Name: Jednoetapowa metabolomika: węglowodany, organiczne i aminokwasy oznaczone ilościowo w jednej procedurze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj jednoetapową metabolomikę węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów metodą GC/MS z urease. Metoda poprawia skrining noworodkowy, wykrywając dodatkowe 38% wrodzonych błędów metabolizmu niewidocznych dla tandemowej spektrometrii mas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność za kompetentną pomoc techniczną udzieloną przez Anthony’ego Thomasa.

Procedura przetwarzania próbek moczu
<ol>
 <li>Rozmrozić próbkę moczu w kąpieli wodnej o temperaturze 37° C. Przelać do nowego pojemnika, jeśli oryginalny jest uszkodzony.</li>
 <li>Pobrać maksymalną alikwot 13 ml próbki i przechowywać w temperaturze -20° C w oznakowanej stożkowej probówce wirówkowej.</li>
 <li>Zmierzyć i zapisać gęstość optyczną próbki, umieszczając kilka kropli moczu w refraktometrze.</li>
 <li>Przefiltrować próbkę przez filtr 0.2 um.</li>
 <li>Odmierzyć objętość próbki zgodnie z poniższą gęstością optyczną:
 <table border="0">
 <tbody >
 <tr >
 <td >1.000-1.009</td >
 <td >1.00 ml</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >1.010-1.019</td >
 <td >0.50 ml</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >1.020-1.050</td >
 <td >0.25 ml + 0.25 ml H2O</td >
 </tr >
 </tbody >
 </table >
 </li>
 <li>Określoną objętość przenosi się następnie do fiolki Reactivial zawierającej następujące standardy wewnętrzne: 500 nanomoli (nmoles) 3 kreatyny; 10 nmoles d3 kwasu metylomalonowego; po 100 nmoles każdego z następujących: 13C3 mleczanu, 13C3 pirogronianu, 13C2 15N glicyny, d3 seryny, d5 fenyloalaniny, d11 heksanoiloglicyny, 15N2 orotanu, d4 kwasu sebacinowego, 13C6 glukozy, d6 inozytolu oraz d5 tryptofanu.</li>
 <li>Do próbki dodaje się 20 mikrolitrów (μl) roztworu ureazy o stężeniu 7.5 Units/μl (Calzyme Laboratories nr katalogowy 116A0100), a następnie próbkę przepłukuje i uszczelnia pod osłoną CO2 za pomocą inertnego septa.</li>
 <li>Próbkę utrzymuje się w temperaturze 37°C przez 30 minut, dodając więcej gazowego dwutlenku węgla w odstępach 15-minutowych w celu utrzymania ciśnienia.</li>
 <li>Dodaje się kolejne 20 μl roztworu ureazy, fiolkę przepłukuje dwutlenkiem węgla i utrzymuje próbkę w temperaturze 37°C przez kolejne 15 minut.</li>
 <li>Dodaje się 500 μl mieszaniny acetonu i metanolu w stosunku 30:70, gumowe septum zastępuje się septem powlekanym Teflonem, a próbkę chłodzi w temperaturze -20° C przez 15 minut.</li>
 <li>Osad usuwa się poprzez wirowanie przy 1500 rpm przez 10 minut, a następnie ciecz przelewa się do czystej fiolki 2.0 cc Reactivial (Supelco/Sigma).</li>
 <li>Dodać trifluoroacetan trietyloamoniu (TEA/TFA) (Sigma) w następujący sposób:
 <ul >
 <li >20 μl dla próbek 1.00 ml</li >
 <li >40 μl dla próbek 0.5 ml lub mniejszych</li >
 </ul >
 </li>
 <li>Dopełnić acetonitrylem i pozostawić pod strumieniem azotu w temperaturze 70° C do momentu uzyskania stałej objętości (pozostanie TEA/TFA) (~ 15 minut).</li>
 <li>Powtórzyć krok 13 do 4 razy, aż do utworzenia się osadu (~ 10 minut każdy).</li>
 <li>Pozostawić do ostygnięcia przez około 2 minuty. Dopełnić chlorkiem metylenu, uważając, aby roztwór nie wykipiał, i osuszyć (~ 4:00 minuty).</li>
 <li>Powtórzyć krok 15.</li>
 <li>Dodać MSTFA (N-metylo-N-trimetylisilylotrifluoroacetamid) (Thermal Scientific) w następujących ilościach:
 <ul >
 <li >150 μl dla próbek 1.00 ml</li >
 <li >200 μl dla próbek 0.50 ml lub mniejszych</li >
 </ul >
 </li>
 <li>Zamknąć pod atmosferą azotu i inkubować w temperaturze 70° C przez 1 godzinę.</li>
 <li>Przenieść do mikrofiolek w atmosferze azotu w celu analizy na chromatografie gazowym / spektrometrze mas.</li>
 <li>Umieścić mikrofiołki do automatycznego wstrzykiwania w urządzeniu Agilent 5975 GC/MS: Temperatury instrumentu wynoszą: injektor 200° C, interfejs 250° C, piec 80° C przez 1 minutę; gradient 4° C/minutę w zakresie 80-130° C, gradient 6° C/minutę w zakresie 130-200° C, gradient 12° C/minutę w zakresie 200-285° C, utrzymanie przez 10 minut. Kolumna: 25 m, średnica wewnętrzna 320 micron, grubość filmu 0.5 micron DB-5. Spektrometr mas: źródło 230° C, kwadrupol 150° C, skanowanie 50-650 amu przy 2.46 skanach/sek. Opóźnienie rozpuszczalnika 3.5 minuty.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć reprezentatywne wyniki.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

Metabolic Screening Lab jest laboratorium klinicznym z licencją CLIA, należącym do Saint Louis University, organizacji non-profit. Dr Shoemaker nie czerpie bezpośrednich korzyści z przychodów laboratorium, lecz może odnieść korzyści pośrednie z wydajności laboratorium. Żadne z metod, technik, wyników, zakresów norm, makr, oprogramowania, bibliotek ani wniosków nie jest uważane za zastrzeżone i są one swobodnie dostępne dla zainteresowanych stron.

Metoda ureazowa (1) została przytoczona 62 razy w literaturze medycznej z różnymi modyfikacjami. Grupa Matsumoto (2,3) uprościła procedurę w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowego screeningu noworodków i przedstawiła wyniki z 16000 pacjentów. Kuhara i inni (4-7) opisali zastosowanie tej metody w kilku przypadkach diagnostyki i monitorowania wrodzonych błędów metabolicznych. Rhead (8) potwierdził również użyteczność tej metody w diagnostyce klinicznej i monitorowaniu wrodzonych błędów metabolicznych. Metoda ta była stosowana do analizy moczu niedźwiedzi, myszy knock-out, słoni oraz homogenatów całych muszek owocowych i ich larw (9). Analizie poddano również pożywki z Cryptococcus przed i po mutogenezie celowanej, z pominięciem etapu ureazowego (10). Metodę zastosowano do oceny stanu odżywienia ludzi u studentów medycyny, pacjentów z zespołem Downa oraz otępiałych starszych weteranów po podaniu badanym doustnych dawek aminokwasów: tryptofanu, metioniny i izoleucyny (11). Wszystkie osiem witamin z grupy B oceniono poprzez ilościowe oznaczenie produktów rozkładu trzech aminokwasów, które w trakcie swojej degradacji wymagają wszystkich 8 witamin. Opisano toksyczne działanie farmaceutyków oraz jego łagodzenie poprzez suplementację witaminami (12). Przeanalizowano i opisano próbki płynu owodniowego z prawidłowych ciąż oraz ciąż z zespołem Downa (13-15).

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Komputer</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Komputer</td></tr><tr><td>Ureaza</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>Również Sigma C3</td></tr><tr><td>Standardy stabilnych izotopów</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozpuszczalniki</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anality</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumny GC</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoetapowa metabolomika: ilościowe oznaczanie węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów w ramach jednej procedury

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Każdy noworodek urodzony w USA jest obecnie badany w kierunku do 42 rzadkich zaburzeń genetycznych nazywanych „wrodzonymi błędami metabolizmu”. Metoda przesiewowa opiera się na tandemowej spektrometrii mas i służy do oznaczania ilości acylkarnityn w celu wykrycia organicznych acidemii, a także do pomiaru poziomu aminokwasów. We wszystkich stanach wykonuje się również testy enzymatyczne w kierunku zaburzeń metabolizmu węglowodanów, takich jak galaktozemia. Ze względu na to, że wyniki mogą być nieswoiste, w przypadku wyników dodatnich wymagane jest przeprowadzenie badań kontrolnych z wykorzystaniem bardziej rozstrzygającej metody. Niniejszy raport opisuje metodę przygotowania próbek z użyciem „ureazy” w badaniach przesiewowych w kierunku wrodzonych błędów metabolizmu. Krystaliczna ureaza jest stosowana do usuwania mocznika z płynów ustrojowych, co umożliwia odwodnienie i derywatyzację większości pozostałych rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w jednej procedurze w celu przeprowadzenia chromatografii gazowej. Odwodnienie poprzez odparowanie w strumieniu azotu jest ułatwione dzięki dodaniu acetonitrylu i chlorku metylenu. Następnie zachodzi trimetylosylilacja w obecności unikalnego katalizatora, trifluoroacetanu trietyloamoniowego. Po zautomatyzowanym wtryskiwaniu i chromatografii następuje sterowane makrami ilościowe oznaczenie 192 metabolitów oraz półilościowe oznaczenie każdego głównego składnika z wykorzystaniem specjalistycznych bibliotek widm masowych związków biologicznych derywatyzowanych przez TMS. Analizę można przeprowadzić na powszechnie stosowanej platformie Chemstation, korzystając z makr i bibliotek udostępnionych przez autora. W naszym laboratorium metodą tą przeanalizowano ponad 16 000 próbek pacjentów, uzyskując wydajność diagnostyczną na poziomie około 17% – oznacza to, że w 17% próbek uzyskano wyniki wymagające podjęcia działań przez lekarza kierującego. Obejmuje to ponad 180 potwierdzonych wrodzonych błędów metabolizmu, z których około 38% nie mogłoby zostać zdiagnozowanych przy użyciu poprzednich metod.

Twórca metody przedstawia sposób przygotowania próbek z wykorzystaniem ureazy do analizy GC/MS metabolitów pośrednich. Metoda ta umożliwia jednoczesne, jednowykrokową analizę uzupełniającą w ramach przesiewowych badań noworodków w kierunku wrodzonych błędów metabolizmu za pomocą tandemowej spektrometrii mas, poprzez ilościowe oznaczenie węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów w jednym procesie.

Jednoetapowa metabolomika: ilościowe oznaczanie węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów w ramach jednej procedury

Każde niemowlę urodzone w USA jest obecnie badane w kierunku do 42 rzadkich zaburzeń genetycznych nazywanych „wrodzonymi błędami metabolizmu”. Metoda przesiewowa opiera się na ...

W tej jednowroczkowej procedurze metabolomicznej próbki biologiczne są przygotowywane do analizy węglowodanów, kwasów organicznych i aminowych za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas w ramach pojedynczego procesu. Próbki są najpierw traktowane enzymem ureazą w celu usunięcia mocznika. Drugim krokiem procedury jest odwodnienie próbek w obecności detergentu składającego się z dwóch lotnych komponentów: triatlonu, amoniaku i trifluorooctanu.Następnie przeprowadza się pochodniowanie składników poprzez trimetylację. Wreszcie analiza za pomocą chromatografii gazowej, spektrometrii mas oraz zautomatyzowane oznaczanie ilościowe węglowodanów, kwasów organicznych i aminowych, izoleucyny, glicyny i aminocukrów pozwala na potwierdzenie i monitorowanie większości zaburzeń genetycznych wykrytych podczas badań przesiewowych noworodków oraz dodatkowych 38% zaburzeń, których obecnie nie bada się za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Witajcie, jestem Jim Shoemaker z Laboratorium Przesiewu Metabolicznego na Uniwersytecie w St. Louis.Przedstawię Państwu metodę jednoetapowej metabolomiki, która służy do analizy płynów biologicznych w celu wykrycia metabolitów pośrednich bez konieczności rozdzielania kwasów, zasad i związków obojętnych. Dzięki temu możliwe jest uzupełnienie przesiewowych badań noworodków wykonywanych za pomocą spektrometrii mas tandemowej o pojedynczą procedurę, która pozwala na jednoczesną analizę kwasów organicznych, aminokwasów, węglowodanów, pochodnych węglowodanów oraz glicyny ACell. Wynikiem tego jest fakt, że na wykresie za mną można zauważyć, iż diagnozy zaznaczone na czerwono mogą zostać postawione dzięki jednoetapowej metabolomice, natomiast nie zostałyby one wykryte podczas obecnych przesiewowych badań noworodków z wykorzystaniem spektrometrii mas tandemowej.Przejdźmy do demonstracji. Aby rozpocząć procedurę, umieść próbkę moczu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Jeśli oryginalny pojemnik jest uszkodzony, przelej próbkę do nowego naczynia.Pobrać alikwot próbki i przechowywać go w temperaturze -20 °C w oznakowanej stożkowatej probówce do wirowania jako zapas. Następnie zmierzyć i zapisać gęstość optyczną próbki, umieszczając kilka kropli moczu w refraktometrze ręcznym. Po zmierzeniu gęstości optycznej przefiltrować próbkę przez filtr 0,2 µm.Odmierz objętość próbki zgodnie z gęstością optyczną zmierzoną przed filtracją. Dla wartości od 1 do 1,009 użyj 1 ml próbki; dla wartości od 1,01 do 1,019 użyj 0,5 ml próbki, a dla wartości od 1,02 do 1,05 połącz 0,25 ml próbki z 0,25 ml wody.Przenieś określoną objętość do probówki reakcyjnej zawierającej już znakowane izotopowo standardy wewnętrzne wymienione w przedstawionej tutaj tabeli. Standardy obejmują kreatynę, kwas metylomalonowy, mleczan, pirogronian, glicynę, seryno-fenyloalaninę, heksanol, glicynę, orotan, kwas SEBA, glukozę, inozytol i tryptofan. Następnie dodaj 20 µL roztworu ureazy o stężeniu 7,5 jednostek na µL.Przepłucz próbkę i zamknij ją pod atmosferą dwutlenku węgla za pomocą inertywnej septy. Przechowuj próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, dodając gazowy dwutlenek węgla w odstępach 15 minut, aby utrzymać ciśnienie pod koniec 30-minutowej inkubacji, dodając dodatkowe 20 µL roztworu ureazy. Przepłucz fiolkę dwutlenkiem węgla i utrzymuj próbkę w temperaturze 37 °C przez kolejne 15 minut.Po zakończeniu obróbki ureazą należy niezwłocznie przystąpić do odwodnienia i derywatyzacji próbki. Do próbek dodaje się 500 µL roztworu acetonu i metanolu w stosunku od 30 do 70, zastępując uprzednio gumową przegrodę przegrodą pokrytą Teflonem.Schłodzić próbkę w temperaturze -20 °C przez 15 minut. Usunąć ciała stałe poprzez wirowanie z prędkością 1500 RPM przez 10 minut, a następnie przelać nadsącz do czystej probówki reakcyjnej o pojemności 2,0 CC. Następnie dodać trifluorooctan triammonium (TFA), który jest katalizatorem trimetylacji: 20 µL dla próbek o objętości 1 ml oraz 40 µL dla próbek o objętości 0,5 ml lub mniejszych.Uzupełnić do pełna acetonitrylem i pozostawić w strumieniu azotu w temperaturze 70 °C aż do uzyskania stałej objętości, co wskazuje, że pozostało jedynie T-E-A-T-F-A. Trwa to około 15 minut. Ponownie uzupełnić do pełna acetonitrylem i pozostawić w strumieniu azotu w temperaturze 70 °C do momentu uzyskania stałej objętości, powtarzając tę czynność do czterech razy, aż do utworzenia się osadu.Każdy taki etap po dehydratacji trwa około 10 minut, po czym należy pozostawić próbkę do ochłodzenia przez około dwie minuty. Uzupełnić chlorkiem metylenu, uważając na gwałtowne wrzenie, a następnie wysuszyć. Czynność ta trwa około czterech minut.Dopełnić chlorkiem metylenu i osuszyć. Powtórzyć czynność jeszcze raz. Następnie przeprowadzić pochodną próbki.Dodać 150 µL OFM, STFA dla próbek o objętości 1 mL oraz 200 µL dla próbek o objętości 0,5 mL lub mniejszej. Próbki należy zamknąć pod atmosferą azotu i inkubować w temperaturze 70 °C przez jedną godzinę. Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji, pracując pod atmosferą azotu, przenieść próbki do mikrofiolek w celu analizy na spektrometrze mas z chromatografem gazowym; w tym przypadku zastosowano Agilent 5 9 7 5 GCMS z kapilarą DB five.W przypadku spektrometrii mas ustaw źródło na 230 °C, kwadrupol na 150 °C, a zakres skanowania masy od 50 do 650 A MU przy szybkości 2,46 skanów na sekundę. Opóźnienie rozpuszczalnika ustawiono na 3,5 minuty. Temperatury urządzenia to 200 °C dla injektora oraz 250 °C.W ustawieniach interfejsu ustaw temperaturę pieca na 80 °C przez jedną minutę, następnie zwiększaj ją w tempie 4 °C na minutę od 80 do 130 °C, po czym zwiększaj w tempie 6 °C na minutę od 130 do 200 °C, a na koniec zwiększaj w tempie 12 °C na minutę od 200 do 285 °C i utrzymuj tę temperaturę przez 10 minut. Umieść mikrowialki zawierające próbki deriv eye do automatycznego wstrzykiwania do GCMS i rozpocznij analizę. Tutaj przedstawiono reprezentatywne widmo próbki moczu analizowanej za pomocą GCMS poy traktowaniu ureazą, z zaznaczonymi pikiemami odpowiadającymi metabolitom: kwasowi pyroglutaminowemu, kwasowi 4-hydroksycyklooctanowemu oraz hawkinsonowi.Metabolity te są charakterystyczne dla anurii Hawkinsa, rzadkiego zaburzenia genetycznego. Wszystkie piki w widmie można przypisać do znanych metabolitów i poddać kwantyfikacji. Wyniki wstępnych testów przesiewowych noworodków mogą być niespecyficzne.Jednakże podwyższony poziom metabolitów Hawkins UR w próbce moczu analizowanej za pomocą GCMS, przedstawiony tutaj, potwierdził diagnozę tej wrodzonej wady metabolizmu. Stosując tę samą metodę URIs, wady wrodzone zdiagnozowano u 184 pacjentów. Prawie 40% diagnoz zaznaczonych na czerwono nie zostałoby postawionych przy użyciu tandemowej spektrometrii mas, powszechnie stosowanej w badaniach przesiewowych noworodków.To była prezentacja tego, jak przeprowadzić jednowypadową metabolomikę z wykorzystaniem metody ureazowej w celu analizy płynów biologicznych pod kątem obecności węglowodanów, kwasów organicznych i aminowych oraz acyloglicyny, a wszystko to w ramach jednej procedury. Należy pamiętać, że podczas oceny efektywności procedury można zweryfikować kompletność trawienia ureazowego, odwodnienia oraz silylowania trimetylnego. Można to zrobić poprzez samo sprawdzenie obecności wszystkich standardów wewnętrznych.Standardy wewnętrzne zostały celowo dobrane, aby wykazać na przykład, że odwodnienie przebiegło całkowicie, ponieważ gdyby tak nie było, kreatynina TRI TMS nie wystąpiłaby w pełnej ilości. To jest zatem nasz dowód. Jeśli są Państwo zainteresowani makrami i bibliotekami, które opracowaliśmy w celu interpretacji tej procedury przy użyciu programu ChemStation, proszę o kontakt e-mailowy pod adresem wyświetlonym na ekranie; więcej informacji o naszym laboratorium można znaleźć pod adresem URL widocznym na ekranie.Bardzo dziękuję. Mówi Jim Shoemaker.

one-step-metabolomics-carbohydrates-organic-amino-acids-quantified

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jednoetapowa metabolomika: Węglowodany, kwasy organiczne i aminokwasy zmierane w jednej procedurze

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Celem tego artykułu jest opisanie protokołu ekstrakcji wodnych metabolitów z hodowanych komórek przylegających do analizy metabolomicznej, w szczególności elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas.

Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.

Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas

Przedstawiono metodę nieukierunkowanej analizy metabolitów i lipidów w ziarnie pszenicy. Protokół obejmuje metodę ekstrakcji metabolitu acetonitrylu oraz metodologię chromatografii cieczowej z odwróconą fazą i spektrometrią mas, z akwizycją w dodatnich i ujemnych trybach jonizacji elektrorozpylanej.

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Skonstruowaliśmy nieukierunkowany przepływ metabolomiczny, który zintegrował XY-Meta i metaX razem. W tym protokole pokazaliśmy, jak używać XY-Meta do generowania wabikowej biblioteki spektralnej na podstawie odniesienia do widm w otwartym dostępie, a następnie przeprowadziliśmy kontrolę FDR i użyliśmy metaX do ilościowego określenia metabolitów po zidentyfikowaniu widm metabolomicznych.

Zintegrowany proces identyfikacji i kwantyfikacji nieukierunkowanego metabolomu opartego na kontroli FDR

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Poznaj jednoetapową metabolomikę węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów metodą GC/MS z urease. Metoda poprawia skrining noworodkowy, wykrywając dodatkowe 38% wrodzonych błędów metabolizmu niewidocznych dla tandemowej spektrometrii mas.

Jednoetapowa metabolomika: ilościowe oznaczanie węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów w ramach jednej procedury

Przeglądaj więcej filmów