JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 2:56 min • April 30th, 2023
- Przenieś umyte C. elegans w płynie na szkiełko uprzednio pokryte polilizyną, związkiem, który pomoże skórkom robaków przykleić się do powierzchni szkła. Delikatnie dociśnij kolejny szklany suwak prosto w dół, tak aby krawędź wystawała poza dolny suwak. Aby unieruchomić robaki bez uszkodzeń, ściskaj zwierzęta, unikając ruchów bocznych. Następnie umieść szkiełka podstawowe z ułożonymi robakami na metalowym bloku w izolowanym pojemniku laboratoryjnym wypełnionym środkiem zamrażającym, takim jak ciekły azot lub suchy lód.
Metal jest skutecznym przewodnikiem temperatury, zapewniając, że powierzchnia bloku jest wystarczająco zimna, aby szybko zamrozić skórki robaka na obu szklanych powierzchniach. Po zamrożeniu szybko oddziel szklane szkiełka, aby rozsunąć lub rozłupać skórki robaków. Kontynuuj utrwalanie i barwienie tkanek, ponieważ przerwanie naskórka o niskiej przepuszczalności umożliwia chemicznym utrwalaczom i przeciwciałom barwiącym dostęp do wewnętrznych tkanek robaka. W poniższym protokole zobaczymy szczegółową demonstrację techniki krakingu przez zamrażanie i utrwalania tkanek.
- Najpierw przygotuj szkiełko, aby naprawić robaki. Odpipetować 30 mikrolitrów poli-L-lizyny na szkiełko podstawowe, a następnie umieścić drugie szkiełko na drugim i pocierać je o siebie, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na obu. Teraz oderwij oba szkiełka i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut.
Następnie umieść płaski metalowy blok w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem. Umyć płytki roztworem M9 i przenieść około 10 mikrolitrów M9 zawierającego robaki. Alternatywnie wybierz robaki i dodaj M9 do zjeżdżalni.
Po przeniesieniu robaków delikatnie upuść na nie szkiełko nakrywkowe w poprzek, tak aby szkiełko nakrywkowe wystawało poza jedną krawędź. Następnie delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, nie wykonując żadnych ruchów bocznych.
Teraz natychmiast przenieś szkiełko do metalowego bloku w ciekłym azocie i pozwól mu zamarznąć. Po pięciu minutach strzepnij szkiełko nakrywkowe, używając wystającej krawędzi. Zrób to szybko, aby uzyskać prawidłowe pęknięcie naskórka.
Następnie zanurz szkiełko w szklanym słoiku Coplin wypełnionym metanolem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach przenieś szkiełko do szklanego słoika Coplin wypełnionego acetonem na kolejne pięć minut w tej samej temperaturze. Szkiełka mogą być barwione bezpośrednio lub przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.