C. elegans (C. elegans) Śledzenie ruchu: metoda oceny lokomocji u robaków

- Aby ocenić lokomocję u C. elegans, należy użyć kamery do zarejestrowania ruchu robaków na płytce agarowej, zapewniając równomierne oświetlenie płytki podczas rejestracji. Aby ograniczyć ruch robaków po płycie, użyj miedzianych pierścieni. Miedź jest awersyjna dla C. elegans, więc robaki są skupione w pierścieniach.

Umieść kilka miedzianych pierścieni na jednej płytce, aby jednocześnie śledzić robaki w każdym pierścieniu. Pozwala to na przeprowadzanie oceny zwierząt kontrolnych i doświadczalnych w identycznych warunkach, zmniejszając codzienną zmienność i umożliwiając porównania obok siebie. Rejestruj ruchy robaków w określonych odstępach czasu i używaj oprogramowania komputerowego do analizy cech zachowania lokomotywy, takich jak prędkość ruchu i przebyta odległość.

W przykładowym protokole zobaczymy demonstrację testu śledzenia ruchu, testującego wpływ alkoholu na prędkość lokomocji robaka.

- Na początek poświęć dwie minuty lub mniej, aby przenieść 10 robaków z każdej grupy eksperymentalnej do środka miedzianego pierścienia na płycie aklimatyzacyjnej. To jest talerz bez etanolu. Unikaj przenoszenia pokarmu z robakami, ponieważ zmniejszy to ich ruch. Unikaj również uszkadzania powierzchni agaru, ponieważ robaki będą się zakopywać. Nagraj czas ładowania na płytkę i pamiętaj, aby rozłożyć przenoszenie robaków na każdą płytkę o ponad dwie minuty, aby każda płytka mogła być filmowana indywidualnie w odpowiednich odstępach czasu.

Pozostaw każdą płytkę aklimatacyjną na inkubację w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przenieś robaki na płytkę testową, postępując zgodnie z kolejnością stosowaną do umieszczania robaków na płytce aklimatyzacyjnej. Używając cienkiego, spłaszczonego kilofa do robaków bez bakterii, zbierz robaki na wierzchu spłaszczonego kilofa, wykonując ruch nabierania. Następnie uszczelnij płytkę folią laboratoryjną, aby zminimalizować straty etanolu do parowania.

- Szybkość, z jaką zwierzęta są przenoszone na tym etapie, jest bardzo ważna, ponieważ przenoszone zwierzęta będą dłużej narażone na działanie etanolu. Dlatego dobrym pomysłem jest rotacja, które szczepy są umieszczane na płytce jako pierwsze w powtórzeniach eksperymentalnych.

- Do filmowania robaków potrzebny jest teraz mikroskop z kamerą wideo o wysokiej rozdzielczości. Nawet oświetlenie, na przykład z trzycalowego kwadratowego podświetlenia, ma kluczowe znaczenie dla analizy. Następnie, aby zachować kontrast, zobrazuj nośnik płytą stroną do góry.

Przygotuj oprogramowanie do analizy obrazu, aby rejestrować 120-klatkowe, 12-bitowe, poklatkowe filmy w skali szarości w jednej klatce na sekundę. Aby zmniejszyć rozmiar pliku wyjściowego przy jednoczesnym zachowaniu wystarczającej rozdzielczości obrazu, należy użyć trybu łączenia w grupy dwa na dwa.

Teraz nagraj dwuminutowe filmy z każdej płyty, 10 minut po tym, jak ostatnie robaki zostały umieszczone na tej płycie. Następnie wykonaj drugie dwuminutowe nagranie, 30 minut po umieszczeniu robaków na talerzu. Do tej demonstracji używane jest oprogramowanie Image-Pro Plus, ponieważ do tej techniki można dostosować wiele innych programów. Analizuj filmy jako dwuminutowe segmenty.

Najpierw zastosuj filtr do obrazów, który spłaszcza tło i zwiększa kontrast obiektów robaków. W menu wybierz Proces, następnie Filtry, następnie Ulepszenie, a następnie Spłaszcz. Ustaw parametr dla ciemnego tła i szerokości funkcji 20 pikseli.

Teraz przeanalizuj lokomocję zwierząt w każdym pierścieniu osobno z okrągłym obszarem zainteresowania, który nakłada się na miedziany pierścień. Zidentyfikuj i śledź robaki za pomocą polecenia Śledź obiekty w podmenu Miara.

W oknie Tabela danych śledzenia użyj przycisku Opcje śledzenia, aby zezwolić na wykluczenie określonych ścieżek i ograniczyć wszelkie artefakty eksperymentalne. Na karcie Automatyczne śledzenie ustaw parametry ścieżki na limit prędkości 400 mikronów na klatkę. Ustaw limit przyspieszenia na Automatyczny.

Ustaw minimalną całkowitą długość ścieżki na 400 mikronów, a w polu Dominujący typ ruchu ustaw wartość Chaotyczny. Następnie w parametrze Ścieżka ustaw obiekty tak, aby ścieżki częściowe miały minimalną długość 21 klatek i głębokość projekcji śledzenia wynoszącą jedną klatkę.

Teraz, aby rozpocząć proces śledzenia, najpierw kliknij przycisk funkcyjny Znajdź wszystkie utwory automatycznie. Spowoduje to wyświetlenie okien dialogowych Opcje liczby/rozmiaru i Okno dialogowe Śledzenie. Wybierz opcję Ręcznie dla opcji Wybór zakresu intensywności w oknie dialogowym Liczba/Rozmiar. Jest to ważny krok progowy. Następnie dostosowuje suwaki Próg intensywności, aby utworzyć zakres inkluzywny, który uwydatnia ciemne obiekty. Dobrym punktem wyjścia na skali jest zakres od 0 do 1,500.

Teraz zastosuj filtr rozmiaru, aby wykluczyć obiekty, które są większe lub mniejsze niż pojedynczy robak. Przejdź do menu Miara, a następnie wybierz podmenu Pomiar. Spowoduje to otwarcie okna dialogowego Opcje liczby/rozmiaru. Tam ustaw zakres obszaru na 28 000 do 120 000 mikronów kwadratowych. I ustaw zakres obwodu na 600 do 2,500 mikronów. Dostosuj te parametry w przypadku korzystania z robaków o nietypowych rozmiarach.

Teraz zakończ proces śledzenia, klikając przycisk Kontynuuj w oknie dialogowym śledzenia. Dokładnie sprawdź, czy wyjście jest odtwarzane razem z materiałem filmowym. Upewnij się, że każdy robak jest reprezentowany, chyba że istnieje wyraźny powód, aby go przefiltrować. Następnie ręcznie usuń ścieżki utworzone przez obiekty inne niż robaki.

Następnie oblicz prędkość każdego robaka, uśredniając odległość przebytą między każdą klatką lub każdą sekundą, i utwórz średnią prędkość dla śladów w każdej populacji. Proszę potraktować tę średnią końcową jako jeden punkt próbki do analizy statystycznej eksperymentu.