JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 3:10 min. • April 30th, 2023
- Zacznij od jaj granulowanych, które zostały odizolowane przez bielenie dorosłych robaków. Upewnij się, że każdy etap tej procedury jest przeprowadzany sterylnie, aby uniknąć zanieczyszczenia hodowanych komórek. Zawieś osad w roztworze chitynazy, enzymu, który rozkłada chitynę - duży polisacharyd, który jest składnikiem strukturalnym skorupki jaja.
Po odpowiednim okresie trawienia delikatnie odwirować jaja i zastąpić supernatant pożywką do hodowli komórkowych, aby zatrzymać trawienie. Następnie przepuść zarodki przez igłę o rozmiarze 18, aby mechanicznie oddzielić poszczególne komórki. Następnie przefiltruj roztwór, aby usunąć zanieczyszczenia ze skorupki jajka lub nieoddzielone grudki komórek. Umieść komórki w naczyniu hodowlanym na szklanym szkiełku pokrytym aglutyniną z orzeszków ziemnych - lektyną, która pomaga komórkom przyczepić się do szkiełka nakrywkowego poprzez wiązanie węglowodanów na powierzchni komórki.
W przykładowym protokole przygotujemy komórki embrionalne do różnicowania i analizy morfologicznej in vitro.
- Podczas pracy pod okapem z przepływem laminarnym, aby uniknąć wprowadzenia zanieczyszczenia bakteryjnego, ponownie zawieś granulowane jaja w jednym mililitrze dwóch miligramów na mililitr chitynazy i przenieś je do świeżej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Kołysz probówką przez 10 do 30 minut w temperaturze pokojowej, w zależności od świeżości enzymu. Gdy około 80% skorupek jaj zostanie strawionych, odwiruj jaja o masie 900 g przez trzy minuty.
Po ostrożnym usunięciu supernatantu dodać trzy mililitry pożywki L15. Przenieś jaja na płytkę o średnicy sześciu centymetrów i rozpocznij ręczną dysocjację za pomocą 10-mililitrowej sterylnej strzykawki z igłą o rozmiarze 18. Aby monitorować stopień dysocjacji, umieść kroplę zawiesiny na świeżej szalce Petriego i obejrzyj pod mikroskopem. Kontynuuj, aż około 80% komórek zostanie zdysocjowanych.
Aby usunąć grudki komórek, niestrawione jaja i wyklute larwy, delikatnie przefiltruj zawiesinę przez filtr o grubości pięciu mikronów i przepuść przez filtr dodatkowe cztery do pięciu mililitrów pożywki L15, aby odzyskać komórki. Aby wyhodować komórki po odwirowaniu filtratu o masie 900 g przez trzy minuty, należy ponownie zawiesić komórki w pełnej pożywce L15. Płytkować jeden mililitr na studzienkę i przechowywać płytki w wilgotnej, szczelnej komorze w temperaturze 20 stopni Celsjusza w otaczającym powietrzu.