rurkę na ciemnym tle, aby zobaczyć nieprzezroczyste oocyty, gdy toną. Po pozostawieniu oocytów na dnie, użyj P1000, aby usunąć górne 2 mililitry roztworu zawierającego zanieczyszczenia i wyrzucić.

Po powtórzeniu tego kroku, co daje łącznie trzy rundy usuwania zanieczyszczeń, użyj końcówki pipety P1000 pokrytej PBSBTx, aby przenieść oocyty z powrotem do oryginalnej probówki do mikrofug o pojemności 500 mikrolitrów. Od 20 do 25 samic powinno uzyskać około 50 mikrolitrów zwiniętych dojrzałych oocytów.