$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Podczas wizualizacji kropelek lipidów, wewnątrzkomórkowych organelli magazynujących obojętne lipidy, zacznij od dodania do próbki roztworu detergentu, takiego jak roztwór zawierający Triton X-100. To przeniknie do komórek robaka. Następnie należy utrwalić próbkę w odpowiednim stężeniu izopropanolu, na przykład 40%.
Następnie dodaj czerwień nilową do próbki i chroń ją przed światłem, ponieważ barwnik jest wrażliwy na światło. Utrwalenie umożliwia barwnikowi dostęp do kropelek lipidów w całym zwierzęciu. Czerwień Nilowa jest barwnikiem lipofilowym, którego widmo emisji fluorescencji zależy od polarności lokalnego środowiska lipidowego.
Po wystawieniu na działanie polarnych lipidów, takich jak fosfolipidy, widmo emisyjne czerwieni nilowej znajduje się w wyższych, czerwonych długościach fal. Po wystawieniu na działanie obojętnych lipidów, takich jak triacyloglicerole i estry steroli w neutralnym rdzeniu kropelek lipidów, widmo emisyjne czerwieni nilowej przesuwa się na niższe, żółto-złote długości fal.
Dlatego użyj zielonego kanału mikroskopu fluorescencyjnego, który będzie zbierał emisje o długości fali żółto-złotej, aby uwidocznić czerwone zabarwienie kropelek lipidów w całym zwierzęciu. W przykładowym protokole zobaczymy procedurę barwienia czerwienią nilową i obrazowanie kropelek lipidów w utrwalonych próbkach.
- Aby przeprowadzić barwienie lipidów czerwienią nilową, robaki płytkowe na pożywce wzrostowej nicieni lub NGM wysiane późną logarytmią OP50 E. coli i hodują robaki w temperaturze od 20 stopni Celsjusza do wczesnego stadium L4. Umyj robaki 1 mililitrem roztworu PBST i przenieś zawiesinę robaka do 1,5 mililitrowej probówki do mikrofuge.
Odwirować robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę, następnie usunąć supernatant i powtarzać płukanie PBST, aż E. coli zostanie usunięta z zawiesiny. Następnie do osadu robaka dodaj 100 mikrolitrów 40% izopropanolu lub 60% do barwienia ORO i inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.
- Dodatek izopropanolu jest kluczowy dla prawidłowego przenikania robaków przed barwieniem.
- Odwiruj robaki pod 560-krotnością grawitacji przez jedną minutę i usuń supernatant bez naruszania osadu robaka.
- Ważne jest, aby zminimalizować ekspozycję na światło podczas etapów wirowania.
- Teraz, będąc w ciemności, dodaj 600 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu roboczego NR do każdej próbki. Odwróć probówki trzy razy i całkowicie wymieszaj robaki i roztwór. Następnie inkubować próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.
Po inkubacji odwirować robaki i usunąć supernatant. Następnie dodaj 600 mikrolitrów PBST i inkubuj próbki w ciemności przez 30 minut, aby usunąć nadmiar plamy NR. Po ponownym odwirowaniu próbek, jak poprzednio, usunąć wszystkie z wyjątkiem około 50 mikrolitrów supernatantu.