JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 5:51 min. • April 30th, 2023
- Zbierz żywe zarodki Drosophila i usuń ich nieprzezroczyste pasmówki. Następnie na szklane szkiełko nakrywkowe nałóż linię kleju heptanowego, który jest klejem taśmowym rozpuszczonym w płynnym heptanie. Aby móc poradzić sobie z zarodkami z odwążówką, ostrożnie ułóż próbki w rzędzie na kleju.
Przenieś szkiełko nakrywkowe do komory odwadniającej, aby częściowo wysuszyć zarodki. Zapobiegnie to wyciekowi cytoplazmatycznemu podczas lub po wstrzyknięciach. Następnie usuń szkiełko nakrywkowe i przykryj zarodki olejem halowęglowym, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu, jednocześnie umożliwiając dyfuzję tlenu do zarodków.
Aby wykonać mikroiniekcję, należy użyć systemu do mikroiniekcji na kompatybilnym mikroskopie. Patrząc przez oczy, zidentyfikuj zarówno zarodki, jak i igłę wstępnie załadowaną roztworem do wstrzykiwań. Otwórz igłę i upewnij się, że wytwarza ona spójne i odpowiedniej wielkości krople płynu. Następnie należy wprowadzić igłę do wnętrza zarodka i wstrzyknąć odpowiednią objętość. Wyjmij igłę i przejdź do następnej, powtarzając wstrzyknięcie dla pozostałych zarodków.
W przykładowym protokole zobaczymy demonstrację mikroiniekcji zarodka Drosophila do badań obrazowych podziału komórek na żywo.
- Przed założeniem szkiełka nakrywkowego wykonaj klej heptanowy, rozwijając podwójnie klejącą taśmę klejącą i umieszczając ją w 100-mililitrowej butelce. Dodaj około 50 mililitrów heptanu, zamknij butelkę i kołysz nią przez kilka dni.
Przed przygotowaniem zarodków należy wykonać komorę odwadniającą, w której zarodki zostaną umieszczone przed wstrzyknięciem. Aby to zrobić, umieść jedną część 35-milimetrowej szalki wewnątrz 100-milimetrowej szalki Petriego, aby zrobić "stół". Dodaj Drierite, który jest bezwodnym siarczanem wapnia, wokół niego, tak aby wysokość Drierite nie była wyższa niż "stół", i przykryj.
Aby rozpocząć przygotowanie zarodków, najpierw zbierz je z klatki dla niosek, zmieniając co godzinę talerz z sokiem winogronowym z drożdżami. Zarodki należy zobrazować około dwóch godzin po rozpoczęciu pobierania. Aby przygotować szkiełko nakrywkowe, umieść je po jednej stronie szkiełka mikroskopowego i przyklej taśmą cztery rogi w dół, aby się nie poruszało.
Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nałóż jedną warstwę kleju heptan w linii na szkiełko nakrywkowe. Klej nie powinien być lepki i powinien wyschnąć w ciągu kilku sekund. Jeśli jest zbyt gęsty, dodaj więcej heptanu.
Na koniec umieść kawałek podwójnie klejącej taśmy na szkiełku obok szkiełka nakrywkowego. Za pomocą zwilżonej szczoteczki ostrożnie podnieś zarodki z talerza z sokiem winogronowym i umieść je na podwójnej taśmie klejącej na szkiełku.
Następnie użyj połowy pęsety, aby przetoczyć zarodki po podwójnie lepkiej taśmie, aż kosmówka pęknie. Podnieś zarodek, delikatnie przetaczając go po kosmówce, tak aby przykleił się do pęsety, i umieść go na kleju heptanowym na szkiełku nakrywkowym tak, aby dłuższy bok zarodka był równoległy do dłuższego boku szkiełka nakrywkowego.
Umieść od 10 do 20 zarodków w jednym rzędzie. Usuń szkiełko nakrywkowe i umieść je w komorze do odwadniania na trzy do ośmiu minut. Czas zależy od lokalnej wilgotności i ilości do wstrzyknięcia. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na metalowej komorze ze smarem próżniowym. Na koniec przykryj zarodki olejem halowęglowym, aby uniknąć dalszego odwodnienia. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia.
Najpierw znajdź zarodki pod obiektywem 16X. Odsuń zarodki i znajdź igłę bez przesuwania płaszczyzny ogniskowej. Wyśrodkuj igłę i przesuń ją w górę, nie przesuwając jej w kierunku X lub Y.
Aby otworzyć igłę, umieść krawędź szkiełka nakrywkowego w polu view, ale nie w miejscu, w którym będzie igła, i opuść igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aż uderzy w igłę i delikatnie ją rozerwie. Przesunąć igłę w górę.
Teraz spójrz na zarodki. Opuść igłę do oleju i upewnij się, że z igły wypływają ładne krople płynu. Równomiernie przesuwaj zarodek do igły, wstrzyknij kroplę do zarodka, a następnie odsuń zarodek. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków są one gotowe do obserwacji pod mikroskopem konfokalnym z obiektywem 60 lub 100X.