$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Zacznij od kropli roztworu buforowego na szkiełku mikroskopowym i przenieś nienaruszone robaki do kropli. Gdy robaki znajdą się na miejscu, użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby wchłonąć i usunąć bufor. Utrwal próbkę, kąpiąc próbki w 90% etanolu kilka razy, pozwalając mu odparować po każdym zastosowaniu.
Gdy etanol odparuje po ostatnim płukaniu, dodaj do próbki roztwór zawierający barwnik kwasu nukleinowego, DAPI. DAPI wiąże się preferencyjnie z zasadami adeniny i tyminy w mniejszym rowku DNA. Po związaniu kompleks DAPI-DNA pochłania światło UV i emituje widzialne światło niebieskie.
Następnie dodaj środek konserwujący zapobiegający blaknięciu, aby przedłużyć okres trwałości próbki. Nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij je do szkiełka. Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego z niebieskim filtrem, aby uwidocznić ciała DAPI, które w zależności od komórki i jej statusu cyklu mogą reprezentować pojedyncze chromosomy, pary chromatyd siostrzanych lub całe jądra. W tym eksperymencie policzymy pary chromatyd siostrzanych barwionych DAPI w oocytach, aby zidentyfikować tetraploidalne szczepy Caenorhabditis elegans.
- Szczepy tetraploidalne mają 12 par chromosomów, które można zwalidować, licząc ciała barwione DAPI w niezapłodnionych oocytach. Aby to zrobić, upuść od pięciu do dziesięciu mikrolitrów buforu M9 na szkiełko i przenieś od sześciu do 10 przypuszczalnych tetraploidów do kropli. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie zanurz większość M9 w niestrzępiącej się chusteczce czyszczącej.
Następnie upuść 10 mikrolitrów 90% etanolu na robaki i obserwuj, jak etanol całkowicie odparowuje. Jak tylko parowanie zakończy się parowanie, powtórz proces dodawania etanolu i obserwuj, jak odparowuje. W sumie dodaj 10 mikrolitrów w czterech aplikacjach. Po odparowaniu ostatniej kropli dodaj sześć mikrolitrów DAPI w stężeniu dwóch nanogramów na mikrolitr lub podobną plamę.
W celu długotrwałego przechowywania szkiełek należy zamontować robaki w dostępnym w handlu lub domowym środku zapobiegającym blaknięciu. Następnie dodaj szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci. Po wyschnięciu lakieru do paznokci szkiełka można naciąć. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego i powiększenia 100x.
Najpierw znajdź najbardziej dojrzały niezapłodniony oocyt, który znajduje się bezpośrednio przy spermatece i nie dostał się jeszcze ani do spermateki, ani do macicy. Ciała DAPI są tutaj przypuszczalnie pojedynczymi parami chromosomów. Następnie skup się na jądrze oocytu i użyj precyzyjnej ostrości mikroskopu, aby powoli je zeskanować, od góry do dołu, licząc ciała DAPI. Następnie przelicz ciała DAPI w tym samym jądrze, przesuwając ostrość od dołu do góry.
Oocyty typu dzikiego mają średnio sześć ciał DAPI. Obecność 12 ciał DAPI wskazuje, że zwierzęta w tym szczepie są częściowymi lub całkowitymi tetraploidami. Przeanalizuj co najmniej 10 zwierząt z każdego szczepu. Często pary chromosomów będą bardzo bliskie lub stykające się, więc liczba ciał DAPI jest często mniejsza niż rzeczywista liczba par chromosomów.