PCR z pojedynczym robakiem: metoda ekstrakcji i amplifikacji genomowego DNA

- W przypadku analizy PCR na pojedynczym robaku pozwól robakowi hermafrodytycznemu na samozapłodnienie i złożenie jaj, które wyprodukują genetycznie identyczne potomstwo, a tym samym zachowaj kopię zmodyfikowanego szczepu. Następnie przenieś rodzica do probówki zawierającej bufor do lizy robaków.

Zamroź probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby rozerwać naskórek lub zewnętrzną warstwę. Podgrzej próbkę do temperatury plus 60 stopni Celsjusza, aby zlizować komórki robaka, uwalniając białka wewnątrzkomórkowe wraz z genomowym DNA komórki. W tej temperaturze proteinaza K w buforze degraduje białka, szczególnie nukleazy, które w przeciwnym razie zniszczyłyby genomowe DNA.

Następnie podnieś temperaturę do 95 stopni Celsjusza, aby dezaktywować enzym. Na koniec dodaj lizat komórkowy do probówki z główną mieszanką PCR składającą się z buforu reakcyjnego, dNTP, starterów do przodu i do tyłu dla obszaru zainteresowania, polimerazy taq i wody, doprowadzając reakcję do pożądanej objętości końcowej. Aby wykonać PCR, uruchom odpowiedni program termocyklera, który amplifikuje interesujący nas region DNA.

W poniższym przykładzie zobaczymy procedurę PCR do badania przesiewowego pod kątem zdarzeń edycji CRISPR-Cas9 w genomowym DNA pojedynczych robaków F1.

- Po 1 do 2 dniach składania jaj użyj zdjęcia robaka, aby przenieść F1 do pojedynczych nakrętek probówek z paskami PCR zawierających 7 mikrolitrów ciepłego buforu do lizy. Odwiruj probówki do PCR z maksymalną prędkością i temperaturą pokojową przez jedną minutę, aby sprowadzić zwierzęta na dno probówki. Następnie zamroź probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę.

Następnie zlizuj zamrożone robaki w termocyklerze za pomocą następującego programu. Następnie skonfiguruj główną mieszankę PCR, jak pokazano w tej tabeli.

Dodaj 21 mikrolitrów głównej mieszanki PCR do czystych probówek PCR. Następnie dodaj 4 mikrolitry rurki do lizy ślimakowej i dobrze wymieszaj, pipetując.

Następnie uruchom program PCR zgodnie z wytycznymi producenta.