C. elegans (C. elegans) Test chemotaksji: metoda testowania chemosensacji u robaków

- Aby zrozumieć napotkane warunki i odpowiednio na nie zareagować, robak C. elegans posiada między innymi wysoko rozwinięty system chemosensoryczny zdolny do wykrywania szerokiej gamy różnych substancji chemicznych.

Neurony czuciowe w głowie, neurony amfidowe i wewnętrzne wargowe neurony, a także neurony w ogonie, neurony phasmid, są bezpośrednio lub pośrednio wystawione przez naskórek na warunki zewnętrzne. Te neurony chemosensoryczne kodują istotne informacje wykorzystywane przez robaka do wywołania odpowiedniej reakcji behawioralnej: zachowania określanego jako chemotaksja.

W celu zbadania reakcji chemotaktycznej na lotne substancje zapachowe lub smakowe sygnały rozpuszczalne w wodzie, należy wyizolować robaki w pożądanym stadium rozwojowym i wystawić je na działanie badanej substancji chemicznej na wcześniej przygotowanym stanowisku doświadczalnym. Po wystawieniu na działanie korzystnych substancji chemicznych, takich jak te wytwarzane przez bakteryjne źródło pożywienia, C. elegans wykazuje dodatnią chemotaksję w stosunku do źródła.

I odwrotnie, pod wpływem mniej korzystnych lub toksycznych substancji chemicznych, takich jak metale ciężkie, robak wykazuje negatywną chemotaksję, unikając substancji chemicznej. W związku z tym mutanty węchowe lub smakowe nie unikają awersyjnych substancji chemicznych i pozostają w niekorzystnych warunkach, w przeciwieństwie do zwierząt typu dzikiego, które unikają stanu awersyjnego.

W przykładowym protokole zobaczymy demonstrację testu chemotaksji, testującego awersję robaka do miedzi.

- Po całonocnej inkubacji wyjmij płytki z inkubatora i używając zaznaczonego spodu płytki jako przewodnika, odpipetuj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 0,5-molowego roztworu dwusiarczanowego miedzi na krawędzi agaru, aby utworzyć zewnętrzną barierę miedzianą. Odpipetować 25 mikrolitrów roztworu dwusiarczanowego miedzi, aby utworzyć barierę w linii środkowej.

Upewnij się, że roztwór siarczanu miedzi nie styka się z plastrem bakteryjnym i pozwól roztworowi miedzi wyschnąć na płytce. Sprawdzaj suchość co pięć minut po przeniesieniu za pomocą tkanki laboratoryjnej, delikatnie wklepując roztwór w pobliżu krawędzi płytki, aby rozróżnić.

Bezpośrednio przed badaniem należy przenieść organizmy doświadczalne na wolną od bakterii płytkę agarową i pozwolić nicieniom swobodnie poruszać się przez jedną minutę w celu usunięcia nadmiaru bakterii.

Następnie odpipetuj 1 mililitr M9 na płytkę z młodymi dorosłymi, którzy zostali przeniesieni 24 godziny wcześniej, w celu umycia robaków do probówki do mikrowirówki. Odwirować nicienie 3000 razy g przez jedną minutę.

Robaki powinny tworzyć granulkę na dnie tuby. Zassać roztwór M9 bez naruszania osadu robaka. Dodaj 1 mililitr roztworu M9 do osadu robaka. Odwróć rurkę, aby wymieszać robaki z roztworem.

Jeśli nadmiar bakterii został początkowo przeniesiony wraz z robakami, powtórz w sumie pięć razy. Po ostatnim przemyciu odessać supernatant do 100 mikrolitrów roztworu M9 i pozostać osad robaka. Natychmiast przenieś robaki z roztworu po zakończeniu etapów mycia.

Odpipetować 20 mikrolitrów osadu robaka z dna probówki na wolną od bakterii połowę płytki testowej. Upewnij się, że 10 robaków zostało przeniesionych na płytkę testową i że nie ma w nim zanieczyszczającej żywności. Żadne bakterie nie powinny być przenoszone na miedziane talerze wyścigowe.

W ciągu jednej minuty usunąć nadmiar roztworu M9 z nicieni za pomocą tkanki laboratoryjnej. Upewnij się, że roztwór M9 nie styka się z roztworem siarczanu dwóch miedzi oraz że robaki i powierzchnia agaru pozostają nienaruszone. Wyrzuć robaki, które zostały przypadkowo usunięte wraz z tkanką laboratoryjną.

Gdy roztwór M9 zostanie usunięty i wszystkie robaki rozpoczną niepłynne wzorce lokomotoryczne, tj. gdy przestaną się młócić, uruchom stoper testowy. Jeśli przypadkowo dołączono dodatkowe robaki, usuń je, zbierając olejem halowęglowym, aby upewnić się, że na płytkę nie zostaną dodane żadne bakterie.

Sprawdzaj płytki testowe co 30 minut. W przypadku płytek testowych z plastrami bakteryjnymi należy pozytywnie ocenić organizmy, jeśli dotarły do plastra z żywnością w ciągu czterech godzin. W przypadku płytek kontroli ujemnej należy ocenić dodatnio organizmy, które przekroczyły barierę.