JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 3:24 min. • April 30th, 2023
- U C. elegans RNAi może być indukowane przez karmienie bakterii robaków, które wyrażają dwuniciowe RNA lub dsRNA z rekombinowanego plazmidu DNA.
Na początek hoduj oporne na tetracykliny HT115 E. coli transfekowane plazmidem L4440 przez noc na selektywnych płytkach agarowych LB zawierających tetracyklinę i ampicylinę lub jej funkcjonalny analog karbenicylinę. Oprócz docelowego DNA plazmid zawiera gen oporności na ampicylinę. Tylko kolonie bakterii, które dziedziczą plazmid, mogą rosnąć w obecności tych antybiotyków.
Następnie zbierz kolonie bakterii i rozprowadź je w płynnym podłożu LB do pożądanego stężenia. Aby indukować ekspresję dsRNA, przenieś roztwór bakterii na przygotowane podłoże do wzrostu nicieni lub NGM, płytki agarowe zawierające IPTG.
W tym systemie ekspresji IPTG naśladuje laktozę w celu inaktywacji represora lac, umożliwiając ekspresję polimerazy RNA T7. Na plazmidzie docelowa ekspresja DNA jest regulowana przez dwa zbieżne promotory T7. W związku z tym sekwencje sensowne i antysensowne są transkrybowane, co prowadzi do ekspresji dsRNA.
Wreszcie, robak wykorzystuje informacje o sekwencji ze spożytego dsRNA do obniżenia endogennych mRNA za pomocą sekwencji komplement
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych